一种靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物及其应用

IPC分类号 : C07D475/00,A61K31/519,A61P35/00,A61P35/02

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CN201610991723.1

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专利摘要

本发明涉及一种靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物及其应用，属于药物化学领域，具体涉及一种靶向泛素化降解Polo样激酶1和溴结构域蛋白4的化合物，及其药学上可接受的盐、水合物，和以该化合物为活性成分的药物组合，以及在制备PLK1和BRD4蛋白抑制和降解剂及其用于治疗和、或预防癌症中的用途。本发明制备方法操作简单，条件温和，所得化合物均具有PLK1和BRD4蛋白酶抑制和降解活性，抗肿瘤作用显著。

权利要求

1.如通式I所示的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：

其中R1、R2、R3、R4各自独立的选自H、卤素、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基；n为1、2、3、4、5或6。

2.如权利要求1所述的通式I化合物及其药学上可接受的盐或水合物，其中R1、R2、R3、各自独立的选自H、卤素、C1-C4烷氧基；R4选自C1-C4烷基。

3.如权利要求1所示的通式I化合物及其药学上可接受的盐或水合物，其为如下通式化合物：

其中R₁，R₂，R₃独立选自H，卤素或甲氧基；n为2或3。

4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：选自：

4-(((S)-8-苄基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(4-氟苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(4-氯苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(4-溴苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(3-溴苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(2-溴苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(3-氯-4-氟苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(3-溴-4-氟苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(4-甲氧基苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺；

4-(((S)-8-(4-溴苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺。

5.权利要求1-4中任意一项的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物在制备与PLK1蛋白和BRD4蛋白活性异常表达相关疾病的药物中的应用。

6.权利要求1-4中任意一项的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1-4中任意一项的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物以及药学上可接受的赋形剂。

8.如权利要求7所述药物组合物在制备与PLK1蛋白和BRD4蛋白活性异常表达相关疾病的药物中的应用。

9.如权利要求7所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.权利要求1-4中任意一项的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物和权利要求5所述药物组合在制备治疗和、或预防乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，甲状腺乳头状癌，卵巢癌、黑色素瘤或各种白血病,特别是急性髓性白血病中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物，及其药学上可接受的盐，水合物和以该化合物为活性成分的药物组合，以及在制备PLK1蛋白和BRD4蛋白抑制剂及其用于治疗和/或预防肿瘤中的应用。

背景技术

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome pathway，UPP)是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。UPP由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、蛋白酶体及其底物(蛋白质)构成。UPP特异性降解蛋白质的过程分两个阶段：(1)蛋白底物泛素化：泛素分子由APP提供能量，被E1激活转移到E2，然后经E3与特异性蛋白底物结合；(2)蛋白底物降解：被泛素化的蛋白分子能够被蛋白酶体识别，并进入蛋白酶体降解成短链的多肽分子。

PROTACs技术是利用一种双功能小分子将目标蛋白和细胞内的E3拉近，从而导致目标蛋白质的降解。PROTACs包含三部分功能结构：(1)可以与蛋白底物相结合的部分；(2)能够与E3相结合的部分；(3)前两部分的连接链。在细胞内PROTACs可以同时与靶蛋白及E3结合，使本来不能与E3结合的靶蛋白泛素化，进而被蛋白酶体识别并降解。(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2016,55(6),1966-1973.)

研究证明沙利度胺类药物(沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)可以结合到CRBN蛋白上，CRBN能与损伤DNA结合蛋白1(damaged DNAbinding protein 1,DDB1)、Cullin-4A(CUL4A)、cullins 1调控子(Roc1)结合起来，形成E3泛素连接酶复合物CRL4。该复合物利用泛素来标记特定的蛋白，随后水解这些蛋白。(Science.2010,327(5971),1345-1350；Nature.2014,512(7512),49-53.)

