专利摘要

专利摘要

本发明公开了产头孢菌素G的重组菌及其构建方法与应用。本发明的产头孢菌素G的重组菌的构建方法，包括将扩环酶基因导入受体菌得到产头孢菌素G的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。实验证明，本发明所制备的产头孢菌素G的重组菌的头孢菌素G的产量为2.67mM-29.01mM即(0.89-9.64g/L)。

权利要求

1.产头孢菌素G的重组菌的构建方法，包括将扩环酶基因导入受体菌得到产头孢菌素G的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述突变型大肠杆菌为下述A1至A8中的任一种：

A1、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述a1-a4的改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

a1、将α－酮戊二酸脱氢酶基因敲除；

a2、将异柠檬酸裂合酶基因敲除；

a3、将β－内酰胺酶基因敲除；

a4、用乙酰辅酶A合成酶基因替换丙酮酸氧化酶基因；

A2、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a3和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A3、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A4、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a2和所述a3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A5、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A6、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a2和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A7、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A8、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述扩环酶基因编码b1和b2的蛋白质：

b1、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶活性的由b1）衍生的蛋白质。

4.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述α－酮戊二酸脱氢酶基因编码c1和c2的蛋白质：

c1、由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2、在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有α－酮戊二酸脱氢酶活性的由c1）衍生的蛋白质；

所述乙酰辅酶A合成酶基因编码d1和d2的蛋白质：

d1、由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

d2、在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由d1）衍生的蛋白质；

所述丙酮酸氧化酶基因编码e1和e2的蛋白质：

e1、由SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

e2、在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由e1）衍生的蛋白质；

所述异柠檬酸裂合酶基因编码f1和f2的蛋白质：

f1、由SEQ ID No.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

f2、在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有异柠檬酸裂合酶活性的由f1）衍生的蛋白质；

所述β－内酰胺酶基因编码g1和g2的蛋白质：

g1、由SEQ ID No.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

g2、在SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有β－内酰胺酶活性的由g1）衍生的蛋白质。

5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述扩环酶基因为b11-b13中的任一种DNA分子：

b11）其编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或基因组DNA；

b12）在严格条件下与b11）或b12）限定的DNA分子杂交且编码所述扩环酶的cDNA分子或基因组DNA；

b13）与b11）或b12）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述扩环酶的cDNA分子或基因组DNA；

所述乙酰辅酶A合成酶基因为d11-d13中的任一种DNA分子：

d11）其编码序列是SEQ ID No.4的cDNA分子或基因组DNA；

d12）在严格条件下与d11）或d12）限定的DNA分子杂交且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分子或基因组DNA；

d13）与d11）或d12）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分子或基因组DNA。

6.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述扩环酶基因通过含有扩环酶基因表达盒的重组表达载体导入所述受体菌中，所述扩环酶基因表达盒中，启动所述扩环酶基因转录的启动子是pBAD启动子；

所述用乙酰辅酶A合成酶基因替换丙酮酸氧化酶基因中，所述乙酰辅酶A合成酶基因含有SEQ ID No.4的第62-195位所示的启动子FumA，所述启动子FumA位于所述乙酰辅酶A合成酶基因的编码序列上游。

7.根据权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌K12。

8.由权利要求1至7中任一所述的方法构建的产头孢菌素G的重组菌。

9.权利要求8所述的产头孢菌素G的重组菌在制备头孢菌素G或7－氨基去乙酰氧基头孢烷酸中的应用。

10.制备头孢菌素G的方法，包括将权利要求8所述的产头孢菌素G的重组菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化青霉素G进行催化反应得到头孢菌素G。

说明书

技术领域

本发明涉及产头孢菌素G的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

7－氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-Amino-3-Desacetoxy Cephalosporanic Acid，7-ADCA）是头孢菌素的母核，是制备头孢氨苄、头孢拉定和头孢羟氨苄等头孢类抗生素的重要中间体之一。7-ADCA的工业合成方法主要包括两个步骤：（1）青霉素G化学扩环生成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸，又称苯乙酰-7-ADCA或头孢菌素G（phenylacetyl-7-ADCA，G-7-ADCA，DAOG)；（2）G-7-ADCA经青霉素G酰化酶催化脱去侧链得到7-ADCA。对脱去侧链的步骤已经有充分的研究，而扩环反应成为合成工艺中的重要研究方向。通过化学法进行扩环反应存在复杂、成本高，且副产品和有机溶剂对环境不利等缺点，因此，急需使用一种对环境友好的方法来代替化学扩环法。扩环酶(Expandase)又叫脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶(Deacetoxycephalosporin C Synthetase,DAOCS)催化青霉素的五员噻唑环氧化扩环形成头孢菌素的六员噻嗪环,是头孢菌素生物合成的关键酶。来自顶头孢（C.acremonium）、棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）、耐内酰胺诺卡氏菌（Nocardia Lactamdurans）的DAOCS已经被克隆表达和表征。但DAOCS的天然底物是青霉素N，难以大量获得，此外即使青霉素N扩环成功，其侧链也很难用酰化酶切除。因此，人们以廉价的青霉素G为原料开展了向头孢菌素转化的研究。通过对DAOCS进行了随机和定向突变，希望其能够转化低廉且易获得的原料青霉素G，实现头孢菌素C的大规模生产，虽然酶的改造取得了很大的进展，但酶法制备头孢菌素发展缓慢。主要是由于在DAOCS在体外不稳定，转化效率低，且反应需要α-酮戊二酸作为辅因子，导致酶法制备头孢菌素的成本较高。

