专利摘要

专利摘要

本申请公开了一种硫酸软骨素四糖的合成方法。以透明质酸盐为起始原料，依次经酶解，保护基保护，保护基转换，选择性脱保护以及羟基氧化与选择性还原得到如式O所示的中间体化合物，再利用式O所示的中间体化合物合成硫酸软骨素四糖，式O中取代基的具体定义见说明书。此外，还提供了合成硫酸软骨素四糖的中间体化合物。本申请所提供的合成方法较已有文献的合成路线简便，无需糖基化反应，反应收率高，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种硫酸软骨素四糖的合成方法，所述方法包括如下步骤：

(1)式A化合物在含有氯化钠的弱酸性缓冲溶液中，在透明质酸酶的作用下得到式B化合物；这里，所述的透明质酸酶来源于动物睾丸，活力400-1000IU/mg；优选地，选自牛睾丸或绵羊睾丸；更优选地，为牛睾丸；

(2)式B化合物在无机酸的醇R₁OH溶液中进行酯化反应，对式B化合物的羧基进行酯化；而后利用酸酐R₂-O-R₂，在碱性条件下对式B化合物其余的所有羟基进行酰化保护，得到式C化合物；

这里，酸酐R₂-O-R₂中，R₂选自脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；

(3)式C化合物在碱存在下，在有机溶剂中选择性脱除还原端N-乙酰氨基葡萄糖的1位羟基，得到式D化合物；

(4)式D化合物在碱催化下，与三卤代乙腈反应，得到端基含亚胺酯的式E化合物；

(5)式E化合物在酸催化下得到式F化合物

(6)式F化合物在酸存在下，在有机溶剂中，与醇R₄-R₃OH反应，得到式G化合物；

这里，醇R₄-R₃OH中R₃选自-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)n-，n为1-100，脂肪族烷烃亚基，脂肪族烯烃亚基，或-CH₂-(OCH₂CH₂)m-，m为1-100；优选地，R₃为-CH₂-O-CH₂CH₂-；R₄选自叠氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、硫醚，所述取代的氨基是指被保护基保护的氨基，所述保护基选自苄氧羰酰基、叔丁氧羰酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基；优选地，R₄-R₃OH为N₃-CH₂-OCH₂CH₂-OH；

(7)式G化合物在酸或碱的醇R₁OH溶液中，脱去式G化合物上所有的R₂，得到式H化合物；

(8)式H化合物在R₅CHO或R₅CHO缩二脂肪醇的存在下，在酸催化下选择性保护式H化合物的4,6二羟基与4′,6′二羟基，得到式I化合物；

这里，R₅CHO或R₅CHO缩二脂肪醇中的R₅选自苯基或取代的苯基；

(9)式I化合物在酰卤R₇X或酸酐R₇-O-R₇的作用下，在碱性条件下进行酰化，得式J化合物；

这里，酰卤R₇X或酸酐R₇-O-R₇中的R₇选自C1-C4脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；酰卤R₇X中的X选自氯、溴或碘，优选地为氯或溴；

(10)式J化合物在酸与还原剂的存在条件下，选择性裸露4位羟基，使得6位为R₅-CH₂-保护，得到式K化合物；

(11)式K化合物在氧化剂存在条件下，对4,4′位羟基进行氧化，得到式L化合物；

(12)式L化合物在还原剂存在条件下，选择性将式L化合物中的4与4′位的两个酮羰基还原为醇，而且两个新生成的羟基的构型与步骤(11)中式K的两个羟基构型相反，得到半乳糖构型的式M化合物；

(13)式M化合物在氧化剂或还原剂作用下，脱除6与6’位的两个苄基或取代的苄基，得到四醇，即式O化合物；

或者，将步骤(10)-(13)用下述的步骤(10a)-(14)替换：

(10a)式J化合物在酸的存在条件下，水解两个亚苄基或取代的亚苄基，得到式K’化合物；

(11a)式K’化合物在取代的氯硅烷R₈R₈R₉SiCl与碱的存在下，区域选择性地对两个N-乙酰氨基葡萄糖的6,6’位羟基进行硅烷化，得到式L’化合物；

(12a)式L’化合物在氧化剂存在条件下，选择性地将式L’化合物中的两个N-乙酰氨基葡萄糖的4与4’位的羟基氧化为酮羰基，得到式M’化合物；

(13a)式M’化合物在还原剂存在条件下将N-乙酰氨基葡萄糖的4与4’位的酮羰基立体选择性的还原为直立键羟基，得到式N’化合物；

(14)式N’化合物在酸或氟离子试剂的存在下脱除N-乙酰氨基半乳糖残基中6与6’位的硅醚基，得到四醇，即式O化合物；

(15)利用式O化合物合成硫酸软骨素四糖；

这里，式A-式O化合物中，Ac为乙酰基；

式C-式O化合物以及R₁OH中，R₁选自未取代的苄基或取代的苄基、C1-C4烷基、或烯丙基；这里，所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₁选自甲基、乙基、烯丙基、苄基，4-甲氧基苄基，更优选地选自甲基、乙基、苄基；

