专利摘要

专利摘要

本发明涉及一种利用ARTP诱变技术选育的藤仓赤霉突变株——水稻恶苗病菌GA‑347(FusariumfujikuroiGA‑347)及其应用，本发明的菌株命能大规模应用于工业化生产。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCCNO：M2019378，保藏日期2019年5月20日。本发明菌株生长过程中不产生分生孢子，接种到液体种子培养基中，待细胞长成熟后，转接到发酵培养基中，发酵水平大幅度提高，赤霉素产率达到野生菌的22倍，为国际领先。赤霉素在胞外分泌，可直接从发酵液汇总获取，有利于固液分离，提取收率升高。同时，提高了设备和原料的利用率，大大降低了生产成本，具有显著的经济效益与社会效益。

权利要求

1.一株藤仓赤霉菌（Fusariumfujikuroi）GA-347，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019378，保藏日期2019年5月20日。

2.权利要求1所述的藤仓赤霉菌 GA-347在微生物发酵制备赤霉素GA3中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述藤仓赤霉菌 GA-347接种至发酵培养基，25~30℃、200~300rpm条件下发酵培养12~48h，获得含赤霉素GA3的发酵液，发酵液经分离纯化获得赤霉素GA3。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：玉米淀粉60~90g/L，米粉70~100g/L，大豆粉3~7 g/L，花生粉3~7 g/L，K2SO4 0.3~0.7 g/L，KH2PO4 0.3~0.7g/L，溶剂为水，pH自然，121度灭菌30 min。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述藤仓赤霉菌 GA-347先接种至斜面培养基，活化后的菌株接种至种子培养基经种子培养获得种子液再接种至发酵培养基，所述斜面培养基组成如下：土豆150~200 g/L、蔗糖10~30 g/L、硫酸镁0.1~0.3 g/L、碳酸钙0.1~0.3 g/L、琼脂20 g/L，pH自然，115℃灭菌30 min；所述种子培养基组成如下：玉米淀粉10~30 g/L、蔗糖10 ~30g/L、花生粉10 ~30g/L、大豆粉10 ~30g/L、磷酸二氢钾0.5~1.5 g/L、硫酸镁0.5~1.5 g/L，pH自然，121℃灭菌30 min。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株利用ARTP诱变技术选育的藤仓赤霉菌突变株，及其应用。

(二)背景技术

赤霉素作为一类天然的植物生长调节剂，对植物生长具有多种生物功能，可以调节植物生根、发芽和结果等过程，能够刺激水稻、棉花和麻类等作物的生长发育。因此被广泛使用于杂交水稻制种、柑桔保果、棉花保铃、蔬菜及幼林的生长，对于促进农业生产，特别是粮食生产有很大的经济效益及社会效益。在啤酒工业上，它能加速大麦的萌发，使麦芽发芽整齐均匀，同时能提高淀粉菌和淀粉酶及某些蛋白酶活性，从而提高了麦芽质量。赤霉素的主要活性物质有GA₃、GA₄、GA₇，和GA₉等，其中GA₃是使用最多的赤霉素成品。1999年，国际市场的需求量在250吨以上，价值约10亿美元；我国2000年注册的生产企业有23家，年产量在150吨左右，产值约有10亿元并有大量的出口。此外，GA₄和GA₇混合物的使用面积也在不断的扩大。

赤霉素GA₃是一种二萜类酸，分子式C₁₉H₂₂O₆，分子量346.37，熔点233-235℃，易溶于醇类、丙酮、乙酸乙酯、碳酸氢钠溶液及pH为6.2的磷酸缓冲液，难溶于水和乙醚。

等离子体是与物质的固态、液态和气态并存的物质第四态，是一种正离子和电子密度大致相等的电离气态，具有导电、发光、化学性质活泼等特点。目前裸露金属电极结构的大气压射频辉光放电等离子体是一种新的离子体源。主要应用于消毒和灭菌。基于该离子体的原理无锡源清天木生物科技有限公司开发了常压室温等离子体(ARTP)，其特点射流温度低、放电均匀、有丰富的化学粒子可引起遗传物质突变。