全细胞生物转化是一种高效、绿色的生物转化过程，已成功运用在多种产品的工业化生产上。全细胞催化通过细胞壁的保护使酶更加稳定，并且可以利用细胞内的辅因子，从而降低催化剂的成本，提高生物催化的效率。Arnold L.Demian研究组用棒状链霉菌或变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）进行生产G-7-ADCA，但产量最高为0.2g/L。（Demain AL,Báez-Vásquez MA.2000.Immobilized Streptomyces clavuligerus NP1cells for biotransformation of penicillin G into deacetoxycephalosporin G.Applied biochemistry and biotechnology87:135-40；Gao Q,Piret J,Adrio J,Demain A.2003.Performance of a recombinant strain of Streptomyces lividans for bioconversion of penicillin G to deacetoxycephalosporin G.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology30:190-4）。随着我国青霉素的发酵技术水平的提高，生产成本不断降低，青霉素的生产能力不断增大，除了出口和国内临床使用外，尚有较多余量，因此以廉价青霉素为原料开发头孢菌素类抗生素是值得重视的途径。特别是全细胞催化法青霉素G产G-7-ADCA值得深入研究。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供头孢菌素G（G-7-ADCA）产量高的产头孢菌素G（G-7-ADCA）的重组菌及其构建方法。

本发明所提供的产头孢菌素G的重组菌的构建方法，包括将扩环酶基因导入受体菌得到产头孢菌素G的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。

上述方法中，所述突变型大肠杆菌为下述A1至A8中的任一种：

A1、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述a1-a4的改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG22）；

a1、将α－酮戊二酸脱氢酶基因敲除，该改造以“△sucA”表示；

a2、将异柠檬酸裂合酶基因敲除，该改造以“△aceA”表示；

a3、将β－内酰胺酶基因敲除，该改造以“△ampC”表示；

a4、用乙酰辅酶A合成酶基因（acs）替换丙酮酸氧化酶基因（poxB），该改造以“△poxB::acs”表示；

A2、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a3和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG15）；

A3、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG14）；

A4、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a2和所述a3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG20）；

A5、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG03）；

A6、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1、所述a2和所述a4改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG05）；

A7、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG01）；

A8、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1和所述a2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG16）。

上述敲除和替换均可通过同源重组实现。

上述方法中，所述扩环酶基因可编码b1和b2的蛋白质：

b1、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶活性的由b1）衍生的蛋白质。

上述方法中，所述α－酮戊二酸脱氢酶基因（sucA）可编码c1和c2的蛋白质：

c1、由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2、在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有α－酮戊二酸脱氢酶活性的由c1）衍生的蛋白质；

所述乙酰辅酶A合成酶基因（acs）可编码d1和d2的蛋白质：

d1、由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

d2、在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由d1）衍生的蛋白质；

所述丙酮酸氧化酶基因（poxB）可编码e1和e2的蛋白质：

e1、由SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

e2、在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由e1）衍生的蛋白质；

所述异柠檬酸裂合酶基因（aceA）可编码f1和f2的蛋白质：

f1、由SEQ ID No.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

f2、在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有异柠檬酸裂合酶活性的由f1）衍生的蛋白质；

所述β－内酰胺酶基因（ampC）可编码g1和g2的蛋白质：

g1、由SEQ ID No.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

g2、在SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有β－内酰胺酶活性的由g1）衍生的蛋白质。

上述方法中，所述扩环酶基因可为b11-b13中的任一种DNA分子：

b11）其编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或基因组DNA；

b12）在严格条件下与b11）或b12）限定的DNA分子杂交且编码所述扩环酶的cDNA分子或基因组DNA；

b13）与b11）或b12）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述扩环酶的cDNA分子或基因组DNA；

所述乙酰辅酶A合成酶基因可为d11-d13中的任一种DNA分子：

d11）其编码序列是SEQ ID No.4第216-2177位的cDNA分子或基因组DNA；

d12）在严格条件下与d11）或d12）限定的DNA分子杂交且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分子或基因组DNA；

d13）与d11）或d12）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分子或基因组DNA。

上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述方法中，所述扩环酶基因通过含有扩环酶基因表达盒的重组表达载体导入所述受体菌中，所述扩环酶基因表达盒中，启动所述扩环酶基因转录的启动子是pBAD启动子；

所述用乙酰辅酶A合成酶基因替换丙酮酸氧化酶基因中，所述乙酰辅酶A合成酶基因含有SEQ ID No.4的第62-195位所示的启动子FumA，所述启动子FumA位于所述乙酰辅酶A合成酶基因的编码序列上游。

本发明中所述扩环酶基因表达盒可含有所述扩环酶基因和启动所述扩环酶基因转录的启动子。本发明中所述扩环酶基因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.2所示的所述扩环酶基因的DNA，该DNA不但可包括启动所述扩环酶基因转录的启动子，还可包括终止所述扩环酶基因转录的终止子。进一步，所述扩环酶基因表达盒还可包括增强子序列。

在本发明的一个实施方式中，pBAD启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.13的第994－1266位。