发明内容

本发明目的在于提供一种靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物及其应用，具体为具有邻苯二甲酰亚胺片段的化合物及其制备方法，以及该类化合物作为PLK1和BRD4蛋白抑制和降解剂在预防和/或治疗肿瘤中的应用。

本发明涉及通式I所示的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：

其中R1、R2、R3、R4各自独立的选自H、卤素、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基；n为1、2、3、4、5或6。

其中优选R1、R2、R3、各自独立的选自H、卤素、C1-C4烷氧基；R4选自C1-C4烷基，更优选R4为乙基；

进一步优选如下通式化合物：

其中R₁，R₂，R₃独立选自H，卤素或甲氧基；n为2或3。

除非另外指出，本发明所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘；C1-C6烷氧基是指甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基，直链或直链的C5烷氧基、直链或直链的C6烷氧基；C1-C6烷基是指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、直链或直链的C5烷基、直链或直链的C6烷基。本发明还选自：

此外，本发明包括药物组合物，该组合物含有通式I化合物和药物上可接受的赋形剂。所述药物上可接受的赋形剂是指任何可用于药物领域的稀释剂、辅助剂和、或载体。本发明的化合物可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其它不利作用，例如过敏反应。

本发明的药物组合可配置成若干剂型，其中含有药物领域中常用的一些赋形剂，例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬剂，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。

用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

通过体外抑酶试验和酶降解试验筛选，我们发现本化合物可抑制并降解PLK1和BRD4蛋白酶活力。因此，本发明化合物可用于与PLK1和BRD4蛋白酶活性一场表达相关的疾病中的应用，如各种癌症。

通过体外活性筛选，我们发现本发明化合物具有抗肿瘤活性，因此本发明化合物可以用于制备治疗和、或预防各种癌症的药物，如乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，甲状腺乳头状癌，卵巢癌、黑色素瘤、或各种白血病，特别是急性髓性白血病。

本发明化合物可作为唯一的抗癌药物使用，或者与一种或多种其它抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时，顺序或隔开给药来实现。

本发明在参考文献的基础上，选用沙利度胺类似物作为PROTACs中与E3连接酶进行结合的部位，选用聚乙二醇连接链将其于同时具有Polo样激酶1(PLK1)和溴结构域蛋白4(BRD4)蛋白酶抑制剂活性的结构相连接构建PROTACs，同时化合物针对双靶点相对于单靶点药物可降低其抗肿瘤活性的耐药性。体外PLK1和BRD4蛋白酶抑制活性、体外抗肿瘤活性测试及体外PLK1和BRD4蛋白-降解活性表明，该类靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物(PROTACs)可将PLK1和BRD4靶向蛋白降解，具有良好的抗肿瘤活性，并表现出优异的PLK1和BRD4抑制作用。

本发明制备方法操作简单，条件温和，所得化合物均具有PLK1和BRD4蛋白酶抑制和降解活性，抗肿瘤作用显著。

具体实施方式

下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本化合物及其制备方法。应当理解，下述实施例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。

下面的合成路线描述了本发明的通式I化合物的制备，所有的原料都是通过这些路线中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可市购。本发明的全部最终化合物都是通过这些路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些路线中应用的全部可变因

数如下文的定义或如权利要求中的定义。

试剂和条件:(a)SOCl₂,MeOH；(b)NaBH(OAc)₃,Na₂CO₃；(c)K₂CO₃,acetone；(d)Zn,NH₄Cl；(e)NaH,CH₃I；(f)MeOH,HCl；(g)HBTU,DIPEA。

按照本发明的通式I化合物，合成路线中各取代基如发明内容部分所定义。

中间体1的制备

D-2-氨基丁酸10g，加入100mL甲醇，然后滴加入二氯亚砜24.2mL,回流反应2h。减压蒸干，加入甲基叔丁基醚100mL,有固体生成，过滤干燥得白色固体13.52g,产率91％。

¹H-NMR(CDCl₃，400MHz):δ1.09(t,3H,CH₃),2.01-2.26(m,2H,CH₂),3.68(s,3H,CH₃),4.02-4.25(m,1H,CH),8.72(s,2H,NH₂)。

中间体2的合成

中间体1 5g，苯甲醛衍生物33mmol加入到二氯甲烷50mL中，冰浴下加入三乙酰氧基硼氢化钠10.4g，室温反应24h,加饱和碳酸氢钠水溶液50mL,二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤蒸干得淡黄色液体中间体2。

中间体3的制备

中间体2 54mmol,K₂CO₃ 4.0g加入到丙酮80mL中，0℃下加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶5.6g的丙酮溶液20mL,室温反应24h,过滤，蒸干，硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚1：20)，得中间体3。