式C-式O化合物、式J-式O化合物中，R₂和R₇各自独立地选自脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；这里，所述脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代、所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₂和R₇各自独立地选自乙酰基、苯甲酰基、4-氯代苯甲酰基、4-溴代苯甲酰基，更优选地选自乙酰基、或苯甲酰基；

式G-式O化合物中，R₃选自-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-，这里n为1-100；脂肪族烷烃亚基；脂肪族烯烃亚基；或-(CH₂CH₂O)m-CH₂-，这里m为1-100；优选地，选自-CH₂CH₂-O-CH₂-；R₄选自叠氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、硫醚；所述取代的氨基是指被保护基保护的氨基、所述保护基选自苄氧羰酰基、叔丁氧羰酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基；优选地，-OR₃-R₄为-O-CH₂CH₂-O-CH₂-N₃；

式I、式J，式K，式L和式M化合物中，R₅选自未取代的苯基或取代的苯基，这里，所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，选自苯基，4-甲氧基苯基，4-氯代苯基或4-溴代苯基，更优选地，选自苯基或4-甲氧基苯基；

式L’、式M’和式N’化合物中，R₈和R₉各自独立地选自C1-C4烷烃基，苯基或取代的苯基，这里，所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₈和R₉各自独立地选自甲基，异丙基或叔丁基；

式E化合物中，X选自氟或氯，优选地为氯；

式A-式B化合物中，M为钠，钾，锂或钙，优选地为钠。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中，透明质酸酶的加入量为式A化合物质量的2.0-3.0％，反应温度为37℃，式A化合物的分子量为1KDa-10,000KDa，优选地为10KDa-1,000KDa；所述弱酸性指缓冲溶液的pH值为3.0-6.5；所述缓冲溶液选自乙酸-乙酸钠缓冲液，乙酸-乙酸钾缓冲液，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液的一种，优选地为乙酸-乙酸钠缓冲液；所述缓冲溶液的浓度为0.01M-1M，优选地，所述缓冲溶液为浓度为0.1M的乙酸-乙酸钠缓冲液；氯化钠在弱酸性缓冲溶液中的浓度为0.05M-0.5M，优选地，为0.15M。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所述无机酸选自氯化氢、硫酸、硝酸、磷酸，优选地，选自氯化氢或硫酸；所述碱性条件指的是选自醋酸钠，吡啶，磷酸二氢钠，碳酸钾，三乙胺或哌啶的碱存在的条件，优选地，指的是选自吡啶或醋酸钠的碱存在的条件。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述碱选自乙二胺、水合肼或3-N,N二甲基氨基丙胺，优选地，选自水合肼或3-N,N二甲基氨基丙胺；所述有机溶剂，选自丙酮、氯仿、四氢呋喃、二氯甲烷、N,N二甲基甲酰胺或N,N二甲基乙酰胺，优选地，选自二氯甲烷、四氢呋喃或N,N二甲基甲酰胺。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述碱选自碱金属的碳酸盐、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，乙酸盐、硼酸盐、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种；优选地，选自碳酸钾、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯中的一种；三卤代乙腈中的卤素选自氟、氯、溴，优选地为氯。

6.根据权利要求1所述发方法，其中，所述步骤(5)中，所述酸选自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化铜、对甲基苯磺酸，或樟脑磺酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(6)中，所述酸选自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化铜、对甲基苯磺酸，樟脑磺酸；优选地，选自氯化铜、三氟甲磺酸C1-C4三烷基取代的硅脂；所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、丙酮或1,2-二氯乙烷中的一种；优选地，为氯仿。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(7)中，所述酸选自氯化氢、硫酸、硝酸、磷酸或三氟化硼乙醚中的一种，优选地，选自氯化氢或三氟化硼乙醚；所述碱选自R₁ONa、R₁OK、NaOH，优选地为R₁ONa，其中，R₁选自未取代的苄基或取代的苄基、C1-C4烷基、或烯丙基；这里，所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₁选自甲基、乙基、烯丙基、苄基，4-甲氧基苄基，更优选地选自甲基、乙基、苄基；

优选地，所述步骤(8)中，所述酸选自对甲基苯磺酸或樟脑磺酸；

优选地，所述步骤(9)中，所述碱性条件指的是选自醋酸钠，吡啶，磷酸二氢钠，碳酸钾，三乙胺或哌啶的碱存在的条件，优选地，指的是选自吡啶或醋酸钠的碱存在的条件；

优选地，所述步骤(10)中，所述酸选自三氟乙酸、乙酸、硼酸中的一种，优选地，为三氟乙酸；所述还原剂选自三烷基取代的硅烷、氰基硼氢化钠、硼烷，优选地，选自三烷基取代的硅烷或氰基硼氢化钠；

优选地，所述步骤(11)中，所述氧化剂选自戴斯-马丁氧化剂、酸酐-二甲基亚砜的组合、草酰氯-二甲基亚砜-三乙胺的组合、三氟乙酸酐-二甲基亚砜-三乙胺的组合或二氧化锰；优选地，为戴斯-马丁氧化剂；