1970年来我国筛选到高产赤霉素变种“4303”，不过该菌无产孢子能力，且为多核菌丝，使继续选育十分困难。目前的生产效价呈现出徘徊不前的状态，而且有的生产菌种出现退化。赤霉菌经过长期物理化学诱变产量发生滞留，化学诱变具有环境污染，操作危险等缺点，如亚硝基胍作为微生物育种诱变剂具有易燃、有毒、有致癌可能性、有刺激性等特点，在实验中操作危险，而长期使用同种诱变剂会对让生物产生耐受性。物理诱变剂具有环保、污染小等也点，如紫外诱变被广泛应用但诱变后的菌株遗传稳定性差。因此，需要新的诱变手段来提高菌株产量和遗传稳定性。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用ARTP诱变技术选育的藤仓赤霉突变株及其应用，本发明的菌株命名为GA-347，其能大规模应用于工业化生产。

本发明采用的技术方案是：

一株利用ARTP诱变技术选育的藤仓赤霉菌突变株——水稻恶苗病菌GA-347(Fusarium fujikuroi GA-347)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019378，保藏日期2019年5月20日。

本发明菌株的获得过程如下：

1、制备原生质体，具体方法参照朱廷恒等赤霉菌原生质体外源基因高效转化方法研究(浙江工业大学学报，2013，41(5)，482-485)

2、ARTP诱变得到水稻恶苗病菌GA-347。

本发明提供通过制备藤仓赤霉菌原生质体，经过ARTP诱变，经过3000个突变株筛选后获得高产GA₃菌株。该方法为离子诱变，对于菌株经过多次物理化学诱变后产生的耐受性有明显的改善，为工业生产提供了经济效益。

所述水稻恶苗病菌GA-347的18s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及所述的水稻恶苗病菌GA-347在微生物发酵制备赤霉素中的应用。

具体的，所述水稻恶苗病菌GA-347用于微生物发酵制备赤霉素GA₃。

具体的，所述应用为：将所述水稻恶苗病菌GA-347接种至发酵培养基，25～30℃(优选28℃)、200～300rpm(优选250rpm)条件下发酵培养12～48h，获得含赤霉素GA₃的发酵液，发酵液经分离纯化获得赤霉素GA₃。

所述发酵培养基组成如下：玉米淀粉60～90g/L，米粉70～100g/L，大豆粉3～7g/L，花生粉3～7g/L，K₂SO₄ 0.3～0.7g/L，KH₂PO₄ 0.3～0.7g/L，溶剂为水，pH自然，121度灭菌30min。

通常，所述水稻恶苗病菌GA-347先接种至斜面培养基(25～30℃培养4～7天)，活化后的菌株接种至种子培养基经种子培养(25～30℃、250rpm培养过夜)获得种子液再接种至发酵培养基，所述斜面培养基组成如下：土豆150～200g/L、蔗糖10～30g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、碳酸钙0.1～0.3g/L、琼脂20g/L，pH自然，115℃灭菌30min；所述种子培养基组成如下：玉米淀粉10～30g/L、蔗糖10～30g/L、花生粉10～30g/L、大豆粉10～30g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L，pH自然，121℃灭菌30min。

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明提供一株高产赤霉素的藤仓赤霉菌突变株，该菌株生长过程中不产生分生孢子。

2、本发明提供一种赤霉素GA₃的发酵方法，该方法采用可产生赤霉素GA₃，本发明菌株接种到液体种子培养基中，待细胞长成熟后，转接到发酵培养基中，发酵水平大幅度提高，赤霉素产率达到野生菌的22倍，为国际领先。赤霉素在胞外分泌，可直接从发酵液汇总获取，有利于固液分离，提取收率升高。同时，提高了设备和原料的利用率，大大降低了生产成本，具有显著的经济效益与社会效益。

(四)附图说明

图1为GA-347菌株18S rDNA序列PCR扩增argrose电泳图。

图2为GA-347菌株的系统发育树。

图3为电镜观察下的菌丝体形态。

图4为发酵液中GA₃含量变化。

图5为发酵液中pH变化。

图6为GA-347发酵干重变化。

图7为GA₃高效液相色谱(HPLC)检测标准曲线。

图8为不同发酵温度对菌株GA-347菌丝干重的影响。

图9为ARTP和紫外诱变对GA-347遗传稳定性的影响。

图10为ARTP和紫外诱变对菌株菌丝干重的影响。

图11为ARTP和紫外诱变对菌株pH的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：野生藤仓赤霉菌原生质体制备

