专利摘要

专利摘要

本发明公开了一种杠柳苷元及其衍生物用于防治皮肤增生性疾病的应用，特别的所述的杠柳苷元及其衍生物作为制备防治皮肤增生性疾病药物组合物中的应用，所述的药物组合物制成胶囊、片剂、乳剂、霜剂、凝胶剂或膏剂，含有杠柳苷元及其衍生物的重量含量为1～99％。杠柳苷元及其衍生物均通过抑制人皮肤异常增殖细胞增殖，效果显著，安全性好。

权利要求

1.杠柳苷元及其衍生物在制备用于防治银屑病药物中的应用，其特征在于，所述的杠柳苷元及其衍生物结构通式如下所示：

其中，R1为羟基，R2为氢，R3为甲基，R4为氢，R5为氢，此化合物为杠柳苷元；

或R1为羟基，R2为羟基，R3为羟基，R4为羟基，R5为氢，此化合物为毒毛花苷；

或R1为羟基，R2为氢，R3为羟基，R4为氢，R5为氢，此化合物为17α-羊角拗醇；

或R1为羟基，R2为氢，R3为羧基，R4为氢，R5为氢，此化合物为17α-3,5,14-三羟基-20(22)-烯醇-19-羧酸；

或R1为乙酰氧基，R2为氢，R3为羟基，R4为氢，R5为氢，此化合物为17α-3-乙酰氧-5,14,19-三羟基-20(22)-烯醇；

或R1为乙酰氧基，R2为氢，R3为羟基，R4为氢，R5为氢，此化合物为3-乙酰氧-5,14-二羟基-20(22)-烯醇；

或R1为乙酰氧基，R2为氢，R3为甲基，R4为氢，R5为氢，此化合物为3-乙酰氧-17α-毒毛旋花子甙元；

或R1为乙酰氧基，R2为乙酰氧基，R3为乙酰氧基，R4为乙酰氧基，R5为氢，此化合物为1,3,11,19-四乙酰氧毒毛花苷；

或R1为乙酰氧基,R2为羟基，R3为乙酰氧基，R4为乙酰氧基，R5为氢，此化合物为3,11,19-三乙酰氧毒毛花苷；

或R1为乙酰氧基，R2为氢，R3为乙酰氧基，R4为氢，R5为氢，此化合物为3,19-二乙酰氧羊角拗醇；

或R1为乙酰氧基，R2为羟基，R3为羟基，R4为乙酰氧基，R5为氢，此化合物为3β，11α-二乙酰氧毒毛花苷；

或R1为6-甲基-5-羟基-4-甲氧基吡喃氧基，R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢，此化合物为毒毛花苷K；

或R1为6-脱氧-α-L-鼠李糖氧基,R2为羟基，R3为羟基，R4为羟基，R5为氢，此化合物为毒毛旋花苷G；

或R1为2,6-脱氧-3-甲氧基-β-D-核-己吡喃糖氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢，此化合物为毒毛旋花苷K；

或R1为6-脱氧-α-L-鼠李糖氧基，R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢，此化合物为K-毒毛旋花子配质-3-L-鼠李糖甙；

或R1为6-甲基-3,4,5-三羟基吡喃氧基，R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢，此化合物为铃兰毒甙；

或R1为6-甲基-3,4,5-三羟基吡喃氧基，R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为羟基，此化合物为β-箭努子苷；

或R1为6-甲基-3,5-二羟基-4-甲氧基吡喃氧基，R2为氢，R3为甲基，R4为氢，R5为氢，此化合物为羊角拗苷；

或R1为6-脱氧-2,3-二甲氧基-D-吡喃葡萄糖氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢，此化合物为3-[(6'-脱氧-2',3'-二甲氧基-D-吡喃葡萄糖)氧基]-5,14-二羟基-19-氧基-20(22)-烯醇；