优选地，所述步骤(12)中，所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钾或烷基取代的硼氢化盐；优选地，选自三异丁基硼氢化钾或硼氢化钠；

优选地，所述步骤(13)中，所述氧化剂选自DDQ或硝酸铈铵；所述还原剂选自三乙基硅烷与单质碘的组合、或三乙基硅烷与一氧化碳与八羰基二钴的组合；

优选地，所述步骤(10a)中，所述酸选自三氟乙酸、乙酸、硼酸中的一种，优选地，为乙酸；

优选地，所述步骤(11a)中，所述取代的氯硅烷选自叔丁基二苯基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷、二甲基苯基氯硅烷或三甲基氯硅烷；优选地，为叔丁基二甲基氯硅烷；所述碱选自三乙胺、吡啶或4-二甲氨基吡啶；优选地，为吡啶；

优选地，所述步骤(12a)中，所述氧化剂选自草酰氯-二甲基亚砜-三乙胺的组合、乙酸酐-二甲基亚砜的组合、二氧化锰或戴斯-马丁高碘试剂；优选地为戴斯-马丁高碘试剂；

优选地，所述步骤(13a)中，所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钾或烷基取代的硼氢化盐；优选地，选自三异丁基硼氢化钾或硼氢化钠；

优选地，所述步骤(14)中，所述酸选自对甲苯磺酸或三氟乙酸，优选地为对甲苯磺酸；所述氟离子试剂选自四丁基氟化铵，氟化氢吡啶络合物，氟化氢三乙胺络合物或氟化铵；优选地为氟化氢吡啶络合物。

9.用于合成硫酸软骨素四糖的中间体化合物，包括如下的式D-式N’化合物：

其中，R₁,R₂,R₃,R₄,R₅,R₇,R₈,R₉的定义如权利要求1中所述。

10.如权利要求9所述的中间体化合物，包括：

(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖；

O-(((2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亚胺酯；

O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1,2-二脱氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-对甲氧亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-对甲氧基亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-对甲氧亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-对甲氧亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-4-酮-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-4-酮-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]丁烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-4-酮-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-4-酮-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷；和

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷。

说明书

技术领域

本申请属于化学技术领域，更具体地说，涉及硫酸软骨素四糖的合成方法及其中间体化合物。

背景技术

硫酸软骨素是体内广泛存在的一种糖胺聚糖，其结构由葡萄糖醛酸与N-乙酰氨基半乳糖构成，在其结构中羟基可存在不同程度的硫酸化，因而称之为硫酸软骨素。硫酸软骨素与细胞外基质中的蛋白共价结合形成蛋白聚糖，广泛分布于细胞间隙，是一种十分重要的糖胺聚糖。硫酸软骨素参与了体内很多极为重要的生化过程，例如：参与了细胞-细胞相互作用，抑制神经轴突的再生，影响癌细胞的扩散与转移，与细胞外众多细胞因子发生结合等。

近年来，人们发现硫酸软骨素的不同亚型，即在特定羟基上具有不同硫酸化修饰的硫酸软骨素A，C，E可介导不同的生理学功能。例如，硫酸软骨素E可显著性抑制背根神经节细胞轴突的生长，而硫酸软骨素A和C则无此作用。为研究不同硫酸化位点与硫酸化数目对硫酸软骨素生物学功能的影响，需首先解决这些具有特定硫酸化方式的硫酸软骨素的可获得性问题。传统的通过从天然来源提取，例如从动物的软骨中提取，只能获得不同类型硫酸软骨素的混合物，进一步的分离纯化难以进行。这些提取物可以满足一定程度的药物化学研究需要，例如可用于骨关节病的治疗等。然而，具有不同硫酸化位点的混合物并不能满足更深层次的药化研究。因此，化学合成是目前获取有明确硫酸化位点，且结构均一的能够进行更深层次的生物学与药化研究的硫酸软骨素的唯一有效的方法。

现有技术中，通过化学手段合成硫酸软骨素常以葡萄糖醛酸以及N-乙酰氨基半乳糖或N-乙酰氨基葡萄糖单糖为原料，通过常规的保护基保护还有糖基化操作来进行寡糖的组装(Jean-Claude Jacquinet et al,From Polymer to Size-Defined Oligomers:A Highly Divergent and Stereocontrolled Construction of Chondroitin Sulfate A,C,D,E,K,L,and M Oligomers from a Single Precursor:Part 2.Chem.Eur.J.2009,15,9579-9595.)。这样的策略合成步骤多，路线长，由于涉及糖基化操作而导致整条路线的收率偏低。目前，仅合成硫酸软骨素四糖就需要约23步反应，收率不足1％。因此，开发新的硫酸软骨素寡糖的化学合成方法，对于促进硫酸软骨素的药化研究具有重要意义。

目前，在硫酸软骨素的合成后期均需涉及到对已经构建好的寡糖骨架上的裸露羟基进行磺酸化以及最后全糖的脱保护。因此，如何快速构建可进行硫酸化修饰的寡糖中间体是亟待解决的问题。本申请的目标即提供这样一种可直接进行后续硫酸化修饰的寡糖中间体的合成方法。

