专利摘要

专利摘要

一种噬氨副球菌(Paracoccusaminovorans)HPD－2，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2008年7月3日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.2568。该降解菌具有较广的底物谱，对环境中的PAHs有很好的降解能力。

权利要求

1、一种噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2008年7月3日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2568。

2、根据权利要求1所述的噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，该菌株在降解高分子量多环芳烃污染土壤中的应用。

3、根据权利要求1所述的噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，该菌株在降解苯并[a]芘、芘或荧蒽污染土壤中的应用。

4、一种权利要求1所述的噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2的培养基，其特征在于组成为：K₂HPO₄6.0g，KH₂PO₄5.5g，Na₂SO₄2.0g，KCl 2.0g，NH₄NO₃2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，微量元素溶液1.0mL，高分子量多环芳烃3mg或50mg，该培养基pH7.0-7.2。

5、根据权利要求4所述的噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2的培养基，其特征在于所述高分子量多环芳烃为苯并[a]芘、芘或荧蒽。

说明书

一、技术领域

本发明涉及噬氨副球菌，具体涉及一种噬氨副球菌HPD-2及其在多环芳烃污染土壤修复中的应用。

二、背景技术

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是环境中普遍存在的一类有机污染物，由于其在环境中的半衰期较长和致癌、致畸、致突变的性质而受到人们的重视。美国环保局在20世纪80年代初把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污染物，我国也将其列入环境污染的黑名单中。苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，B[a]P)是由五个苯环组成的一种多环芳烃化合物，致癌性极强，是国内外环境监测的重要指标之一。芘(Pyrene，PYR)和荧蒽(Fluoranthene，FA)都是四环的多环芳烃化合物，也具有一定的致癌作用。三环以上的PAHs都属于高分子量PAHs。通常认为，PAHs的环数越高，越难被微生物降解利用。

近年来，国内外对高分子量PAHs的微生物降解研究表明，能够同时降解多种高分子量PAHs(如四环和五环)的微生物资源还很少。目前有关副球菌属对PAHs的降解研究较少，主要针对四环以下的PAHs，有学者发现能降解萘、蒽、菲、芴、荧蒽、屈、芘等PAHs的副球菌属细菌。然而，至今还未报道能够同时降解B[a]P、芘和荧蒽的副球菌。事实上，环境中PAHs通常以多种组分同时存在，呈现其复合污染现象。目前还没有发现能够同时降解多种高分子量PAHs的微生物资源。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供了一种能够同时降解多种高分子量PAHs(如四环和五环)的微生物资源，该微生物为高分子量PAHs降解菌：噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2CGMCC No.2568，该菌可以使溶液中苯并[a]芘的含量降低89.7％，芘和荧蒽也有大幅降低，具有较广的降解谱；使污染土壤中9种PAHs总去除率为22.9％，三环PAHs的降解率为36.1％，四环PAHs的降解率为20.9％，五环PAHs的降解率为26.0％。该菌株在PAHs污染土壤的生物修复中具有较好的应用前景。

技术方案一种噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2008年7月3日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2568。噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2在降解高分子量多环芳烃污染土壤中的应用。噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2在降解苯并[a]芘、芘或荧蒽污染土壤中的应用。噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2的培养基，组成为：K₂HPO₄ 6.0g，KH₂PO₄5.5g，Na₂SO₄ 2.0g，KCl 2.0g，NH₄NO₃ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，微量元素溶液1.0mL，高分子量多环芳烃3mg或50mg，该培养基pH 7.0-7.2。上述高分子量多环芳烃为苯并[a]芘、芘或荧蒽。

本发明提供一种高分子量多环芳烃的降解菌，其菌株是一株革兰氏阴性菌HPD-2(2008年07月03日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.2568)，经鉴定为噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)。该菌株在平板上生长48h后呈乳白色凸起菌落，菌落直径约为1～4mm，表面光滑，边缘整齐。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性，球状，菌体直径为0.6～1.0μm(见图1、图2)。

该菌具有较高的降解高分子量多环芳烃的能力。将降解高分子量多环芳烃的Paracoccus aminovorans HPD-2CGMCC No.2568菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入500mL三角瓶，培养至对数生长期。在B[a]P浓度为3.0mg/L的培养液中生长5d后，B[a]P的降解率为89.7％；浓度为50mg/L时，15d后B[a]P的降解率为46.2％。该菌株对四环PAHs也有较好降解能力，7d后芘和荧蒽的降解率分别为47.2％和84.5％(见图1～图6)。