(1)斜面的制备：将野生藤仓赤霉菌菌株(实验室保藏)接种至斜面培养基中，28℃培养3～7天，待气生菌丝长满斜面可转接至种子液。

(2)种子液的制备：

挑取步骤(1)中的一小块菌接种至种子培养基中，28℃，250rpm培养48h，获得种子液。种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20g/L、蔗糖20g/L、花生粉20g/L、大豆粉20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L，溶剂为自来水，pH自然，121℃灭菌30min。

(3)发酵培养

250mL规格摇瓶装样40mL发酵培养基，发酵时按体积浓度1-4％接种种子液，28℃，250rpm发酵培养168h。发酵培养基组成：玉米淀粉80g/L，米粉80g/L，大豆粉5g/L，花生粉5g/L，K₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌30min。

(4)原生质体制备

从斜面接种一小菌块至YEPD液体培养基(酵母提取物0.3％、蛋白胨1％、葡萄糖2％)中，28℃、180rpm培养48个小时。取2ml菌液加入无菌Eppendorf管中，先后用无菌水、1MMgSO₄各洗涤一次。用灭菌枪头蘸取少量菌丝至已过滤除菌的1.5mL破壁缓冲液(1M MgSO₄、总酶浓度为15mg/mL，其中Dryslase：Yatalase＝3:7)中，吹打均匀，置于30℃水浴摇床中反应45分钟(原生质体产生率在95％以上)。5000rpm离心10分钟，转移上清0.75mL至另一离心管，加入等量的无菌水，混合均匀，6000rpm离心5分钟，弃上清。用1mL 1M山梨醇将上述细胞沉淀充分悬浮，原生质体制备成功。经过镜检，可稀释适当倍数涂板于MYG培养基(麦芽糖0.5％，葡萄糖1％，酵母粉0.5％，蔗糖5M，琼脂2％)进行原生质体复苏。对照用无菌水悬浮并稀释、涂板。通过血球计数板计数，测出单位体积内所含有的原生质体数。并将原生质体溶液稀释至10⁶-10⁷个/mL。

实施例2：高产GA₃突变株的筛选

(1)将野生型藤仓赤霉菌接种至斜面培养基，28℃培养3-7天，从斜面接种一小菌块至YEPD液体培养基(酵母提取物0.3％、蛋白胨1％、葡萄糖2％)，用无菌水和盐缓冲液洗涤一次，取少量菌丝加入破壁缓冲液，置于30℃水浴摇床中反应45分钟，3000rpm离心10min，弃上清用无菌水洗一次后加入缓冲液悬浮。

(2)ARTP诱变方法：将步骤(1)活化的菌株涂布于MYG固体培养基(麦芽糖0.5％、酵母粉0.5％、葡萄糖1％、蔗糖5M、琼脂2％)，28℃培养3-7天至长出菌落，通过步骤(1)制备原生质体，控制菌数约为10⁷个/mL。

ARTP仪器使用前需要将减压阀高压输入端连接至气瓶出口，低压输出端通过器官连接至仪器进气口，检查气密性，启动冷缺水循环机降温，开启操作室消毒程序，消毒后打开操作室门将手动旋转样品载台拉出，用镊子将待处理样品载片放置到手动旋转样品载台上方圆形凹槽内，载台恢复原位后卡紧，关闭操作室门，设置功率120W，气流10SLM，选取0s、10s、20s、30s、40s为梯度时间，依次诱变。电击开始按钮开始处理样品，到达指定时间后，射频电源关闭后打开操作室将载片放入盛有1mL无菌生理盐水的EP管内并拧好盖子做好标记。稀释涂布每个梯度3个培养皿。

表1：ARTP诱变方法诱变过程

对于每轮诱变获得的高产菌株，重新作为初始菌株按照上述方法进行诱变。最终筛选获得GA₃产量达2～4g/L的突变株GA-347，命名为水稻恶苗病菌GA-347(Fusariumfujikuroi GA-347)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2019年5月20日，保藏编号CCTCCNO：M 2019378，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。