发明内容

本申请的发明人以较易生产、较易提取得到的透明质酸钠为原料，通过对原料进行水解、化学修饰得到了可用于硫酸软骨素A，C，E三种四糖合成的关键中间体，克服了现有技术存在的不足。

本申请的第一个目的是提供一种硫酸软骨素四糖的合成方法。

本申请的第二个目的是提供用于上述合成方法的中间体化合物。

在本申请的实施方案中，提供了一种硫酸软骨素四糖的合成方法，所述方法包括硫酸软骨素四糖关键中间体的合成，包括如下步骤：

(1)式A化合物(即透明质酸M盐)在含有氯化钠的弱酸性缓冲溶液中，在透明质酸酶的作用下得到式B化合物；这里，所述的透明质酸酶来源于动物睾丸，活力400-1000IU/mg；优选地，选自牛睾丸或绵羊睾丸；更优选地为牛睾丸；

(2)式B化合物在无机酸的醇R₁OH溶液中进行酯化反应，对式B化合物的羧基进行酯化；而后利用酸酐R₂-O-R₂，在碱性条件下对式B化合物其余的所有羟基进行酰化保护，得到式C化合物；

这里，酸酐R₂-O-R₂中，R₂选自脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；

(3)式C化合物在碱存在下，在有机溶剂中选择性脱除还原端N-乙酰氨基葡萄糖的1位羟基，得到式D化合物；

(4)式D化合物在碱催化下，与三卤代乙腈反应，得到端基含亚胺酯的式E化合物；

(5)式E化合物在酸催化下得到式F化合物

(6)式F化合物在酸存在下，在有机溶剂中，与醇R₄-R₃OH反应，得到式G化合物；

这里，醇R₄-R₃OH中R₃选自-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)n-，n为1-100，脂肪族烷烃亚基，脂肪族烯烃亚基，或-CH₂-(OCH₂CH₂)m-，这里m为1-100；优选地，R₃为-CH₂-O-CH₂CH₂-；R₄选自叠氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、硫醚，所述取代的氨基是指被保护基保护的氨基，所述保护基选自苄氧羰酰基、叔丁氧羰酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基；优选地，R₄-R₃OH为N₃-CH₂-OCH₂CH₂-OH；

(7)式G化合物在酸或碱的醇R₁OH溶液中，脱去式G化合物上所有的R₂，得到式H化合物；

(8)式H化合物在R₅CHO或R₅CHO缩二脂肪醇的存在下，在酸催化下选择性保护式H化合物的4,6二羟基与4′,6′二羟基，得到式I化合物；

这里，R₅CHO或R₅CHO缩二脂肪醇(例如R₅CH(OCH₃)₂)中的R₅选自苯基或取代的苯基；

(9)式I化合物在酰卤R₇X或酸酐R₇-O-R₇的作用下，在碱性条件下进行酰化，得式J化合物；

这里，酰卤R₇X或酸酐R₇-O-R₇中的R₇选自C1-C4脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；酰卤R₇X中的X选自氯、溴或碘，优选地，选自氯或溴；

(10)式J化合物在酸与还原剂的存在条件下，选择性裸露4位羟基，使得6位为R₅-CH₂-保护，得到式K化合物；

(11)式K化合物在氧化剂存在条件下，对4,4′位羟基进行氧化，得到式L化合物；

(12)式L化合物在还原剂存在条件下，选择性将式L化合物中的4与4′位的两个酮羰基还原为醇，而且两个新生成的羟基的构型与步骤(11)中式K的两个羟基构型相反，得到半乳糖构型的式M化合物；

(13)式M化合物在氧化剂或还原剂作用下，脱除6与6’位的两个苄基或取代的苄基，得到四醇，即式O化合物；

或者，将步骤(10)-(13)用下述的步骤(10a)-(14)替换：

(10a)式J化合物在酸的存在条件下，水解两个亚苄基或取代的亚苄基，得到式K’化合物；

(11a)式K’化合物在氯硅烷R₈R₈R₉SiCl与碱的存在下，区域选择性地对两个N-乙酰氨基葡萄糖的6,6’位羟基进行硅烷化，得到式L’化合物；

(12a)式L’化合物在氧化剂存在条件下，选择性地将式L’化合物中的两个N-乙酰氨基葡萄糖的4与4’位的羟基氧化为酮羰基，得到式M’化合物；

(13a)式M’化合物在还原剂存在条件下将N-乙酰氨基葡萄糖的4与4’位的酮羰基立体选择性的还原为直立键羟基，得到式N’化合物；

(14)式N’化合物在酸或氟离子试剂的存在下脱除N-乙酰氨基半乳糖残基中6与6’位的硅醚基，得到四醇，即式O化合物；

(15)利用式O化合物合成硫酸软骨素四糖；

这里，式A-式O化合物中，Ac为乙酰基；

式C-式O化合物以及醇R₁OH中，R₁选自未取代的苄基或取代的苄基、C1-C4烷基、或烯丙基；这里，所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₁选自甲基、乙基、烯丙基、苄基，4-甲氧基苄基，更优选地选自甲基、乙基、苄基；