将Paracoccus aminovorans HPD-2CGMCC No.2568菌液按20％的接种量接入多环芳烃污染土壤中，28℃避光培养2周后结果发现，与对照相比，污染土壤中9种PAHs总去除率为22.9％，三环PAHs的降解率为36.1％，四环PAHs的降解率为20.9％，五环PAHs的降解率为26.0％(见图7～图8)。该菌株在PAHs污染土壤的生物修复中具有较好的应用前景。

本发明提供的CGMCCNo.2568菌能在苯并[a]芘、芘和荧蒽为唯一碳源和能源的无机盐基础培养基中生长并降解利用高分子量PAHs，其培养基组成为：K₂HPO₄ 6.0g，KH₂PO₄5.5g，Na₂SO₄ 2.0g，KCl 2.0g，NH₄NO₃ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，微量元素溶液1.0mL，pH为7.0-7.2。121℃灭菌30min。

有益效果该降解菌具有较广的底物谱，对环境中的PAHs有很好的降解能力。

四、附图说明：

图1为菌株HPD-2在固体培养基上菌落形态(A)

图2为单菌株在透射电镜(15000倍)下的形态(B)

图3基于16S rRNA序列同源性的菌株HPD-2和相关细菌的系统发育树

图4为菌株HPD-2在B[a]P培养液中的生长曲线(A)

图5为培养液中B[a]P浓度随时间的变化(B)

图6培养7天后菌株HPD-2对PYR和FA的降解情况

图7土壤中各多环芳烃组分浓度随时间的变化

图8生物修复后土壤中三环、四环、五环PAHs及总PAHs的降解率(％)

五、具体实施方式

实施例1：噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans HPD-2 CGMCC No.2568)的分离、鉴定及其降解特性

1.1供试土壤

采自长江三角洲某地多环芳烃重度污染土壤。其基本理化性质为：pH6.4，有机质19.2g/kg，碱解氮1.0g/kg，全磷0.5g/kg，有效钾14.2g/kg，阳离子交换量21.5cmol/kg。16种EPA定为优先污染物的PAHs的总量达10.3mg/kg。新鲜土壤样品过2mm筛，于暗处4℃保存。

1.2供试多环芳烃

B[a]P、PYR和FA都购自Sigma公司(美国)，均为分析纯。

1.3培养类型

①牛肉膏蛋白胨培养基；②无机盐培养基(MS)：每升含K₂HPO₄ 6.0g，KH₂PO₄ 5.5g，Na₂SO₄ 2.0g，KCl 2.0g，NH₄NO₃ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，微量元素溶液1.0mL(其组成为：1000mL蒸馏水中溶解1g FeSO·7H₂O，1g MnSO·H₂O，0.25gNa₂MoO₄·2H₂O，0.1gH₃BO₄，0.25gCuCl₂·2H₂O，0.25gZnCl₂，0.1gNH₄VO₃，0.25g Co(NO₃)₂·6H₂O，0.1gNiSO₄·6H₂O)，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2；③含PAHs的无机盐培养基：以DMF配制1000mg/L的不同PAHs(B[a]P，PYR，FA)溶液，按B[a]P浓度(3.0mg/L或5.0mg/L)及PYR，FA按(50.0mg/L)浓度加入灭菌的上述配方的无机盐培养基。

1.4PAHs降解菌的分离与纯化

称取10g上述新鲜供试土壤(即采自长江三角洲某地多环芳烃重度污染土壤)，加入装有100mL无机盐液体培养基(B[a]P浓度为5.0mg/L)的三角瓶中，28℃下200r/min振荡培养1周。按10％接种量转接到新鲜的B[a]P无机盐培养基中，继续培养1周，反复5次。最后吸取0.1mL培养液稀释不同梯度涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，挑取单菌落，将平板划线纯化后的单菌落再接种到B[a]P无机盐液体培养基中，选取生长速度最快的菌株作为研究菌株。

1.5菌种形态观察及鉴定

将已充分活化的菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃培养24h，革兰氏染色后在光学显微镜下观察该菌株在平板上生长48h后呈乳白色凸起菌落，菌落直径约为1～4mm，表面光滑，边缘整齐(见图1)。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性，球状，菌体直径为0.6～1.0μm。将活化菌种在牛肉膏蛋白胨平皿上划线接种，28℃培养箱中倒置培养2d，观察菌落形态，并测量菌落大小。细菌样品经处理后用日立H-7650透射电子显微镜(TEM)观察菌体结构。