在本发明的一个实施方式中，所述含有扩环酶基因表达盒的重组表达载体是将SEQ ID No.13所示的pDB1S载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为SEQ ID No.2所示的脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）基因得到的重组载体pDB1S-H7。

在本发明的一个具体实施方式中，所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌K12。

所述大肠杆菌突变体PG01是将大肠杆菌K12的α－酮戊二酸脱氢酶基因（sucA）替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将大肠杆菌K12的α－酮戊二酸脱氢酶基因（sucA）敲除（缺失）的大肠杆菌K12突变体。

所述大肠杆菌突变体PG03是将大肠杆菌突变体PG01的丙酮酸氧化酶基因（poxB）替换为SEQ ID No.4的第216-2177位所示的乙酰辅酶A合成酶基因（acs）和卡那霉素抗性基因得到的大肠杆菌突变体PG03（简称PG03）。PG03的构建方法如下：

ⅰ、将PG01的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除PG01的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG01△kan（简称PG01△kan）；

ⅱ、将PG01△kan的丙酮酸氧化酶基因（poxB）替换为SEQ ID No.4的第216-2177位所示的乙酰辅酶A合成酶基因（acs）和卡那霉素抗性基因得到的突变体即为大肠杆菌突变体PG03（简称PG03）。在本发明的一个实施方式中，该替换通过将SEQ ID No.4所示的poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown与PG01△kan进行同源重组实现。SEQ ID No.4中，第1-61位是poxB的上游同源臂poxBup、第62-195位是启动子FumA，第216-2177位是乙酰辅酶A合成酶基因（acs），第2858-3652位是卡那霉素抗性基因kan，第3907-3970位是poxB的下游同源臂poxBdown。

所述大肠杆菌突变体PG05是将大肠杆菌K12进行所述a1、所述a2和所述a4改造得到的大肠杆菌K12突变体PG05，其构建方法如下：

ⅰ、消除PG03的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG03△kan（简称PG03△kan）。

ⅱ、将PG03△kan的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）替换为卡那霉素抗性基因得到PG05。在本发明的一个具体实施方式中，将PG03△kan的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）替换为卡那霉素抗性基因。

所述大肠杆菌突变体PG15是将大肠杆菌K12进行所述a1、所述a3和所述a4的改造得到的大肠杆菌突变体PG15（简称PG15）。在本发明的一个具体实施方式中，将PG03△kan的β－内酰胺酶基因（ampC）替换为卡那霉素抗性基因得到PG15。

所述大肠杆菌突变体PG14是对所述大肠杆菌K12进行所述a1和所述a3的改造得到的突变体。在本发明的一个具体实施方式中，将PG01△kan的β－内酰胺酶基因（ampC）替换为卡那霉素抗性基因得到PG14。

所述大肠杆菌突变体PG16是对所述大肠杆菌K12进行所述a1和所述a2的改造得到的突变体。在本发明的一个具体实施方式中，将PG01△kan的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）替换为卡那霉素抗性基因得到PG16。

所述大肠杆菌突变体PG20是将PG16△kan的β－内酰胺酶基因（ampC）替换为卡那霉素抗性基因从而将β－内酰胺酶基因（ampC）敲除得到的大肠杆菌突变体，其基因型为△sucA△aceA△ampC::Kan。所述PG16△kan是将PG16的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，得到大肠杆菌突变体PG16△kan（简称PG16△kan）。

所述大肠杆菌突变体PG22是对所述大肠杆菌K12进行所述a1和所述a2和所述a3和所述a4的改造得到的突变体。在本发明的一个具体实施方式中，是将PG15△kan的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）替换为卡那霉素抗性基因得到得到PG22。所述PG15△kan是将PG15的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，得到大肠杆菌突变体PG15△kan。

上述方法制备的产头孢菌素G的重组菌也是本发明的保护范围。

在本发明的具体实施方式中，上述方法制备的产头孢菌素G具体为将pDB1S-H7导入所述大肠杆菌突变体PG22得到的重组菌PG22/pDB1S-H7，将pDB1S-H7导入所述大肠杆菌突变体PG15得到的重组菌PG15/pDB1S-H7，将pDB1S-H7导入所述大肠杆菌突变体PG14得到的重组菌PG14/pDB1S-H7，将pDB1S-H7导入所述大肠杆菌突变体PG20得到的重组菌PG20/pDB1S-H7，将pDB1S-H7导入所述大肠杆菌突变体PG03得到的重组菌PG03/pDB1S-H7，将pDB1S-H7导入所述大肠杆菌突变体PG05得到的重组菌PG05/pDB1S-H7，将pDB1S-H7导入所述大肠杆菌突变体PG01得到的重组菌PG01/pDB1S-H7，将pDB1S-H7导入所述大肠杆菌突变体PG16得到的重组菌PG16/pDB1S-H7，将pDB1S-H7转入大肠杆菌K12得到重组菌K12/pDB1S-H7。

上述方法制备的产头孢菌素G的重组菌在制备头孢菌素G或7－氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7－ADCA）中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种产量较高的制备头孢菌素G的方法。

本发明所提供的制备头孢菌素G的方法，包括上述产头孢菌素G的重组菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化青霉素G进行催化反应得到头孢菌素G。

上述制备头孢菌素G的方法中，阿拉伯糖诱导培养在阿拉伯糖的浓度为0.2g/100mL的培养基中进行，所述诱导培养的温度可为20-37℃（如30℃-37℃或30℃），所述诱导培养的时间可为10小时-30小时（如12-20小时或12小时）。