本发明包含但不仅限于上述一种诱变方式。

其中MYG固体培养基的配制：麦芽糖0.5％、酵母粉0.5％、葡萄糖1％、蔗糖5M、琼脂2％，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌20min。

YEPD培养基的配制：酵母提取物0.3％、蛋白胨1％、葡萄糖2％，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌20min。

实施例3：18S rDNA分子鉴定

(1)DNA提取：取菌丝离心，取少量放入1.5mL EP管中，加入978μL sodiumphosphate buffer，悬浮菌体；将菌悬液转移至Lysing Matrix E Tube中，加入112μL MTBuffer混匀；使用MP -24均质破碎仪破碎细胞，速度设定为6.0，时间设定为40s；12000rpm离心Lysing Matrix E Tube 10min，去除样品碎屑；将上清液转移至新的EP管中，加入250μL PPS试剂，手持离心管晃动10次以混匀，12000rpm离心5min；将上清转移至10mL干净离心管中，加入1mL Binding Matrix suspension，将离心管上下颠倒2min，静置3min，使DNA附着于Binding Matrix上，并等待二氧化硅基质沉淀；小心移除500μL上清(避免吸出沉淀)，将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600μL混合液移入SPIN Filter中，12000rpm离心1min，弃滤液，再将剩余液体都转移至SPIN Filter，离心弃滤液；加500μLSEWS-M溶液，12000rpm离心1min弃滤液，再将SPIN Filter离心2min，将SPIN Filter转移至新的catch tube，敞开室温干燥5min；加入50μL DES溶液，室温静置1min，并12000rpm离心1min，catch tube中的滤液即为所提取的菌种的基因组。

(2)真菌18S rDNA的PCR扩增和序列分析：真菌核糖体ITS rDNA通用引物

所用引物如下：

表2

其中克隆PCR体系：加入10×Taq Buffer(Mg+)5μL，加入10mM dNTPs 1μL，Taq DNAPolymerase 0.5μL，ITS1和ITS4引物各0.5μL，模板1.5μL，补足去离子水至50μL。

其中克隆PCR程序：95℃变性45s，55-60℃退火30s，72℃延伸45min，共35个循环。最后72℃延伸30s。

(3)取5μL PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳实验，用凝胶成像仪观察分析。若条带清晰且大小无误(500bp左右)，则对PCR产物进行凝胶回收。回收产物再各取5μL进行琼脂糖凝胶电泳验证(图1)，若条带清晰且大小无误，则回收样品可用于测序。测序由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成，测序引物与PCR引物相同。使用NCBI blast数据库进行序列比对。

测序由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成，结果如下：

系统发育树的构建：将GA-347菌株的18S rDNA序列与NCBI数据库中核酸序列进行Blast分析，调出与该序列相关性较高的核酸序列，经MEGA5软件Align by clustalw自动分析，然后用MEGA5软件按1000次重复产生系统发育树(参见图2)。结果显示GA-347菌株与Fusariumfujikuroi AB725604同源性为99％，在进化树的同一个分支上，支持率为99％。

实施例4：生理生化鉴定

利用Biolog(FF)自动鉴定系统测定碳源利用情况。由于试验菌株的形态特征和培养特征类似于真菌，所以本试验使用FF鉴定微平板对试验菌株的碳源利用情况进行测定。

1、原生质体制备：

(1)从斜面接种一小菌块至YEPD液体培养基中，28℃、180rpm培养48个小时。

(2)取2ml菌液加入无菌Eppendorf管中，先后用无菌水、1M MgSO₄各洗涤一次。用灭菌枪头蘸取少量菌丝至已过滤除菌的1.5mL破壁缓冲液中，吹打均匀，置于30℃水浴摇床中反应45分钟。5000rpm离心10分钟，转移上清0.75mL至另一离心管，加入等量的无菌水，混合均匀，6000rpm离心5分钟，弃上清。用1mL 1M山梨醇将上述细胞沉淀充分悬浮。