式C-式G化合物、式J-式O化合物中，R₂和R₇各自独立地选自脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；这里，所述脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、正戊酰基、新戊酰基或正己酰基)，所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₂和R₇各自独立地选自乙酰基、苯甲酰基、4-氯代苯甲酰基、4-溴代苯甲酰基，更优选地选自乙酰基、或苯甲酰基；

式G-式O化合物中，R₃选自-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-，这里n为1-100；脂肪族烷烃亚基；脂肪族烯烃亚基；或-(CH₂CH₂O)m-CH₂-，这里m为1-100；优选地，选自-CH₂CH₂-O-CH₂-；R₄选自叠氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、硫醚；所述取代的氨基是指被保护基保护的氨基、所述保护基选自苄氧羰酰基、叔丁氧羰酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基；优选地，-OR₃-R₄为-O-CH₂CH₂-O-CH₂-N₃；

式I、式J、式K、式L和式M化合物中，R₅选自未取代的苯基或取代的苯基，这里，所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，选自苯基、4-甲氧基苯基、4-氯代苯基、4-溴代苯基，更优选地，选自苯基或4-甲氧基苯基；

式L’、式M’和式N’化合物中，R₈和R₉各自独立地选自C1-C4烷烃基，苯基或取代的苯基；这里，所述C1-C4烷烃基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₈和R₉各自独立地选自甲基、异丙基或叔丁基或苯基；

式E化合物中，X选自氟或氯，优选地为氯；

式A-式B化合物中，M为钠、钾、锂或钙，优选地为钠。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(1)中，透明质酸酶的加入量为透明质酸钠质量的2.0-3.0％，反应温度为37℃，式A化合物的分子量为1KDa-10,000KDa，优选地为10KDa-1,000KDa；所述弱酸性指缓冲溶液的pH值为3.0-6.5，优选地为5.0-5.2；所述缓冲溶液选自乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钾缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液的一种，优选地为自乙酸-乙酸钠缓冲液；所述缓冲液的浓度选为0.01M-1M；优选地，所述缓冲溶液为浓度为0.1M的乙酸-乙酸钠缓冲液；氯化钠在弱酸性缓冲溶液中的浓度为0.05M-0.5M，优选地为0.15M；所述透明质酸酶选自动物睾丸来源的透明质酸酶，例如从Sigma-Aldrich公司购买的牛睾丸来源的透明质酸酶。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(2)中，所述无机酸的选自氯化氢、硫酸、硝酸、磷酸，优选地，选自氯化氢或硫酸；醇R₁OH中R₁如上所述；所述碱性条件指的是选自醋酸钠，吡啶，磷酸二氢钠，碳酸钾，三乙胺或哌啶的碱存在的条件，优选地，指的是选自吡啶或醋酸钠的碱存在的条件。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(3)中，所述碱选自乙二胺、水合肼或3-N,N二甲基氨基丙胺，优选地，选自水合肼或3-N,N二甲基氨基丙胺；所述有机溶剂选自丙酮、氯仿、四氢呋喃、二氯甲烷、N,N二甲基甲酰胺或N,N二甲基乙酰胺，优选地，选自二氯甲烷、四氢呋喃或N,N二甲基甲酰胺。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(4)中，所述碱选自碱金属的碳酸盐、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)，乙酸盐、硼酸盐、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种；优选地，选自碳酸钾或1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)中的一种；所述三卤代乙腈中的卤素选自氟、氯、溴，优选地为氯。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(5)中，所述酸选自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化铜、对甲基苯磺酸，或樟脑磺酸。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(6)中，所述酸选自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化铜、对甲基苯磺酸，樟脑磺酸；优选地，选自氯化铜、三氟甲磺酸C1-C4三烷基取代的硅脂；所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、丙酮或1,2-二氯乙烷中的一种；优选地为氯仿。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(7)中，所述酸选自氯化氢、硫酸、硝酸、磷酸或三氟化硼乙醚中的一种，优选地，选自氯化氢或三氟化硼乙醚；所述碱选自R₁ONa、R₁OK或NaOH，优选地为R₁ONa，其中，R₁选自未取代的苄基或取代的苄基、C1-C4烷基、或烯丙基；这里，所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₁选自甲基、乙基、烯丙基、苄基，4-甲氧基苄基，更优选地选自甲基、乙基、苄基。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(8)中，所述酸选自对甲基苯磺酸或樟脑磺酸。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(9)中，所述碱性条件指的是选自醋酸钠、吡啶、磷酸二氢钠、碳酸钾、三乙胺或哌啶的碱存在的条件，优选地，指的是选自吡啶或醋酸钠的碱存在的条件。

在本申请提供的硫酸软骨素的合成方法中，所述步骤(10)中，所述酸选自三氟乙酸、乙酸、硼酸中的一种，优选地为三氟乙酸；所述还原剂选自三烷基取代的硅烷(例如三乙基硅烷、三异丙基硅烷、叔丁基二甲基硅烷、苯基二甲基硅烷)、氰基硼氢化钠、硼烷；优选地，选自三烷基取代的硅烷(例如三乙基硅烷、三异丙基硅烷、叔丁基二甲基硅烷、苯基二甲基硅烷)或氰基硼氢化钠。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(11)中，所述氧化剂选自戴斯-马丁氧化剂、酸酐-二甲基亚砜的组合、草酰氯-二甲基亚砜-三乙胺的组合、三氟乙酸酐-二甲基亚砜-三乙胺的组合或二氧化锰；优选地，为戴斯-马丁氧化剂；