实验证明，本发明所制备的产头孢菌素G的重组菌的头孢菌素G的产量为2.67mM-29.01mM，具体如下：PG22/pDB1S-H7的头孢菌素G产量为29.01mM，PG15/pDB1S-H7的头孢菌素G产量为21.48mM，PG14/pDB1S-H7的头孢菌素G产量为17.88mM，PG20/pDB1S-H7的头孢菌素G产量为17.42mM，PG03/pDB1S-H7的头孢菌素G产量为12.44mM，PG05/pDB1S-H7的头孢菌素G产量为12.19mM，PG01/pDB1S-H7的头孢菌素G产量为10.92mM，K12/pDB1S-H7的头孢菌素G产量为2.67mM。大肠杆菌本来不能产生头孢菌素G，本发明首次在大肠杆菌实现了G-7-ADCA的生产。而且通过对大肠杆菌的改造提高了头孢菌素G的产量，产量比棒状链霉菌提高了30－40倍。

附图说明

图1a为PG01的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG01。

图1b为PG02的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG02。

图1c为PG04的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG04。

图1d为PG06的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG06。

图1e为PG08的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG08。

图1f为PG10的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG10。

图1g为PG12的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG12。

图1h为PG03的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG03。

图1i为PG14的PCR验证。M：marker；1：K12；2，3：PG14。

图1j为PG16的PCR验证。M：marker；1，3：K12；2，4，5：PG16。

图1k为PG17的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG17。

图1l为PG18的PCR验证。M：marker；1：K12；2，3：PG18。

图1m为PG19的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG19。

图1n为PG05的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG05。

图1o为PG15的PCR验证。M：marker；1：K12；2，3：PG15。

图1p为PG20的PCR验证。M：marker；1：K12；2，3：PG20。

图1q为PG21的PCR验证。M：marker；1：K12；2：PG21。

图1r为PG22的PCR验证。M：marker；1,3,5,7,10：K12；2,4,6,8,9：PG22。

图2为工程菌中扩环酶蛋白表达的电泳检测结果。

M:蛋白质分子量标准；1:K12/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，2:PG01/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，3:PG02/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，4:PG03/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，5:PG04/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，6:PG05/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，7:PG06/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，8:PG08/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，9:PG10/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，10:PG12/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，11:PG14/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，12:PG15/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，13:PG16/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，14:PG17/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，15:PG18/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，16:PG19/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，17:PG20/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，18:PG21/pDB1S-H7的细胞破碎上清液，19:PG22/pDB1S-H7的细胞破碎上清液。

图3为G-7-ADCA标准品的HPLC图谱。

图4为PG22/pDB1S-H7的全细胞催化转化产物的HPLC图谱。

图5为pDB1S的物理图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，大肠杆菌K12（Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner,and Hirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.）是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌K12本身不产G-7-ADCA。大肠杆菌K12公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中，脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）基因的编码序列如SEQ ID No.2（由936个核苷酸组成）所示，编码SEQ ID No.1（由311个氨基酸残基组成）所示的脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）；乙酰辅酶A合成酶基因（acs）的编码序列如SEQ ID No.4第216至2177位（由1962个核苷酸组成）所示，编码SEQ ID No.3（由652个氨基酸残基组成）所示的乙酰辅酶A合成酶；α－酮戊二酸脱氢酶基因（sucA）的编码序列如SEQ ID No.6（由2802个核苷酸组成）所示，编码SEQ ID No.5所示的α－酮戊二酸脱氢酶（由933个氨基酸残基组成）；丙酮酸氧化酶基因（poxB）的编码序列如SEQ ID No.8（由1719个核苷酸组成）所示，编码SEQ ID No.7所示的丙酮酸氧化酶（由572个氨基酸残基组成）；异柠檬酸裂合酶基因（aceA）的编码序列如SEQ ID No.10（由1305个核苷酸组成）所示，编码SEQ ID No.9所示的异柠檬酸裂合酶（由434个氨基酸残基组成）；β－内酰胺酶基因（ampC）的编码序列如SEQ ID No.12（由1134个核苷酸组成）所示，编码SEQ ID No.11所示的β－内酰胺酶（由377个氨基酸残基组成）。

下述实施例中的野生型P1噬菌体（Thomason LC,Costantino N.2007.E.coli genome manipulation by P1transduction.Current Protocols in Molecular Biology:1.17.1-8）公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的大肠杆菌突变体的基因型如表1。

表1.大肠杆菌突变体的基因型

实施例1、构建表达脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）的重组质粒pDB1S-H7

设计一对引物(scDAOCS-F：AACATGCCATGGACACGACGGTGCCCACCTTCA和scDAOCS-R：CCGGAATTCTTACTATGCCTTGGATGTGCGGCGCA)，以pET30a-H7为模板(Ji J,Fan K,Tian X,Zhang X,Zhang Y,Yang K.Iterative Combinatorial Mutagenesis as an Effective Strategy for Generation of Deacetoxycephalosporin C Synthase with Improved Activity toward Penicillin G.Applied and environmental microbiology2012,78:7809-7812.)，经PCR 扩增脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（scDAOCS）的编码基因（H7)。PCR条件如下：95℃，2min；95℃，20sec；55℃，20sec（30循环）；72℃，15sec；72℃，5min。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约1000bp，与目的片段相符。将H7基因用NcoI和EcoRI酶切后，回收H7基因片段。

pDB1S（图5）的序列如SEQ ID No.13所示，包括如下片段：（1）araC-araBAD-MCS片段（含阿拉伯糖诱导启动子、多克隆位点）；（2）MCS-TrrnB片段（含多克隆位点、终止子TrrnB）；（3）CloDF13复制起始位点片段；（4）链霉素抗性基因aadA片段。