2、FF微平板接种：

(1)将制备好的菌悬液倒入加样槽中，使用八道电动移液器，将其接种于微平板96孔中；

(2)使用FF鉴定微平板，接种量为100μL/孔。

3、FF微平板培养：

接种丝状真菌的FF鉴定微平板在26微，空气中培养至24h、48h、72h、96h、168h和240h，培养环境不宜过湿。

4、FF微平板读数及结果保存：

(1)打开“MicroLog”应用程序，输入用户名和密码，点击“OK”进入主界面；

(2)先进入“Setup”界面，点击“initialize reader”，进行初始化设置，等到界面上红色的“ComNot Open”键变成绿色的“Ready”时，点击“Read”；

(3)进入“Read”界面后，选择阅读器模式—Reader，如采用人工读数，进入手动模式(Manual)；在“Data File Name”后输入数据保存名称和保存地址；点击“Read NewPlate”选择微平板类型和培养时间，在“Strain type”下拉菜单中选择丝状真菌类型；

(4)将微平板放人读数仪托架上，合上读数仪盖子，准备读数；

(5)按“Read Next”键开始读数。

(6)以PDF格式保存结果。

利用Biolog自动微生物鉴定系统考察菌株对95种碳源的代谢情况：将菌株接种于PDA平板培养基，28℃恒温培养5d，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(FF-IF)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至75％T/FF(参考值：75％±3％)。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog FF微孔鉴定板的各孔中，每孔100μl。将微孔鉴定板放在28℃培养箱中，分别在培养24h、48h、72h、96h、168h和240h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。综合考虑Biolog读数仪读取的各时间点数据，给出24h鉴定结果。

将野生菌种按照上述方法进行生理生化鉴定，利用Biolog自动微生物鉴定系统考察菌株对95种碳源的代谢情况，综合考虑Biolog读数仪读取的各时间点数据，给出24h鉴定结果，见表3。

表3：菌株GA-347对Biolog FF板上95种碳源的利用能力

Notes:+,positive；-,negative；B,borderline

实施例5：高产GA₃菌株电镜观察

(1)菌种培养：用接种环挑取斜面保藏菌种液，PDA平板划线，28℃培养5d，挑取长好的菌种块接入种子培养基，250rpm，28℃培养2d，待处理。

(2)菌体处理：(a)取1mL菌丝种子液分装在2.5％戊二醛中，4℃冰箱过夜放置。(b)第二天将过夜的菌体4000-5000rpm离心2min。(c)加磷酸缓冲液每隔15min后吸出缓冲液，尽量不要吸出菌体，缓冲液量随意，重复三次。(d)加锇酸，静置1.5h。(e)重复步骤b。(f)加30％、50％、70％、80％、90％、95％的乙醇，每隔15min吸出乙醇。(g)加入无水乙醇，保存，SEM观察。

将土豆平板(PDA)上28℃培养5d的GA-347菌株按所述方法处理，进行SEM扫描电镜分析，结果如图3。采用型号为SU-8010SEM扫描电镜，图中的放大倍数为1000倍，在扫描电镜下观察菌株的形态特征为整体菌丝光滑，密集，纵横交错，局部有节状结构。

实施例6：突变菌GA-347发酵产GA₃

(1)斜面的制备：将实施例1制备的高产赤霉素的藤仓赤霉菌突变株接种至斜面培养基中，28℃培养3-7天，待气生菌丝长满斜面可转接至种子液。

(2)种子液的制备：

挑取步骤(1)中的一小块菌接种至种子培养基中，28℃，250rpm培养48h，获得种子液。

种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20g/L、蔗糖20g/L、花生粉20g/L、大豆粉20g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L，溶剂为水，pH自然，121℃灭菌30min。

(3)发酵培养

250mL规格摇瓶装样40mL发酵培养基，发酵时按体积浓度1～4％接种种子液，28℃，250rpm发酵培养168h。发酵过程中，其发酵液中GA₃含量变化如图4，发酵液中pH变化如图5；突变菌干重变化如图6。

发酵培养基组成：玉米淀粉80g/L，米粉80g/L，大豆粉6g/L，花生粉5g/L，K₂SO₄0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌30min。