或R1为2,4-二乙酰氧-6-脱氧-3-甲氧基-D-吡喃半乳糖氧基，R2为氢，R3为甲基，R4为氢，R5为氢，此化合物为3α，14α-3-[(2',4'-二乙酰氧-6'-脱氧-3'-甲氧基-D-吡喃半乳糖)氧基]-5,14-二羟基-19-氧基-20(22)-烯醇；

或R1为4-乙酰氧-6-脱氧-2,3-二甲氧基-D-吡喃葡萄糖氧基，R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢，此化合物为3-[(4'-乙酰氧-6'-脱氧-2',3'-二甲氧基-D-吡喃葡萄糖)氧基]-5,14-二羟基-19-氧基-20(22)-烯醇；

或R1为6-氧-(6'-脱氧-2',3'-二甲氧基-D-吡喃半乳糖)-D-吡喃葡萄糖氧基，R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢，此化合物为3-{[6'-氧-(6”-脱氧-2”,3”-二甲氧基-D-吡喃半乳糖)-D-吡喃葡萄糖]氧基}-5,14-二羟基-19-氧基-20(22)-烯醇；

或R1为6-甲基-3,4,5-三羟基吡喃氧基，R2为羟基，R3和R4为五元内酯，R5为氢，此化合物为旋花羊角拗；

或R1为苯甲酰氧基，R2为氢，R3为甲氧羰基，R4为氢，R5为氢，此化合物为17α-3-苯甲酰氧-5,14-二羟基-20(22)-烯醇-19-羧酸甲酯。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杠柳苷元及其衍生物作为制备防治银屑病药物组合物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物组合物制成胶囊、片剂、乳剂、霜剂、凝胶剂或膏剂。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物组合物含有杠柳苷元及其衍生物的重量含量为1～99％。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种杠柳苷元及其衍生物用于防治皮肤增生性疾病的应用。

背景技术

皮肤增生性疾病是指皮肤细胞在内、外源因素刺激下进行的良性增生，所包括的疾病有银屑病、寻常疣、甲周疣、脂溢性角化病、扁平疣、跖疣、黑色素痣、老年斑和血管瘤，发病部位主要在四肢，其次在面部和躯干部，平均每例有3处皮损。皮肤增生性疾病一般不会对身体健康造成严重危害，但是可以导致疼痛、容貌损害，甚至行动障碍，对患者产生很大的困扰(Joseph S.Mclaughlin,Adam B.Shafritz,MD.Cutaneous Warts[J].JHS,2011,36:342-344.)。皮肤增生性疾病发病年龄主要分布在11-50岁之间，对群体的危害很普遍。

目前，我国治疗银屑病的主要药物有甲氨蝶呤、维A酸类、环孢菌素、糖皮质激素、焦油、蒽酚、柳氮磺胺嘧啶类、维生素D3类似物、他扎罗汀、依那西普、英夫利昔或地塞米松等。但这些药物存在不少缺点：使皮肤的表皮和真皮变薄并引起毛细血管扩张等毒副作用；只能快速控制进行期患者的症状，不能有效延长患者的缓解期；生物制剂如依那西普和英夫利昔等价格昂贵。治疗银屑病的主要技术有激光手术、液氮冷冻等疗法，但手术治疗周期长，对皮肤有伤害，且留有疤痕。传统中药治疗银屑病历史悠久，主要有雷公藤、昆明山海棠、青黛丸、郁金银屑片、银屑灵、银屑冲剂等，这些中药具有改善病情、延长缓解期、费用低廉且副作用小等特点，但疗效较为缓慢，治愈率低，复发率高。故目前中西医医治该病都没有疗效确切的药物。