将pDB1S载体用NcoI和EcoRI酶切后，回收载体大片段；将回收的H7基因片段与载体大片段进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞（购自Takara，产品目录号为D9057A），涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑单克隆提取质粒酶切验证正确的克隆送测序，将pDB1S载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为SEQ ID No.2所示的脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）基因得到的重组载体命名为pDB1S-H7。SEQ ID No.2所示的脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）基因编码SEQ ID No.1所示的脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）。pDB1S-H7中，启动脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）基因转录的启动子是核苷酸序列如SEQ ID No.13的第994－1266位所示的pBAD启动子。

实施例2、大肠杆菌突变体PG01，PG02,PG04,PG06,PG08,PG10和PG12的构建

本实施例将大肠杆菌K12进行不同的单基因敲除构建PG01，PG02，PG04，PG06，PG08，PG10，PG12等单基因敲除株。大肠杆菌K12的全基因组序列如GenBank Accession:U00096.3（GI:545778205，update date是Nov15,201301:09PM，version是3）。

1、大肠杆菌突变体PG01（购自国立遗传学研究所（NIG，Japan)，NIG编号为JW0715）(Baba et al.,2006)是将大肠杆菌K12的α－酮戊二酸脱氢酶基因（sucA）替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因（约1300bp）从而将大肠杆菌K12的sucA敲除（缺失）的大肠杆菌K12突变体。在本申请中简称PG01。sucA编码SEQ ID No.5所示的蛋白质，sucA的编码序列如SEQ ID No.6所示。PG01的基因型为△sucA::Kan。引物对sucA_up550F（AACCTCTTGTCCGTCTTTCTG）和sucA_down353R（CGCATCGTTGTTTTGCTC）从PG01的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段（图1a），从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约3705bp的片段。其中，sucA_up550F和sucA_down353R引物结合位置分别是大肠杆菌K12的sucA基因的上游550bp和下游350bp附近区域。测序分析结果表明PG01的基因组上没有sucA。PG01是将大肠杆菌K12的α－酮戊二酸脱氢酶基因（sucA）缺失得到的大肠杆菌K12突变体。

2、大肠杆菌突变体PG02（购自国立遗传学研究所（NIG，Japan)，NIG编号为JW0716）(Baba et al.,2006)是将大肠杆菌K12的二氢硫辛酰转琥珀酰酶基因（sucB）位于基因组761522至762739的位置，替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将大肠杆菌K12的sucB敲除（缺失）的大肠杆菌K12突变体。在本申请中简称PG02。PG02的基因型为△sucB::Kan。用引物对SucB-up382F:AGGGCGTGAAGCGCGTAGTGATGT和SucB_down457r：TTTCACACCGCCCGCTTTACCG从PG02的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2057bp的片段（图1b）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的sucB基因的上游和下游区域。测序分析结果表明PG02的基因组上没有sucB。PG02是将大肠杆菌K12的sucB缺失得到的大肠杆菌K12突变体。

3、大肠杆菌突变体PG04（购自国立遗传学研究所（NIG，Japan)，NIG编号为JW0717）(Baba et al.,2006)是将大肠杆菌K12的琥珀酰-CoA合成酶β亚基基因（sucC）位于基因组763014..764180的位置，替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将大肠杆菌K12的sucC敲除（缺失）的大肠杆菌K12突变体。在本申请中简称PG04。PG04的基因型为△sucC。用引物对SucC-Up568-f:GGCAAGCTGACCGTTGAA和SucC-down234_r:TGCAGAACGGTGCTGGT从PG04的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约1969bp的片段（图1c）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的sucC基因的上游和下游区域。测序分析结果表明PG04的基因组上没有sucC。PG04是将大肠杆菌K12的琥珀酰-CoA合成酶β亚基基因（sucC）缺失得到的大肠杆菌K12突变体。

4、大肠杆菌突变体PG06（购自国立遗传学研究所（NIG，Japan)，NIG编号为JW0718）(Baba et al.,2006)是将大肠杆菌K12的琥珀酰-CoA合成酶α亚基基因(sucD)位于基因组764180..765049的位置，替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将大肠杆菌K12的琥珀酰-CoA合成酶β亚基基因（sucD）敲除（缺失）的大肠杆菌K12突变体。在本申请中简称PG06。PG06的基因型为△sucD::Kan。用引物对SucD-Up339-f:TAAACTGCACGGCGGCGAA和SucD-down400_r:TGGATGCCGCTTGCGTT从PG06的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约1600bp的片段（图1d）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的sucD基因的上游和下游区域。测序分析结果表明PG06的基因组上没有sucD。PG06是将大肠杆菌K12的琥珀酰-CoA合成酶α亚基基因(sucD)缺失得到的大肠杆菌K12突变体。