1.616S rDNA的PCR扩增、序列分析和系统发育树的构建

利用Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取细菌DNA。用于16S rDNA PCR反应的引物为一对通用引物。正向引物为BSF8/20：5-AGAGT1TGATCCTGGCTCAG-3；反向引物为BSR1541/20：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。PCR反应条件：94℃3min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，循环29次；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的测序由上海博亚生物技术有限公司完成。降解菌16S rDNA序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析。然后利用MEGA 4.0软件构建系统发育树，采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析。

1.7菌悬液的制备

在无菌条件下将菌株接种于5.0mg/L B[a]P无机盐液体培养基中，28℃下200r/min振荡培养1周，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液反复洗涤3次，再用磷酸盐缓冲液将菌悬液调至所需浓度备用。

1.8菌株对苯并[a]芘的降解

将该菌接种量为10％的菌悬液加入50mL上述液体无机盐培养基中，以加灭活菌悬液的处理作为对照(CK)，加入B[a]P，使B[a]P的最终浓度约为3.0mg/L，每个处理设3个重复。28℃下200r/min避光振荡培养5天，在不同时段(0、6、12、24、48、72、96、120h)取样，4℃冷冻保存。测定溶液中B[a]P的浓度和OD₆₀₀的变化。

1.9菌株对芘和荧蒽的降解

在50mL液体无机盐培养基中加入该菌接种量为10％的菌悬液，以加灭活菌悬液的处理作为对照，PYR和FA的最终浓度为50.0mg/L，每个处理设3个重复。28℃下200r/min避光振荡培养7d后取样，测定溶液中PYR和FA的浓度。

1.10溶液中多环芳烃的提取与分析

将三角瓶中的菌液全部倒入分液漏斗，加入50mL乙酸乙酯提取3次，合并提取液后用无水Na₂SO₄去除水分。在水温为36℃的旋转蒸发器中旋转浓缩至干。加2.0mL乙腈溶解，用高效液相色谱(HPLC)测定培养液中多环芳烃含量。流动相为乙腈/水(60：40)，FA、PYR和B[a]P的保留时间分别为32.5、35.1和56.5min。液相色谱为日本岛津Class-vp高效液相色谱分析系统，配荧光检测器RF-10AXL，柱温箱OTO-10ASVP，二元梯度泵LC-10AT，色谱分离柱为美国Varian公司的ChromSpher 5PAH。

2.1多环芳烃降解菌株的菌落形态、细胞形态及生理生化特征及序列分析

该噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2 CGMCC No.2568具有以下特征(1)菌落形态特征：在牛肉膏蛋白胨平板上培养48h的菌落大小为直径1～4mm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，乳白色(见图1)。(2)菌体形态特征：该菌为革兰氏阴性，球状，不运动，菌体直径为0.6～1.0μm(见图2)。(3)生理生化特征：好氧生长，氧化酶和接触酶均为阳性，不产色素，能利用甲胺、三甲胺及丙三醇，不能利用甲酸盐和甲醇；能利用果糖和甘露醇，不能利用木糖和蔗糖；能利用硝酸铵和硫酸铵，不能利用尿素。该菌的16S rDNA PCR产物约1.5kb左右，16S rRNA序列同源性比对(图3)表明，该菌株16S rRNA序列与Paracoccus aminovorans细菌的16S rRNA序列相似性高达99％。结合上述的形态鉴定与16S rDNA分析结果将此菌株鉴定为副球菌属，其编号为HPD-2。

2.2HPD-2在苯并[a]芘培养基上的生长曲线

HPD-2在含有B[a]P的无机盐液体培养基中的生长曲线见图4。该菌株从接种到第6h生长缓慢，处于延滞期；从6h到12h，菌株开始加速生长，细胞数目开始有所增加；从24h到48h，细胞数目急剧增加，OD₆₀₀值从0.1快速增加到0.4，处于指数生长期；第48h到96h，OD₆₀₀值变化不大，细胞处于稳定期；到120h，细胞数目有所减少，进入衰亡期。

2.3HPD-2对苯并[a]芘的降解特性分析

无机盐液体培养基中B[a]P的浓度随时间的变化情况如图5所示。由图可知，B[a]P的浓度从培养初期即开始下降，第24h至48h降低得最快，48h后下降的速度减缓，与该菌的生长曲线呈现一定的对应关系。与培养初期相比，第120h时加HPD-2的处理中B[a]P的降解率达89.7％。