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(12)中，所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钾、烷基取代的硼氢化盐(例如：三异丁基硼氢化钾或三异丁基硼氢化锂)；优选地，选自三异丁基硼氢化钾或硼氢化钠。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(13)中，所述氧化剂选自DDQ或硝酸铈铵；所述还原剂选自三乙基硅烷与单质碘的组合、或三乙基硅烷与一氧化碳与八羰基二钴的组合。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(10a)中，所述酸选自三氟乙酸、乙酸、硼酸中的一种，优选地，为乙酸。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(11a)中，所述取代的氯硅烷R₈R₈R₉SiCl选自叔丁基二苯基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷、二甲基苯基氯硅烷或三甲基氯硅烷；优选地，为叔丁基二甲基氯硅烷；所述碱选自三乙胺、吡啶或4-二甲氨基吡啶，优选地，为吡啶。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(12a)中，所述氧化剂选自草酰氯-二甲基亚砜-三乙胺的组合、乙酸酐-二甲基亚砜的组合、二氧化锰或戴斯-马丁高碘试剂；优选为戴斯-马丁高碘试剂。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，所述步骤(13a)中，所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钾或烷基取代的硼氢化盐(例如：三异丁基硼氢化钾或三异丁基硼氢化锂)；优选的，选自三异丁基硼氢化钾或硼氢化钠。

在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中,所述步骤(14)中，所述酸选自对甲苯磺酸或三氟乙酸，优选为对甲苯磺酸；所述氟离子试剂选自四丁基氟化铵、氟化氢吡啶络合物、氟化氢三乙胺络合物或氟化铵；优选地为氟化氢吡啶络合物。

本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法，在得到式O化合物后，进一步地包括如下步骤之一：

(i)1当量式O化合物在20-100当量的三氧化硫有机碱复合物的存在下对其上的羟基进行磺酸酯化，而后在碱性条件下脱去保护基得到硫酸软骨素E四糖，即式CS-E化合物；

(ii)1当量式O化合物在5-15当量的三氧化硫有机碱复合物的存在下对N-乙酰氨基半乳糖残基上的6与6‘位的两个羟基进行区域选择性磺酸酯化，而后在碱性条件下脱去保护基得到硫酸软骨素C四糖，即式CS-C化合物；

(iii)式O化合物与氰基苯甲酰在有机碱的作用下对N-乙酰氨基半乳糖残基上的6与6‘位的两个羟基进行区域选择性苯甲酰化，而后三氧化硫有机碱复合物的存在下对4与4’位的羟基进行磺酸酯化，再在碱性条件下脱去保护基得到硫酸软骨素A四糖，即式CS-A化合物；

这里，步骤(i)、(ii)和(iii)中的三氧化硫有机碱复合物选自三氧化硫吡啶复合物、三氧化硫三乙胺复合物或三氧化硫三甲胺复合物，优选地，为三氧化硫三甲胺复合物。所述碱性条件指的是下列碱存在的条件：氢氧化钠或其与过氧化氢的混合溶液、氢氧化钾或其与过氧化氢的混合溶液、氢氧化锂或其与过氧化氢的混合溶液，优选地选自氢氧化锂或其与过氧化氢的混合溶液。

此外，在本申请提供的硫酸软骨素四糖的合成方法中，在得到式O化合物后，可参考现有技术的教导(参考文献：Jean-Claude Jacquinet et al,From Polymer to Size-Defined Oligomers:A Highly Divergent and Stereocontrolled Construction of Chondroitin Sulfate A,C,D,E,K,L,and M Oligomers from a Single Precursor:Part 2.Chem.Eur.J.2009,15,9579-9595.)制备硫酸软骨素四糖A、C或E。

本申请还提供了用于合成硫酸软骨素四糖的中间体化合物，选自式D-式N’化合物中的一种：

这里，式D-式N’化合物中，Ac为乙酰基；

式D-式N’化合物中，R₁选自未取代的苄基或取代的苄基、C1-C4烷基、或烯丙基；这里，所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₁选自甲基、乙基、烯丙基、苄基，4-甲氧基苄基，更优选地选自甲基、乙基、苄基；

式D-式N’化合物中，R₂和R₇各自独立地选自脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；这里，所述脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、正戊酰基、新戊酰基或正己酰基)；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代、所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₂和R₇各自独立地选自乙酰基、苯甲酰基、4-氯代苯甲酰基、4-溴代苯甲酰基，更优选地选自乙酰基、或苯甲酰基；