5、大肠杆菌突变体PG08（购自国立遗传学研究所（NIG，Japan)，NIG编号为JW3975）(Baba et al.,2006)是将大肠杆菌K12的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）位于基因组4217109..4218413的位置，异柠檬酸裂合酶基因（aceA）的编码序列如SEQ ID No.10（由1305个核苷酸组成）所示，编码SEQ ID No.9所示的异柠檬酸裂合酶（由434个氨基酸残基组成）,替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将大肠杆菌K12的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）敲除（缺失）的大肠杆菌K12突变体。在本申请中简称PG08。PG08的基因型为△aceA::Kan。用引物对aceA_up380_F：GTGAACGCACCGAAGAAGG和aceA_d700_R：GTCAGATGGCGAATAATGTAATGGA从PG08的基因组DNA中扩增得到一个约2500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2429bp的片段（图1f）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的aceA基因的上游和下游区域。测序分析结果表明PG08的基因组上没有aceA。PG08是将大肠杆菌K12的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）基因缺失得到的大肠杆菌K12突变体。

6、大肠杆菌突变体PG10的构建

PG10的构建过程包括“（1）宿主菌的制备、（2）poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段的制备及（3）同源重组”3个分子生物学操作。

（1）宿主菌的制备：

将pKD46质粒（购自Clontech公司）通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌K12，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌K12/pKD46。重组大肠杆菌K12/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。

（2）poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段的制备：

poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4，由3970个核苷酸组成，含有（a）大肠杆菌FumA启动子（SEQ ID No.4第62-195位）、（b）大肠杆菌乙酰CoA合成酶基因（acs）（SEQ ID No.4第216至2177位（由1962个核苷酸组成））、（c）TrrnB终止子（SEQ ID No.4第2184-2440位）、（d）带FRT侧翼的卡那霉素抗性基因（FRT-kan-FRT)（卡那霉素抗性基因如SEQ ID No.4第2858-3652位，FRT序列为：gaagttcctatactttctagagaataggaacttcg，FRT-kan-FRT的核苷酸序列如SEQ ID No.4第2450－3877位）、（e）poxB的上游同源臂poxBup（SEQ ID No.4第1-61位）、（f）poxB的下游同源臂poxBdown（SEQ ID No.4第3907-3970位）。

（3）同源重组：

将SEQ ID No.4所示的poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段电转入重组大肠杆菌K12/pKD46的感受态细胞，利用卡那霉素平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）筛选到阳性转化体—将poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown转入重组大肠杆菌K12/pKD46得到的重组大肠杆菌，命名为PG10。PG10的基因型为△poxB::acs-Kan。用poxB_up_480_F（TGGGTAGAGCAGGAAGTGAAA）和poxB_down_410_r（TGCGGGCGAAATGGA）进行PCR验证，从PG10的基因组DNA中扩增得到一个约4500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2600bp的片段（图1f）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的poxB基因的上游和下游区域。测序分析结果表明PG10的基因组上没有丙酮酸氧化酶基因（poxB），PG10的基因组上含有SEQ ID No.4所示的FumA-acs-kan片段。

7、大肠杆菌突变体PG12的构建

大肠杆菌突变体PG12（购自国立遗传学研究所（NIG，Japan)，NIG编号为JW4111）(Baba et al.,2006)是将大肠杆菌K12的β－内酰胺酶基因（ampC）替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将大肠杆菌K12的β－内酰胺酶基因（ampC）敲除（缺失）的大肠杆菌K12突变体，在本申请中简称PG12。β－内酰胺酶基因（ampC）的编码序列如SEQ ID No.12（由1134个核苷酸组成）所示，编码SEQ ID No.11所示的β－内酰胺酶（由377个氨基酸残基组成）。PG12的基因型为△ampC::Kan。用引物对ampC_up320（TGATCCTGCTGGTGGGTAT）和ampC_d280（GTATGTTGCGGTGACTTTTTC）从PG12的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约1742bp的片段（图1g）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的ampC基因的上游和下游区域。测序分析结果表明PG12的基因组上没有ampC。PG12是将大肠杆菌K12的β－内酰胺酶基因（ampC）缺失得到的大肠杆菌K12突变体。

8、大肠杆菌突变体PG03的构建

大肠杆菌突变体PG03是将大肠杆菌突变体PG01的丙酮酸氧化酶基因（poxB）替换为SEQ ID No.4的第216-2177位所示的乙酰辅酶A合成酶基因（acs）和卡那霉素抗性基因得到的大肠杆菌突变体PG03（简称PG03）。PG03的构建方法如下：

ⅰ、将PG01的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除PG01的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG01△kan（简称PG01△kan）；

ⅱ、将PG01△kan的丙酮酸氧化酶基因（poxB）替换为SEQ ID No.4的第216-2177位所示的乙酰辅酶A合成酶基因（acs）和卡那霉素抗性基因得到的突变体即为大肠杆菌突变体PG03（简称PG03）。该替换通过将SEQ ID No.4所示的poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown与PG01△kan进行同源重组实现。SEQ ID No.4中，第1-61位是poxB的上游同源臂poxBup、第62-195位是启动子FumA，第216-2177位是乙酰辅酶A合成酶基因（acs），第2858-3652位是卡那霉素抗性基因kan，第3907-3970位是poxB的下游同源臂poxBdown。PG03具体采用如下P1噬菌体介导的转染法构建：