杠柳苷元(periplogenin)是从杠柳根皮中提取、分离、纯化得到的一种强心苷类，分子式C23H34O5，分子量390.5131，CAS号为514-39-6，有强心、抗炎和抗肿瘤等药理作用，对体外培养的多种肿瘤细胞如人乳腺癌MCF-7细胞、人胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞、人肺癌A549细胞、人结肠癌LOVO细胞、人肝癌HepG2细胞均具有显著的细胞毒性,半数抑制浓度介于0.146-1.150μg/m l之间,并且有明显的时间和剂量依赖性，荷瘤动物实验表明,杠柳苷元可显著延长荷腹水瘤小鼠的存活时间，抑制实体瘤的生长(韩于博，赵爱国.杠柳苷元的抗肿瘤作用.中国小儿血液与肿瘤志.2008年，13(1)：1-5.)。总之，以往对于杠柳苷元药理作用的认识主要集中在其抗肿瘤作用和抗炎作用，但本发明发现杠柳苷元及其衍生物对人皮肤异常增殖细胞的增殖具有抑制作用，而且对心得安诱导的豚鼠银屑病模型具有较好的治疗作用，但对皮下结缔组织细胞A9则无抑制作用，因而可以治疗皮肤增生性疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杠柳苷元及其衍生物的新的医学用途，用于制备可应用于治疗皮肤增生性疾病的制剂。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种杠柳苷元及其衍生物用于防治皮肤增生性疾病的应用。

本发明所述的杠柳苷元及其衍生物作为制备防治皮肤增生性疾病药物组合物中的应用，所述的杠柳苷元及其衍生物结构通式如下所示：

其中R1为羟基,R2为氢，R3为甲基，R4为氢，R5为氢；

或R1为羟基,R2为羟基，R3为羟基，R4为羟基，R5为氢；

或R1为羟基,R2为氢，R3为羟基，R4为氢，R5为氢；

或R1为羟基,R2为氢，R3为羧基，R4为氢，R5为氢；

或R1为乙酰氧基,R2为氢，R3为羟基，R4为氢，R5为氢；

或R1为乙酰氧基,R2为氢，R3为羟基，R4为氢，R5为氢；

或R1为乙酰氧基,R2为氢，R3为甲基，R4为氢，R5为氢；

或R1为乙酰氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢；

或R1为乙酰氧基,R2为乙酰氧基，R3为乙酰氧基，R4为乙酰氧基，R5为氢；

或R1为乙酰氧基,R2为羟基，R3为乙酰氧基，R4为乙酰氧基，R5为氢；

或R1为乙酰氧基,R2为氢，R3为乙酰氧基，R4为氢，R5为氢；

或R1为乙酰氧基,R2为羟基，R3为羟基，R4为乙酰氧基，R5为氢；

或R1为6-甲基-5-羟基-4-甲氧基吡喃氧基，,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢；

或R1为6-脱氧-α-L-鼠李糖氧基,R2为羟基，R3为羟基，R4为羟基，R5为氢；

或R1为2,6-脱氧-3-甲氧基-β-D-核-己吡喃糖氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢；

或R1为6-脱氧-α-L-鼠李糖氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢；

或R1为6-甲基-3,4,5-三羟基吡喃氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢；

或R1为6-甲基-3,4,5-三羟基吡喃氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为羟基；

或R1为6-甲基-3,5-二羟基-4-甲氧基吡喃氧基,R2为氢，R3为甲基，R4为氢，R5为氢；

或R1为6-脱氧-2,3-二甲氧基-D-吡喃葡萄糖氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢；

或R1为2,4-二乙酰氧-6-脱氧-3-甲氧基-D-吡喃半乳糖氧基,R2为氢，R3为甲基，R4为氢，R5为氢；

或R1为4-乙酰氧-6-脱氧-2,3-二甲氧基-D-吡喃葡萄糖氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢；