式G-式N’化合物中，R₃选自-(CH₂CH₂)n-O-CH₂CH₂-，这里n为1-100；脂肪族烷烃亚基；脂肪族烯烃亚基；或-(CH₂CH₂)n-O-CH₂-，这里n为1-100；优选地，选自-CH₂CH₂-O-CH₂-；R₄选自叠氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、硫醚；所述取代的氨基是指被保护基保护的氨基，所述保护基选自苄氧羰酰基、叔丁氧羰酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基；优选地，OR₃-R₄为-O-CH₂CH₂-O-CH₂-N₃；

式I、式J、式K、式L和式M化合物中，R₅选自未取代的苯基或取代的苯基，这里，所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，选自苯基，4-甲氧基苯基，4-氯代苯基、4-溴代苯基，更优选地，选自苯基，4-甲氧基苯基；

式L’、式M’和式N’化合物中，R₈和R₉各自独立地选自C1-C4烷烃基，苯基或取代的苯基；这里，所述C1-C4烷烃基是指甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R₈和R₉各自独立地选自甲基，异丙基，叔丁基。

式E化合物中，X选自氟或氯，优选地为氯。

本申请提供的用于合成硫酸软骨素四糖的中间体化合物，包括：

(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖；

O-(((2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亚胺酯；

O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1,2-二脱氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-对甲氧亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-对甲氧基亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-对甲氧亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-对甲氧亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-4-酮-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-4-酮-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；

1-叠氮-2-氧杂-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-对甲氧苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]丁烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-4-酮-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-4-酮-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷；

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷；和

1-叠氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷。

本申请以较易生产、较易提取得到的透明质酸钠为原料，通过廉价的动物睾丸来源的透明质酸酶对原料进行水解，得到可用于之后进行化学修饰的四糖骨架，而后对其进行常规的保护基操作从而合成可用于硫酸软骨素A,C,E三种四糖合成的关键中间体，整条路线无需进行糖基化操作，反应路线短，收率高，且可具有叠氮基，便于后期利用click反应进行标记，可规模化生产硫酸软骨素及其衍生物；另一方面，通过适当的条件优化及纯化方式选择，可获取纯度较高的样品用于研究，便于硫酸软骨素的药化探索。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步地说明本申请的可实施性，并非对本申请保护范围的限制。

检测仪器：

核磁：Bruker AV-400型核磁共振仪，溶剂为CDCl₃,CD₃OD,TMS为内标。

质谱：Bruker APEX IV型质谱仪。

缩略语：

CH₂Cl₂为二氯甲烷

EtOAc为乙酸乙酯

MeOH为甲醇

DMF为N,N-二甲基甲酰胺

DMP:戴斯-马丁试剂

HRMS:高分辨质谱

ESI:电喷雾质谱

实施例1：(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖二钠盐的合成

取透明质酸干粉(分子量约50万)51.0g置于2500mL的pH＝5.00的含0.15M氯化钠的0.10M乙酸钠-乙酸缓冲液中，在剧烈搅拌下使透明质酸在室温下充分溶胀(约需72h)为无色，均一的粘稠胶状液体。利用恒温水浴使该胶状液体升温至37.0℃,此时加入1.0g透明质酸酶干粉(购买自Sigma-Aldrich公司，货号H-3506，Lot#SLBL1922V)，并于37.0℃下搅拌两周。反应结束将反应液升温至沸，并在105℃搅拌15min，待溶液不再继续浑浊后将其迅速冷却至室温，并与1/20体积的无水乙醇混合后减压蒸馏，浓缩至干得白色糖浆。之后将此糖浆用少量蒸馏水溶解并缓慢滴入3000mL剧烈搅拌的绝对乙醇中析出白色沉淀，以减压过滤的方法在空气相对湿度不超过50％的环境中收集所析出的沉淀，并用少量冷的绝对乙醇洗涤滤饼，而后将收集得到的固体粉末在盛有无水氯化钙的干燥器中减压干燥至恒重，得96.0g白色无定形粉末状固体。该粗产物可直接用于下步合成，无需进一步纯化。为确定反应的产物结构及收率，200mg粗产品经LH-20葡聚糖凝胶柱(柱高×柱直径＝100cm×2cm)纯化，以蒸馏水洗脱，得到题述四糖产物60mg,与文献P.Litant et al.Carbohydr.Res.237(1992)271-281所提供¹H NMR谱图比较完全相同。

实施例2：(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-1,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖的合成

将(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖二钠盐粗品96.0g溶于12L,0.08M的新制冷的氯化氢甲醇溶液中。而后将反应液于4℃静置96h。反应结束后将反应液用三乙胺中和至中性，而后减压蒸馏，并浓缩至干。加入吡啶405mL，冷却至0℃，缓慢滴加乙酸酐230mL后将反应液缓慢升至室温，并于室温下搅拌24h。待反应结束后，将反应液在冰水浴中冷却，缓慢滴加甲醇170mL，并于该温度下搅拌1h，将反应液减压蒸馏浓缩得棕黄色糖浆。将此糖浆溶于2.5L EtOAc中，减压过滤除去不溶物，有机相依次用400mL的1M盐酸水溶液洗涤3次，水相用400mL EtOAc萃取三次。合并有机相，并依次用600mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2次，600mL饱和食盐水洗涤1次。将有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，所得粗品用二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝1:1:0.06至1:1:0.14(洗脱剂含0.1％三乙胺)快速硅胶柱层析纯化，得32.6g白色无定形固体。自实施例1中的透明质酸钠为原料，三步收率42％。