(1)将PG01的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除PG01的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG01△kan（简称PG01△kan）。具体如下：首先，利用表达Flp重组酶的质粒pCP20（购自Clontech公司）化学转化PG01，将PG01的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除PG01的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG01△kan（简称PG01△kan）。以PG01△kan的基因组DNA为模板，用引物对sucA_up550F和sucA_down353R进行PCR验证，扩增得到一个约1000bp的片段，引物对sucA_up550F和sucA_down353R从PG01的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段（包括卡那霉素抗性基因），结果表明卡那霉素抗性已经消除。PG01△kan在涂有卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上不生长，表明已经消除PG01的卡那抗性。

(2)将PG01△kan的丙酮酸氧化酶基因（poxB）替换为含FumA启动子的乙酰辅酶A合成酶基因（acs）和卡那霉素抗性基因得到的突变体即为大肠杆菌突变体PG03（简称PG03）。具体如下：（a）获得供体菌的P1：将供体菌PG10接种于含10mmol/L MgCl₂、5mmol/L CaCl₂和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1－3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1vir△poxB::acs。(b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株PG03,具体步骤如下：过夜培养PG01△kan（受体菌），1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬PG01△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△poxB::acs与100μL PG01△kan细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μLLB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即PG03，以阳性克隆PG03的基因组DNA为模板,用poxB_up_480_F和poxB_down_410_r进行PCR验证，从PG03的基因组DNA中扩增得到一个约4500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2600bp的片段（图1h）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的poxB基因的上游和下游区域。poxB_up_480_F：TGGGTAGAGCAGGAAGTGAAA，poxB_down_410_r：TGCGGGCGAAATGGA。测序结果表明PG03是将PG01△kan的丙酮酸氧化酶基因（poxB）替换为乙酰辅酶A合成酶基因（acs）和卡那霉素抗性基因得到的突变体（简称PG03）。PG03的基因型为△sucA△poxB::acs-Kan。

9、PG14的构建：利用P1噬菌体转导技术将PG01△kan的β－内酰胺酶基因（ampC）替换为卡那霉素抗性基因得到PG14。具体如下：

（a）供体P1的制备：将PG12接种于含10mmol/L MgCl₂、5mmol/L CaCl₂和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1－3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1vir△ampC。

(b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株PG14,具体步骤如下：过夜培养PG01△kan（受体菌），1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬PG01△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△ampC与100μL PG01△kan细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μL LB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即PG14(△sucA△ampC::Kan)。用引物对ampC_up320（TGATCCTGCTGGTGGGTAT）和ampC_d280（GTATGTTGCGGTGACTTTTTC）进行PCR验证扩增，从PG14的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约1742bp的片段（图1i泳道1和2）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的ampC基因的上游和下游区域。用K2（CGGTGCCCTGAATGAACTGC）和ampC_d280从PG14中PCR扩增得到约1000bp片段（图1i泳道3），而从K12则扩增不到这个片段。以上PCR验证结果表明PG14构建正确，测序分析结果表明PG14是将PG01△kan的β－内酰胺酶基因（ampC）缺失得到的大肠杆菌突变体，其基因型为△sucA△ampC::Kan。

10、PG16的构建：利用P1噬菌体转导技术将PG01△kan的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）替换为卡那霉素抗性基因得到PG16。具体如下：

（a）供体P1的制备：将PG08接种于含10mmol/L MgCl₂、5mmol/L CaCl₂和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1－3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1vir△aceA。

(b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株PG16,具体步骤如下：过夜培养PG01△kan（受体菌），1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬PG01△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△aceA与100μL PG01△kan细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μL LB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即PG16(△sucA△aceA::Kan)。用引物对sucA_up550F（AACCTCTTGTCCGTCTTTCTG）和sucA_down353R（CGCATCGTTGTTTTGCTC）从PG16的基因组DNA中扩增得到一个约1000bp的片段（图1j泳道2），而从野生型大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约3705bp的片段（图1j泳道1）。用引物对aceA_up380_F（GTGAACGCACCGAAGAAGG）和aceA_d700_R（GTCAGATGGCGAATAATGTAATGGA）进行PCR验证扩增，从PG16的基因组DNA中扩增得到一个约2500bp的片段（图1j泳道4），从野生型大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2429bp的片段（图1j泳道3）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌的aceA基因的上游和下游区域。用K2（CGGTGCCCTGAATGAACTGC）和aceA_d700_R PCR扩增得到约1400bp片段（图1j泳道5）而K12则扩增不到这个片段。以上PCR验证结果表明PG16构建正确。测序分析结果表明PG16是将PG01△kan的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）缺失得到的大肠杆菌突变体，其基因型为△sucA△aceA::Kan。

11、PG17的构建:采用P1噬菌体介导的转染法构建PG17。具体如下：

(1)将PG08的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，得到大肠杆菌突变体PG08△kan（简称PG08△kan）。具体如下：首先，利用表达Flp重组酶的质粒pCP20（购自Clontech公司）化学转化PG08，将PG08的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除PG08的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG08△kan（简称PG08△kan）。PG08△kan在涂有卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上不生长，表明已经消除PG08的卡那抗性。

（2）供体P1的制备：将PG10接种于含10mmol/L MgCl₂、5mmol/L CaCl₂和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1－3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1vir△poxB::acs。

