专利摘要

专利摘要

本发明属于生物技术领域，提供了一种提高L‑缬氨酸发酵效率的恒容控制工艺，其通过同时进行流加补料与放料的方式，控制发酵全程装液量恒定，同时调节流加补料中营养液浓度，在满足装液量恒定的情况下维持罐内L‑缬氨酸浓度在一定范围内不变，防止发酵后期由于罐内L‑缬氨酸浓度积累过高造成的反馈抑制效果，同时维持菌体活力延长产酸高峰期，提高单批次L‑缬氨酸产量与产酸效率，降低副产物L‑丙氨酸合成量。

权利要求

1.一种提高缬氨酸生产效率的恒容发酵工艺，其特征在于，所述恒容发酵工艺包括如下步骤：按10%的接种量将产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌种子液接入装有20L发酵罐培养基的容积为30L发酵罐中，在发酵进行至32 h时，以0.85 L/h的速率流加补充葡萄糖营养液，并以0.15L/h的速率流加补充代谢调节液；同时以1L/h的速率放出发酵液；当发酵进行至84 h时，结束发酵；整个发酵过程中，温度控制在30-32℃培养，溶氧控制在20-25%；

所述发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆40g/L，黄豆饼粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L， MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB1 10mg/L，pH6.7-7.2；

所述葡萄糖营养液组分为：葡萄糖140g/L，KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、VB10.4mg/L、玉米浆干粉4g/L；

所述代谢调节液组分为：正丙醇4-6g/L,3-氟代丙酮酸10-30mg/L。

2.根据权利要求1所述的恒容发酵工艺，其特征在于，所述代谢调节液组分为：正丙醇5g/L,3-氟代丙酮酸20mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的恒容发酵工艺，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为CGMCC.NO.12152。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高缬氨酸生产效率的恒容发酵工艺。

背景技术

L-缬氨酸是人和动物机体所必需的八种氨基酸之一，与亮氨酸、异亮氨酸同属于三种支链氨基酸，在生理上具有多种调节功能，在人类生命代谢中具有重要的地位，其除用于一般营养型膳食配制以外，还大量用于生产各类复合氨基酸制剂，在医疗方面具有极为广泛的应用。L-缬氨酸是药用氨基酸原料中用量最大的品种之一。目前来看，L-缬氨酸主要利用谷氨酸棒状杆菌进行微生物发酵生产，此生产方式具有成本低、条件温和以及可大规模生产等优点，是非常经济的一种生产方法。因此，利用微生物发酵法生产缬氨酸具有重要意义。

缬氨酸的途径主要有化学合成法、提取法以及微生物发酵法。随着对L-缬氨酸研究的深入，具有原料成本低、反应条件温和以及可大规模生产等优点的微生物发酵法逐渐成为了世界范围内生产L-缬氨酸的主要方式，而发酵法生产L-缬氨酸的成本则主要受到发酵水平高低的影响。发酵水平的高低在发酵生产的上、中、下游都有不同的体现：发酵生产上游的菌种改造、发酵生产中游的过程控制以及发酵生产下游的分离提取关乎着发酵生产的最终产量。目前，发酵法生产L-缬氨酸主要利用经代谢工程手段改造之后的谷氨酸棒状杆菌进行发酵生产，而这种方法目前主要面临的问题是糖酸转化率不高以及副产物丙氨酸中后期积累过多影响最终L-缬氨酸的提取的问题。

中国专利“CN109207533A”公开了一种利用蛋氨酸和氯化胆碱复配的方式提高缬氨酸发酵产量的方法，包括以下步骤：在缬氨酸的发酵培养时，葡萄糖初始添加量为80g/L。当培养基中葡萄糖耗至10g/L左右时，开始流加含有1g/L氯化胆碱(相对于初始发酵液体积而言)的80％葡萄糖溶液，使培养基中残糖浓度保持在10—15g/L；发酵过程中温度为32℃，通过流加25％氨水维持pH在7.0—7.2，通过调节转速和通风将溶氧控制在20％左右。该方法将氯化胆碱与蛋氨酸以一定量配比之后加入到发酵培养基底物中，再将氯化胆碱添加到葡萄糖溶液中，使其随糖流加至发酵液中，以提高菌体生产缬氨酸的能力，发酵48h—52h，缬氨酸产量从80—85g/L提高到95—100g/L。但是该方法并没有公开具体的发酵菌株以及培养基具体组分，无法在工业上实施。

中国专利“CN106190921A”公开了一种谷氨酸棒状杆菌与应用，与缬氨酸合成相关的酶的氨基酸序列存在许多碱基突变，保藏号为CGMCC No.12152，是利用传统育种手段中的化学诱变法成功筛选到的一株高效的缬氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌XV株，该菌株经摇瓶发酵培养后，发酵液中平均可检测到缬氨酸30g/L，较原始菌株的0.3g/L，进步显著，经30L发酵罐44-50h发酵后，发酵液中平均可检测到缬氨酸80g/L，在制备缬氨酸方面具有重要应用价值。