中间体4的制备

中间体3(59mmol),还原锌粉(28g,7mmol)，NH₄Cl(9.3g,175mmol)加入甲醇200mL中，加热回流24h.过滤蒸干，硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚1：4)得中间体4。

中间体5的制备

中间体4(6g,22mmol)，碘甲烷(3.4g,24mmol)加入DMF 50mL，-15℃下加入60％氢化钠(1.2g,30mmol),室温反应3h,加入冰水100mL,乙酸乙酯萃取，蒸干，硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚1：4)得中间体5。

中间体6的合成

中间体5(2.13mg,7.2mmol)和4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.88mg,11.2mmol)加入3mL甲醇12mL水和1.50mL浓盐酸，回流48h.减压蒸干溶剂，甲醇和乙醚重结晶得中间体6。

中间体7的制备

聚乙甘醇二胺0.41mmol,DIPEA105mg,4-氟-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)乙吲哚-1,3-酮112.5mg,加入DMF 2mL,90℃反应12h.冷却到室温，加水20mL,乙酸乙酯萃取，萃取液饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1；10)得中间体7。

实施例1：化合物4-(((S)-8-苄基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8a)的制备

化合物6a 0.012mmol加入0.250ml of DMF中，然后加入HBTU 4.9mg,和DIPEA4.1μL,中间体7a 0.014mmol室温反应3h；加50mL水，酸乙酯萃取，萃取液饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1：10)得化合物8a,产率67％。

^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.78-1.82(m,2H,CH₂),2.00-2.06(m,1H,CH)2.52-2.64(m,2H,CH×2),2.86-3.03(m,3H,CH₂,CH),3.25-3.34(m,5H,CH₂，CH₃),3.54–3.70(m,12H,CH₂)，3.92(s,3H,CH₃),4.29(t,1H,CH),4.43(d,1H,CH),5.05(dd,1H,CH),5.14(d,1H,CH),7.02(d,1H,ArH),7.08(d,1H,ArH),7.15-7.39(m,6H,ArH)，7.58(dd,1H,ArH),7.62(dd,1H，ArH),7.87(s,1H，ArH)，7.94(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:878.4[M+H]⁺。

按照实施例1的制备方法，选择适当的原料，制的实施例2-10的化合物

实施例2：4-(((S)-8-(4-氟苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8b)。

产率60％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.78-1.84(m,2H,CH₂),2.02-2.08(m,1H,CH)2.52-2.66(m,2H,CH×2),2.86-3.04(m,3H,CH₂,CH),3.28-3.36(m,5H,CH₂，CH₃),3.54–3.76(m,12H,CH₂)，3.92(s,3H,CH₃),4.30(t,1H,CH),4.46(d,1H,CH),5.06(dd,1H,CH),5.18(d,1H,CH),7.02-7.06(m,3H,ArH),7.08(d,1H,ArH),7.28-7.32(m,2H,ArH),7.58-7.69(m,3H，ArH),7.84(s,1H，ArH)，7.92(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:896.4[M+H]⁺。

实施例3:4-(((S)-8-(4-氯苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8c)。

产率62％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.78-1.82(m,2H,CH₂),2.02-2.06(m,1H,CH)2.56-2.64(m,2H,CH×2),2.86-3.04(m,3H,CH₂,CH),3.25-3.36(m,5H,CH₂，CH₃),3.56–3.68(m,12H,CH₂)，3.94(s,3H,CH₃),4.29(t,1H,CH),4.45(d,1H,CH),5.06(dd,1H,CH),5.17(d,1H,CH),7.02(d,1H,ArH),7.08(d,1H,ArH),7.18-7.25(m,4H,ArH),7.54-7.58(m,2H，ArH),7.62(dd,1H，ArH),7.86(s,1H，ArH)，7.94(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:912.3[M+H]⁺

实施例4:4-(((S)-8-(4-溴苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8d)