上述突变菌通过摇瓶发酵生产，按照实施例7方法检测，所得发酵液中GA₃含量为2235mg/L。

实施例7：GA₃的HPLC检测方法

取实施例6方法制备的发酵液，按发酵液离心，12000rpm离心5min，取上清用0.45μm有机滤膜过膜后通过高效液相色谱(HPLC)检测。

检测方法：色谱柱为C18柱(150×4.6mm)，柱温32℃，流速0.6mL/min，进样量20μL，色谱保留时间30min，检测波长为210nm。GA₃的出峰时间为14min。

其中流动相配制方法：0.5mL磷酸用水稀释到1L，取该溶液600mL与400mL甲醇混合；

GA₃产量计算方法：从BBI Life Sciences公司购买GA₃的标准品，用甲醇配制不同浓度(0mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L)的GA₃标准溶液，分别将上述标准液用HPLC检测出峰面积，根据峰面积和GA₃标准溶液的浓度计算出标准曲线为Y＝983.5X–9.6508，R2＝0.996(其中Y为GA₃的浓度，X为峰面积)。将未知浓度的GA₃样品通过HPLC检测可以得到一个峰面积，带入上述标准曲线公式得出浓度，标准曲线结果如图7所示。

实施例8：温度对菌丝干重的变化

将实施例5中发酵温度分别改为25℃、28℃、30℃、32℃、37℃，其它操作同实施例6，从发酵摇瓶中以24小时的间隔获得样品，用于分析细胞质量(干细胞重量[DCW])。结果如图8，DCW主要操作方法是以1mL初始发酵培养基为对照，另取1mL发酵样品，以12000rpm离心5分钟，用1mL超纯水洗涤两次，将菌丝体沉淀重新悬浮并通过12000rpm离心5分钟。最后，将包含洗过的菌丝体沉淀物的管在80℃下干燥至恒重，取发酵样品与对照的干重差值计为菌丝干重，结果如图7所示。发酵温度在28℃最佳，于120小时达到最高菌丝干重约36g/L。当温度37℃时，菌丝干重最低，不利于生长。

实施例9：不同诱变方式对菌株遗传稳定性的影响

对ARTP和紫外诱变的高产菌株进行传代对比，对10代GA₃产量进行检测，结果如图9所示，ARTP诱变的高产菌株GA-347有更好的遗传稳定性。

实施例10：不同诱变方式对菌株菌丝干重的影响

按照实施例8中的方法测定紫外诱变高产GA₃菌株和GA-347的菌丝干重，其它操作同实施例6，结果如图10所示，在发酵过程的168个小时中，两种菌株的菌丝干重曲线在120小时前呈上升趋势且GA-347菌丝干重高于紫外诱变菌株，突变菌GA-347的菌丝在72小时前快速积累，处于增长期，72小时则开始放慢生长到达稳定期，120小时到达最大值，120小时后开始下降，菌丝开始部分降解，菌体处于衰亡期。

实施例11：不同诱变方式对菌株pH的影响

在发酵过程中，pH呈现出下降趋势，发酵过程中不断形成酸性的发酵产物导致pH下降。发酵培养基初始pH一致，发酵过程中突变株GA-347的pH曲线整体高于UV突变菌。结合图10，120小时后菌丝干重下降，突变菌株GA-347pH在4以下不利于菌体生长。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一株利用ARTP诱变技术选育的藤仓赤霉菌突变株及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 584

<212> DNA

<213> Fusarium fujikuroi

<400> 1

gggaagtaaa aggtcgtaac aaggtctccg ttggtgaacc agcggaggga tcattaccga 60

gtttacaact cccaaacccc tgtgaacata ccaattgttg cctcggcgga tcagcccgct 120

cccggtaaaa cgggacggcc cgccagagga cccctaaact ctgtttctat atgtaacttc 180

tgagtaaaac cataaataaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga 240

tgaagaacgc agcaaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa 300

tctttgaacg cacattgcgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgttc gagcgtcatt 360

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cccgaaatct agtggcggtc tcgctgcagc ttccattgcg tagtagtaaa accctcgcaa 480

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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一株利用ARTP诱变技术选育的藤仓赤霉菌突变株及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。