采用微生物发酵法生产缬氨酸时，所使用的菌株为谷氨酸棒杆菌诱变株，该菌株生长缓慢，发酵周期长，产酸速率较慢，因此，提高菌体生长速度，缩短发酵生产周期，加快产酸速率是亟待解决的问题。当前生产上，利用微生物发酵法生产包括L-缬氨酸在内的各种产物的工艺中所采用的发酵方式，都是通过前期向发酵罐内加入一定量的培养基底物，中后期罐内流加葡萄糖碳源，与此同时在整个的发酵过程中，尽量减少不必要的取料及放液操作，以减少罐内体积的降低幅度，保证发酵过程中物料不被浪费，是一种相当成熟的发酵控制工艺，但是这种工艺仍存在一些不足之处，例如：不断的流加糖补充会造成在整个发酵过程中罐内发酵液体积的持续增长，从上罐开始发酵至发酵结束下罐，罐内发酵体系的体积能够一般能够增长30%-45%，庞大的体积增长使得在发酵过程中需要通过不断地调整风量供应才能够维持体系通风比，保证溶氧水平的稳定，而通风与罐压又存在着相互影响的关系，这就造成在发酵产酸的高峰期，需要不断调整各种控制以参数维持发酵的稳定，而在人为的发酵控制中，受主观因素的影响，或多或少会导致发酵参数的调整产生波动，对发酵的最终结果产生影响；在考虑到发酵中后期流加补料会导致发酵罐装液量升高的问题时，通常控制发酵的初始装液量在50%，后期通过放液的操作将装填系数维持在不超过75%的程度，这就造成了发酵罐在发酵初期装填量不够充分，在发酵后期发酵液浪费的问题，从根本上会导致发酵产物产量总量下降。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高缬氨酸生产效率的恒容发酵控制工艺。本发明在整个发酵过程中维持发酵液体积恒定的情况下，通过补料并同时放出相同体积发酵液的恒容发酵工艺，旨在通过提高发酵罐装填系数和利用率的方式提高发酵的产酸量、产酸速率以及糖酸转化率等，并且同时维持罐内L-缬氨酸的浓度在一定的范围内，降低因高浓度积累带来的反馈抑制效果，可谓一举两得。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种提高缬氨酸生产效率的恒容发酵工艺，其通过同时进行流加补料与放料的方式控制发酵全程装液量恒定，同时调节补料流加量，在满足装液量恒定的情况下维持罐内L-缬氨酸浓度在一定范围内不变。

进一步地，所述恒容发酵工艺包括如下步骤：按10-20%的接种量将产缬氨酸的谷氨酸棒杆菌种子液接入装有20L发酵罐培养基的容积30L发酵罐中，在发酵进行至32 h时，以0.85 L/h的速率流加补充葡萄糖营养液，并以0.15L/h的速率流加补充代谢调节液；同时以1L/h的速率放出发酵液；当发酵进行至84 h时，结束发酵；整个发酵过程中，温度控制在30-32℃培养，溶氧控制在20-25%。

更进一步地，发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆40g/L，黄豆饼粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L， MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB110mg/L，pH6.7-7.2。

更进一步地，所述葡萄糖营养液组分包括葡萄糖100-150g/L。

更进一步地，所述代谢调节液的组分包括正丙醇和/或3-氟代丙酮酸。

优选地，所述葡萄糖营养液组分为：葡萄糖140g/L，KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O0.2 g/L、VB1 0.4 mg/L、玉米浆干粉4g/L。

优选地，所述代谢调节液组分为：正丙醇4-6g/L,3-氟代丙酮酸10-30mg/L。

更优选地，所述代谢调节液组分为：正丙醇5g/L,3-氟代丙酮酸20mg/L。

本发明的技术方案具备如下有益效果：

本发明采用提高缬氨酸产酸效率的恒容发酵控制方式，通过同时进行补料与放料的方式，控制发酵全程装液量恒定，同时调节流加补料，在满足装液量恒定的情况下维持罐内L-缬氨酸浓度在一定范围内不变，防止发酵后期由于罐内L-缬氨酸浓度积累过高造成的反馈抑制效果，同时维持菌体活力延长产酸高峰期，提高单批次L-缬氨酸产量与产酸效率，降低副产物L-丙氨酸合成量。

针对缬氨酸发酵代谢合成途径补充添加葡萄糖营养液和代谢调节液，葡萄糖营养液提供了菌株正常生长维持活性的营养物质，代谢调节液中包括正丙醇和3-氟代丙酮酸，其中一定添加量的3-氟代丙酮酸能够部分抑制丙酮酸脱氢酶的酶活，导致更多地代谢流转入缬氨酸合成途径，正丙醇可能通过对菌株产生一定的胁迫作用而提高缬氨酸的积累，也可能通过激活缬氨酸合成中的关键酶，例如缬氨酸脱氢酶的酶活力来促进缬氨酸的合成，具体机制还需要进一步的研究阐明。