(3)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株PG17,具体步骤如下：过夜培养PG08△kan（受体菌），1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬PG08△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△poxB::acs与100μL PG08△kan细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μL LB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即PG17。用poxB_up_480_F（TGGGTAGAGCAGGAAGTGAAA）和poxB_down_410_r（TGCGGGCGAAATGGA）进行PCR验证，从PG17的基因组DNA中扩增得到一个约4500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2600bp的片段（图1k）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的poxB基因的上游和下游区域。测序结果表明该重组菌PG17的基因型为△aceA△poxB::acs－kan。

12、PG18的构建:采用P1噬菌体介导的转染法构建PG18。具体如下：

过夜培养PG08△kan（受体菌），1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬PG08△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△ampC与100μL PG08△kan细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μL LB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即PG18。用引物对ampC_up320（TGATCCTGCTGGTGGGTAT）和ampC_d280（GTATGTTGCGGTGACTTTTTC）进行PCR验证扩增，从PG18的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约1742bp的片段（图1l泳道1和2）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌的ampC基因的上游和下游区域。用K2（CGGTGCCCTGAATGAACTGC）和ampC_d280PCR扩增得到约1000bp片段（图1l泳道3）而K12则扩增不到这个片段。以上PCR验证结果表明PG18构建正确，测序分析结果表明该重组菌PG18构建正确，其基因型为△aceA△ampC::Kan。

13、PG19的构建：采用P1噬菌体介导的转染法构建PG19。具体如下：

(1)将PG12的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，得到大肠杆菌突变体PG12△kan（简称PG12△kan）。具体如下：首先，利用表达Flp重组酶的质粒pCP20（购自Clontech公司）化学转化PG12，将PG12的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除PG12的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG12△kan（简称PG12△kan）。PG12△kan在涂有卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上不生长，表明已经消除PG12的卡那抗性。

（2）供体P1的制备：将PG10接种于含10mmol/L MgCl₂、5mmol/L CaCl₂和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1－3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1vir△poxB::acs。

(3)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株PG19,具体步骤如下：过夜培养PG12△kan（受体菌），1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬PG12△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△poxB::acs与100μL PG12△kan细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μL LB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即PG19。用poxB_up_480_F（TGGGTAGAGCAGGAAGTGAAA）和poxB_down_410_r（TGCGGGCGAAATGGA）进行PCR验证，从PG19的基因组DNA中扩增得到一个约4500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2600bp的片段（图1m）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的poxB基因的上游和下游区域。测序结果表明该PCR阳性重组菌PG19的基因型为△ampC△poxB::acs-kan。

14、PG05的构建

PG05的构建方法如下：

（1）将PG03的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，得到大肠杆菌突变体PG03△kan（简称PG03△kan）。具体如下：首先，利用表达Flp重组酶的质粒pCP20（购自Clontech公司）化学转化PG03，将PG03的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除PG03的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG03△kan（简称PG03△kan）。PG03△kan在涂有卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上不生长，表明已经消除PG03的卡那抗性。

（2）供体P1的制备：将PG08接种于含10mmol/L MgCl₂、5mmol/L CaCl₂和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1－3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1vir△aceA。

(3)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株PG05,具体步骤如下：过夜培养PG03△kan（受体菌），1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬PG03△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△aceA与100μL PG03△kan细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μL LB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即PG05。用poxB_up_480_F（TGGGTAGAGCAGGAAGTGAAA）和poxB_down_410_r（TGCGGGCGAAATGGA）进行PCR验证，从PG05的基因组DNA中扩增得到一个约4500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2600bp的片段（图1n）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的poxB基因的上游和下游区域。测序结果表明PG05构建正确，PG05是将PG03△kan的异柠檬酸裂合酶基因（aceA）缺失得到的大肠杆菌突变体，PG05的基因型为△sucA△poxB::acs△aceA::Kan。

15、PG15的构建

利用P1噬菌体转导技术将PG03△kan的β－内酰胺酶基因（ampC）替换为卡那霉素抗性基因从而将β－内酰胺酶基因（ampC）敲除得到PG15，具体构建方法如下：(1)将PG03的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，得到大肠杆菌突变体PG03△kan（简称PG03△kan）。具体如下：首先，利用表达Flp重组酶的质粒pCP20（购自Clontech公司）化学转化PG03，将PG03的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除PG03的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体PG03△kan（简称PG03△kan）。PG03△kan在涂有卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上不生长，表明已经消除PG03的卡那抗性。

(2)供体P1的制备：将PG12接种于含10mmol/L MgCl₂、5mmol/L CaCl₂和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1－3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1vir△ampC。

(3)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株PG15,具体步骤如下：过夜培养PG03△kan（受体菌），1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬PG03△kan细胞，将100μL噬菌体P1vir△ampC与100μL PG03△kan细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μL柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集，用100μL LB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为50μg/ml）上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即PG15。用引物对ampC_up320（TGATCCTGCTGGTGGGTAT）和ampC_d280（GTATGTTGCGGTGACTTTTTC）进行PCR验证，从PG15的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约1742bp的片段（图1o泳道1和2）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌的ampC基因的上游和下游区域。用K2（CGGTGCCCTGAATGAACTGC）和ampC_d280从PG15中PCR扩增得到约1000bp片段（图1o泳道3），而从K12中则扩增不到这个片段。以上PCR验证结果表明PG18构建正确，测序分析结果表明PG15是将

产头孢菌素G的重组菌及其构建方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。