产率58％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.78-1.82(m,2H,CH₂),2.00-2.06(m,1H,CH)2.52-2.64(m,2H,CH×2),2.92-3.02(m,3H,CH₂,CH),3.25-3.34(m,5H,CH₂，CH₃),3.58–3.70(m,12H,CH2)，3.92(s,3H,CH₃),4.32(t,1H,CH),4.43(d,1H,CH),5.06(dd,1H,CH),5.14(d,1H,CH),7.02(d,1H,ArH),7.08(d,1H,ArH),7.31(t,1H,ArH),7.49-7.58(m,5H,ArH),7.64(d,1H,ArH),7.87(s,1H,ArH)，7.98(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:956.3[M+H]⁺

实施例5:4-(((S)-8-(3-溴苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8e)

产率67％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.78-1.82(m,2H,CH2),2.02-2.08(m,1H,CH)2.54-2.64(m,2H,CH×2),2.86-3.02(m,3H,CH₂,CH),3.26-3.34(m,5H,CH₂，CH₃),3.54–3.72(m,12H,CH₂)，3.92(s,3H,CH₃),4.30(t,1H,CH),4.43(d,1H,CH),5.08(dd,1H,CH),5.16(d,1H,CH),7.02(d,1H,ArH),7.08(d,1H,ArH),7.16-7.27(m,2H,ArH),7.34-7.39(m,1H,ArH),7.48(s,1H,ArH),7.53-7.56(m,2H，ArH)，7.61(dd,1H，ArH),7.87(s,1H，ArH)，7.96(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:956.3[M+H]⁺

实施例6:4-(((S)-8-(2-溴苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8f)

产率70％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.79-1.84(m,2H,CH₂),2.01-2.06(m,1H,CH)2.52-2.64(m,2H,CH×2),2.86-3.05(m,3H,CH₂,CH),3.26-3.34(m,5H,CH₂，CH₃),3.54-3.72(m,12H,CH2)，3.92(s,3H,CH₃),4.32(t,1H,CH),4.46(d,1H,CH),5.08(dd,1H,CH),5.16(d,1H,CH),7.02(d,1H,ArH),7.08(d,1H,ArH),7.14-7.18(m,1H,ArH),7.27-7.32(m,1H,ArH),7.39-7.42(m,1H,ArH),7.51-7.62(m,4H,ArH),7.87(s,1H，ArH)，7.94(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:956.3[M+H]⁺

实施例7:4-(((S)-8-(3-氯-4-氟苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8g)

产率64％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.78-1.82(m,2H,CH₂),2.00-2.06(m,1H,CH)2.52-2.64(m,2H,CH×2),2.86-3.03(m,3H,CH₂,CH),3.25-3.34(m,5H,CH₂，CH₃),3.54-3.70(m,12H,CH2)，3.92(s,3H,CH₃),4.30(t,1H,CH),4.43(d,1H,CH),5.05(dd,1H,CH),5.14(d,1H,CH),7.02-7.08(m,3H,ArH),7.16-7.19(m,1H,ArH),7.34-3.78(m,1H,ArH),7.54-7.56(m,2H，ArH)，7.61(dd,1H，ArH),7.86(s,1H，ArH)，7.94(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:930.3[M+H]⁺

实施例8:4-(((S)-8-(3-溴-4-氟苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8h)

产率58％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.78-1.84(m,2H,CH₂),2.02-2.08(m,1H,CH)2.52-2.64(m,2H,CH×2),2.86-3.06(m,3H,CH₂,CH),3.26-3.34(m,5H,CH₂，CH₃),3.52-3.70(m,12H,CH₂)，3.92(s,3H,CH₃),4.31(t,1H,CH),4.46(d,1H,CH),5.05(dd,1H,CH),5.17(d,1H,CH),7.03-7.08(m,3H,ArH),7.22-7.26(m,1H,ArH),7.54-7.58(m,3H,ArH),7.64(dd,1H，ArH)，7.87(s,1H，ArH)，7.94(d,1H，ArH)；LC-MSm/z:974.8[M+H]⁺

实施例9:4-(((S)-8-(4-甲氧基苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8i)