2.4HPD-2对芘和荧蒽的降解特性

图6所示的是HPD-2培养7天后对PYR和FA的降解情况。从图中可以看出，PYR和FA的浓度均明显低于对照，而且FA比PYR降低得更多。表明该菌对PYR和FA都有一定的降解能力，且对FA的降解能力更强，它们降解率分别为47.2％和84.5％。本研究中利用B[a]P生长的HPD-2仍然对PYR和FA表现出了较好的降解能力。

实施例2：噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans HPD-2 CGMCC No.2568)的土壤修复效应

1.1供试土壤

采自长江三角洲某地多环芳烃污染土壤。土壤的基本理化性质为：pH 6.4，有机质19.2g/kg，碱解氮1.0g/kg，全磷0.5g/kg，有效钾14.2g/kg，阳离子交换量21.5cmol/kg。9种EPA定为优先污染物的PAHs的总量达10.78mg/kg。其中，四环、五环PAHs的含量分别占总量的71.8％和23.0％，说明该土壤中的PAHs主要由高分子量PAHs组成。新鲜土壤样品过2mm筛后，于暗处4℃保存。

1.2培养类型

①牛肉膏蛋白胨培养基；②无机盐培养基(MS)：每升含K₂HPO₄ 6.0g，KH₂PO₄ 5.5g，Na₂SO₄ 2.0g，KCl 2.0g，NH₄NO₃ 2.0g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，微量元素溶液1.0mL，pH7.0-7.2；③含PAHs的无机盐培养基：以DMF配制1000mg/L的不同PAHs(B[a]P，PYR，FA)溶液，按适当的浓度加入上述配方的灭菌无机盐培养基。

1.3供试菌株

噬氨副球菌Paracoccus aminovorans HPD-2 CGMCC No.2568。

1.4菌液的制备

在无菌条件下将菌株HPD-2接种于含有50.0mg/L苯并[a]芘的无机盐液体培养基中，28℃下200r/min振荡培养至对数生长期，离心后收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次，再用磷酸盐缓冲液将菌液调节吸光度(OD₆₀₀)至适当浓度备用，含菌量为6.2×10⁶CFU/mL。

1.5PAHs污染土壤的生物修复试验

称取1000g PAHs污染土壤，加入200mL HPD-2菌液，混合均匀。以加入等量灭活菌液的处理作为对照(CK)，每个处理设3个重复。将土壤水分保持在田间持水量的60％，于28℃下避光培养。在第0、7、14d取样，土壤样品4℃冷冻保存。

1.6土壤中PAHs的分析

称取2.0g风干土样于索氏管中，向茄形瓶中加入二氯甲烷70mL，索氏抽提24h。取出后控制水温为36℃的旋转蒸发器中旋转浓缩至干，然后加入2.0mL环己烷对茄形瓶中物质进行溶解。另称1.0g经400℃下处理4h的干燥硅胶于小烧杯中，加10mL正己烷浸泡15min，然后装硅胶柱。吸取茄形瓶中环己烷溶解液0.5mL过柱。用1∶1正己烷和二氯甲烷混合液进行洗脱，首次1.0mL洗脱液弃去，再接2mL洗脱液于刻度试管中，用高纯氮气吹干。加2.0mL乙腈溶解，用Class-VP5X Shimadzu HPLC测定(钱薇等，2007)。流动相为乙腈/水(60∶40)。液相色谱为日本岛津Class-vp高效液相色谱分析系统，配荧光检测器RF-10AXL，柱温箱OTO-10ASVP，二元梯度泵LC-10AT，色谱分离柱为美国Varian公司的ChromSpher 5PAH。

2.1土壤中PAHs的动态变化

微生物能够利用或降解的污染物越多，在生物修复中的利用价值就越大，因此微生物的降解底物谱是生物修复时选择微生物的重要因素。图7所示的是在生物修复过程中土壤中各PAHs组分含量随时间的变化。从中可以看出，截至第14d，所有加菌的处理中各PAHs组分的浓度均明显低于对照土壤(P＜0.05)，降解率均在19.5％～36.2％之间，其中最高的是菲(36.2％)、蒽(35.4％)和苯并[a]芘(32.2％)。

从多环芳烃的环数看(图8)，加菌处理中三环PAHs的降解率最高(36.1％)，五环次之(26.0％)，四环的最低(20.9％)，PAHs的总去除率为22.9％。

噬氨副球菌HPD专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。