附图说明

图1：发酵罐结构图，1、压力表；2、液位电极；3、补料罐I；4、补料罐II；5、补料罐III；6、罐体；7、搅拌轴；8、搅拌叶片；9、放料口；10、蠕动泵；11、储液箱；

图2：恒容发酵工艺中代谢调节液组分对发酵液中缬氨酸浓度的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明使用的谷氨酸棒杆菌为现有菌株，保藏号为CGMCC.NO.12152（参见CN106190921B）。

实施例1

一种提高缬氨酸产酸效率的恒容发酵控制方式，通过同时进行流加补料与放料的方式，控制发酵全程装液量恒定，同时调节流加补料，在满足装液量恒定的情况下维持罐内L-缬氨酸浓度在一定范围内不变，具体实施如下：

如图1所示，在发酵罐（体积为30L）罐体6的底部处有一放料口9通过自动取料蠕动泵10与储液箱11连接，此蠕动泵速率与流加补料速率相等；在罐体装液量80%处装有液位电极2，当出现发酵异常及其他情况导致装液量过高超过80%时，自动打80%液位处的放料口开关。搅拌轴7带动搅拌叶片8以转速150rpm搅拌培养，压力表1用于监控罐压。

缬氨酸的发酵培养时，按10%的接种量将谷氨酸棒杆菌种子液接入装有20L发酵罐培养基的30L发酵罐中，接种浓度OD600为2左右，发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆40g/L，黄豆饼粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L， MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB1 10mg/L，pH6.7-7.2，其余为蒸馏水。32℃培养，溶氧控制在20%，在发酵进行至32 h时，测得罐内葡萄糖浓度为1 g/L左右，此时L-缬氨酸浓度为60.4 g/L。补料罐I开始以0.85 L/h的速率流加补充葡萄糖营养液，组分为：葡萄糖140g/L，KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、VB1 0.4mg/L、玉米浆干粉4g/L；补料罐II开始以0.15L/h的速率流加补充代谢调节液，组分为：正丙醇5g/L,3-氟代丙酮酸20mg/L；同时放料口9以1L/h的速率放出发酵液；补料罐III用于流加氨水控制pH为6.8-7.0之间。

发酵罐内L-缬氨酸浓度在60 g/L左右浮动，当发酵进行至72h时罐内L-缬氨酸浓度开始呈轻微下降趋势，当发酵进行至84 h时，罐内L-缬氨酸浓度下降至50.6 g/L，此时停罐结束发酵。

对比例1

缬氨酸的发酵培养时，按10%的接种量将谷氨酸棒杆菌种子液接入装有18L发酵罐培养基的30L发酵罐中，接种浓度OD600为2，发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆40g/L，黄豆饼粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L， MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O10mg/L，VB1 10mg/L，pH6.7-7.2，其余为蒸馏水。在发酵进行至32 h时，测得罐内葡萄糖浓度为1 g/L左右，此时L-缬氨酸浓度为60g/L左右，同时添加葡萄糖控制浓度不低于3g/L；继续发酵培养，并且实时监控L-缬氨酸浓度，40 h时达到79g/L，50h时L-缬氨酸浓度85g/L，然后L-缬氨酸浓度不再增加，选择50h停止发酵。

实施例2

实施例1和对比例1发酵性能比较。

表1

如表1所示，以上所述发酵方式使产酸周期延长了68%，单批次发酵产酸总量提高了111%，单位时间内的产酸效率提高了25.7%，同时副产物L-丙氨酸的浓度下降了88.26%。可见本发明采用恒容发酵的方式能够有效提高L-缬氨酸发酵的产量并降低副产物的浓度，具有很大的生产研究价值。

实施例3

本发明恒容发酵工艺中代谢调节液组分对发酵液中缬氨酸浓度的影响。

对照组1：代谢调节液替换为等量的蒸馏水，其余同实施例1；

对照组2：代谢调节液组分为正丙醇5g/L，其余同实施例1；

对照组3：代谢调节液组分为3-氟代丙酮酸20mg/L，其余同实施例1；

实验组：实施例1。

分别在36,42,48,54,60,66,72,78,84，单位为h，检测发酵液中缬氨酸的含量，发酵32h时，各组别缬氨酸的浓度均为60g/L左右（实施例1），如图2所示，随着发酵时间的增加，实验组中缬氨酸浓度变化不大，72h时后有轻微下降的趋势，84h时为50g/L上下浮动，此时结束发酵；对照组1在42h后有明显的下降，54h降为46.7g/L，此时需要结束发酵；对照组2在42h后呈现下降趋势，60h时为53.4g/L，72h降为48.1g/L，结束发酵；对照组3在54h后呈现下降趋势，下降速率较快，66h降低为50.8g/L，结束发酵。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种提高缬氨酸生产效率的恒容发酵工艺专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。