产率70％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.78-1.82(m,2H,CH₂),2.00-2.06(m,1H,CH)2.52-2.64(m,2H,CH×2),2.86-3.06(m,3H,CH₂,CH),3.26-3.34(m,5H,CH₂，CH₃),3.54-3.70(m,12H,CH₂)，3.92(s,3H,CH₃),4.29(t,1H,CH),4.43(d,1H,CH),5.05(dd,1H,CH),5.16(d,1H,CH),6.72-6.77(d,2H,ArH),7.02(d,1H,ArH),7.08(d,1H,ArH),7.11-7.13(d,2H,ArH),7.53-7.56(m,2H，ArH)，7.62(dd,1H，ArH)，7.84(s,1H，ArH)，7.92(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:908.4[M+H]⁺

实施例10:4-(((S)-8-(4-溴苄基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢喋啶-2-基)氨基)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8j)

产率63％，^IH NMR(400MHz,CDCl₃)δ：0.76(t,3H,CH₃),1.76-1.80(m,2H,CH₂),2.02-2.08(m,1H,CH)2.52-2.64(m,2H,CH×2),2.86-3.03(m,3H,CH₂,CH),3.25-3.34(m,5H,CH₂，CH₃),3.54–3.70(m,8H,CH2),3.94(3H,s,O-CH3),4.29(t,1H,CH),4.43(d,1H,CH),5.05(dd,1H,CH),5.14(d,1H,CH),7.02(d,1H,ArH),7.08(d,1H,ArH),7.31(t,1H,ArH),7.49-7.58(m,5H,ArH),7.64(d,1H,ArH),7.87(s,1H,ArH)，7.94(d,1H，ArH)；LC-MS m/z:912.3[M+H]⁺。

实施例11：PLK1蛋白抑制活性测定

用ELSIA方法测定化合物对PLK1蛋白的抑制活性，96孔微板孔中依次加入PLK1纯化蛋白，2.5μL DMSO稀释的不同浓度抑制剂，150mM底物、10mM ATP、90μL反应缓冲液，，同时设立空白和本底对照组，室温孵育30min。洗板，加入100μL PPT-07,室温孵育30min。洗板，每孔中加入100μL抗兔的辣根连接的二抗，室温下孵育30min。洗板，每孔中加入100ul显色剂，室温下孵育15min。每孔加入100ul反应终止液，以激发光450nm，测定各孔荧光计数，计算抑制率IC₅₀。

实施例12：BRD4蛋白抑制活性测定方法

采用时间分辨荧光(TR-FRET)法通过BRD4bromodomain 1TR-FRET Assay Kit(Cayman Chemical，USA)测定化合物对BRD4蛋白的抑制活性。将10uL DMSO溶解的不同浓度的抑制剂加入384微孔板中中，加入5uL含10nM BRD4的蛋白反应缓冲液。室温孵育15分钟。随后每孔加入5uL Ac-H4肽和TR-FRET检测试剂[Anti-6His-XL665和Streptavidin-Eu]混合液，黑暗中室温孵育1h。测量在330-350nm下激发后在620nm和665nm处的荧光发射。将在665nm和622nm处的发射的比率作为所形成的BRD4/Ac-H4复合物的量的指示，计算化合物对BRD4蛋白的抑制活性IC₅₀。

实施例13：MTT法测定肿瘤细胞增殖抑制活性方法的建立以及化合物活性测定

将处于细胞对数生长期的要进行实验的肿瘤细胞(HepG2、A549、HeLa、MV4-11)按一定的细胞量接种于培养板内，培育24h,加入不同浓度抑制剂，细胞在37℃、5％CO₂条件下继续培养48小时，每孔加入20ul MTT溶液继续培养4小时，用DMSO溶解结晶，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其OD值计算IC₅₀。

实施例14：Western-blot测定PLK1和BRD4蛋白降解方法

将药物干预过的Hela或MV4-11细胞收集，用预冷的PBS洗涤2次，PMSF与RIPA裂解液以1：100的比例混合，冰上裂解细胞20min，4℃，12000r/min×20min离心，取上清，即细胞总蛋白，用BCA法定量检测蛋白量，用5×蛋白上样缓冲液稀释蛋白后100℃变性5min。蛋白在SDS－PAGE电泳分离，转膜，封闭2h，一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜，二抗1:1000孵育2h，化学发光后X胶片显影，用Image J软件分析每个条带的灰度值，计算蛋白降解50％时抑制剂浓度DC₅₀。