R_f＝0.38(SiO₂,CH₂Cl₂:EtOAc:MeOH＝1:1:0.18)。

¹H NMR表明产物为α：β＝3:1的混合物。

HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值1225.3777,实测值[M+H]⁺：1225.3750。

实施例3：(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖的合成

取(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-1,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖30.2g(24.6mmol)溶于240mL四氢呋喃中，在搅拌下缓慢滴加15.5mL(90.7mmol)3-N,N-二甲基-氨基丙胺，并于室温下搅拌3h。将反应液用650mL氯仿稀释，有机相用150mL的1M盐酸溶液洗涤3次，水相用150mL氯仿萃取3次，合并有机相，用230mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤1次，饱和食盐水洗涤1次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得25.5g淡黄色无定形粉末，收率88％。粗产物无需进一步纯化，即可用于下面的反应。

实施例4：O-(((2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亚胺酯的合成

取干燥的(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖粗品7.0g(6.0mmol)溶于60mL干燥二氯甲烷中，加入三氯乙腈6.7mL(60mmol)，将此混合物在氩气气氛下于冰水浴中冷却。之后缓慢滴加1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)149μL(0.9mmol)。反应液于0℃下搅拌2.5h。待反应完成后将反应液减压浓缩，并用硅胶快速柱色谱纯化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝3：1：0.10，含0.1％三乙胺)得5.5g白色无定形固体，收率79％。

R_f＝0.48(SiO₂,CH₂Cl₂:EtOAc:MeOH＝1:1:0.12)；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.83(s,1H,C＝NH),6.23(d,J＝3.7Hz,1H),5.84(d,J＝7.5Hz,1H),5.77(d,J＝9.6Hz,1H),5.21(dd,J＝J＝9.3Hz,1H),5.15-5.07(m,3H),4.90(dd,J＝J＝9.4Hz,1H),4.83-4.73(m,4H),4.63(d,J＝7.8Hz,1H),4.59(ddd,J＝10.1Hz,3.8Hz,3.8Hz,1H),4.43(dd,J＝J＝9.7Hz,1H),4.29(dd,J＝4.2Hz,12.4Hz,1H),4.18(dd,J＝4.2Hz,12.5Hz,1H),4.12-3.85(m,11H),3.72(s,3H),3.66-3.64(m,1H),3.14(ddd,J＝17.4Hz,8.0Hz,8.0Hz,1H),2.08-2.01(m,33H,COCH₃)。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ171.0,170.8,170.2,170.1,169.8,169.8,169.7,169.4,169.2,169.1,167.9,167.0,160.2,100.9,100.0,98.7,95.3,90.8,77.3,76.8,75.8,74.9,72.3,72.1,71.8,71.8,71.7,71.6,70.2,69.4,68.0,67.7,61.8,61.7,57.7,53.0,52.8,51.8,23.6,23.2,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5,20.5。

HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值1326.2768,实测值[M+H]⁺：1326.2738。

实施例5：O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1,2-二脱氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉

取干燥的O-(((2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亚胺酯9.0g(6.8mmol)溶于80mL干燥二氯甲烷中，并于氩气气氛下在冰水浴中冷却。缓慢滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯182μL(1.02mmol)。反应液于0℃下搅拌0.5h。待反应完成后滴加150μL三乙胺淬灭反应。将反应液减压浓缩至干，并用硅胶快速柱色谱纯化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝3：1：0.15，含0.1％三乙胺)得7.1g白色无定形固体，收率90％。

R_f＝0.34(SiO₂,CH₂Cl₂:EtOAc:MeOH＝1:1:0.18)；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.92(d,J＝6.6Hz,1H),5.82(d,J＝7.3Hz,1H),5.20(dd,J＝J＝9.3Hz,1H),5.12(dd,J＝J＝9.0Hz,1H),5.06(dd,J＝J＝9.2Hz,1H),4.92-4.78(m,6H),4.65(d,J＝7.8Hz,1H),4.60(d,J＝7.8Hz,1H),4.52(m,1H),4.41-4.30(m,2H),4.20(dd,J＝4.2Hz,12.5Hz,1H),4.12-3.92(m,6H),3.82(s,3H),3.71-3.63(m,11H),3.41(m,2H),3.30(m,1H),3.01(m,1H),2.06-1.96(m,33H).

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ171.2(2C),170.8,170.2,170.1,169.8,169.8,169.7,169.4,169.2,169.1,167.9,167.0,100.7,100.0,99.4,98.3,77.9,76.7,75.6,74.5,72.3,72.2,72.2,71.9,71.8,71.7,71.6,70.4,69.9,69.4,68.9,68.5,68.1,62.4,62.0,58.1,57.5,52.9,52.7,50.7,23.6,23.4,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5,20.5；

HRMS(ESI):计算值[M+H]⁺:1165.3566,实测值[M+H]

硫酸软骨素四糖的合成方法及其中间体化合物专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。