或R1为6-氧-(6'-脱氧-2',3'-二甲氧基-D-吡喃半乳糖)-D-吡喃葡萄糖氧基,R2为氢，R3为醛基，R4为氢，R5为氢；

或R1为6-甲基-3,4,5-三羟基吡喃氧基,R2为羟基，R3和R4为五元内酯，R5为氢；

或R1为苯甲酰氧基,R2为氢，R3为甲氧羰基，R4为氢，R5为氢。

本发明所述的杠柳苷元及其衍生物包括杠柳苷元、毒毛花苷、17α-羊角拗醇、17α-3,5,14-三羟基-20(22)-烯醇-19-羧酸、17α-3-乙酰氧-5,14,19-三羟基-20(22)-烯醇、3-乙酰氧-5,14-二羟基-20(22)-烯醇、3-乙酰氧-17α-毒毛旋花子甙元、1,3,11,19-四乙酰氧毒毛花苷、3,11,19-三乙酰氧毒毛花苷、3,19-二乙酰氧羊角拗醇、3β，11α-二乙酰氧毒毛花苷、毒毛花苷K、毒毛旋花苷G、毒毛旋花苷K、K-毒毛旋花子配质-3-L-鼠李糖甙、铃兰毒甙、β-箭努子苷、羊角拗苷、3-[(6'-脱氧-2',3'-二甲氧基-D-吡喃葡萄糖)氧基]-5,14-二羟基-19-氧基-20(22)-烯醇、3α，14α-3-[(2',4'-二乙酰氧-6'-脱氧-3'-甲氧基-D-吡喃半乳糖)氧基]-5,14-二羟基-19-氧基-20(22)-烯醇、3-[(4'-乙酰氧-6'-脱氧-2',3'-二甲氧基-D-吡喃葡萄糖)氧基]-5,14-二羟基-19-氧基-20(22)-烯醇、3-{[6'-氧-(6”-脱氧-2”,3”-二甲氧基-D-吡喃半乳糖)-D-吡喃葡萄糖]氧基}-5,14-二羟基-19-氧基-20(22)-烯醇、旋花羊角拗、17α-3-苯甲酰氧-5,14-二羟基-20(22)-烯醇-19-羧酸甲酯。

本发明所述的皮肤增生性疾病为银屑病、寻常疣、甲周疣、脂溢性角化病、扁平疣或跖疣。

本发明所述的防治皮肤增生性疾病药物以及方法亦在本发明的范围之内，所述的药物组合物包括治疗有效量的本发明的杠柳苷元及其衍生物以及医药学上可接受的载体，所述的载体为稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、崩裂剂和其它辅助剂。

本发明所述的药物组合物可以由使用者在使用前经稀释或直接使用，其配制可由通常的本领域技术人员所公知的加工方法制备。

本发明所述的药物组合物根据需要可制备成适应于不同给药途径的药物剂型，其中较优选的剂型为胶囊、片剂、乳剂、霜剂、凝胶剂或膏剂，所述的药物组合物含有杠柳苷元及其衍生物的重量含量为1～99％。

本发明的杠柳苷元及其衍生物可通过外用和口服两种途径给药，用量范围可随病人情况与给药途径的不同而做相应的调整。

本发明所述的杠柳苷元及其衍生物均通过抑制人皮肤异常增殖细胞增殖，并经细胞实验和动物实验证实效果显著，安全性好，是一种新型的皮肤增生性疾病治疗药物，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是杠柳苷元对HaCaT细胞DNA合成的影响；

图2是杠柳苷元对银屑病豚鼠模型影响的组织学观察；A为对照组；B为心得安模型组；C为杠柳苷元实验组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1杠柳苷元及其衍生物对人表皮角质形成层细胞活力的影响

将人表皮角质形成层细胞HaCaT细胞接种到96孔板中培养，细胞密度为1.2×104个/ml，12h后加药，药物均用含3％FBS的1640培养基进行倍比稀释，阴性组用含有DMSO的3％FBS的1640培养基作对照，每组设3复孔，给药容积为100μl/孔；细胞在含5％CO2的37℃培养箱继续培养44h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h；吸弃上清，每孔加入100μlDMSO，在酶标仪上，振动10min，检测570nm处的OD值，并计算抑制率，抑制率＝(1-实验组的吸光度均值/对照组的吸光度均值)×100％；独立实验重复三次以上，实验数据均用SPSS统计软件计算IC50值。结果见表1，杠柳苷元及其衍生物579-1到579-23对HaCaT细胞的增殖表现出具有不同程度的抑制作用，而衍生物579-24到579-27无明显抑制作用。

表1杠柳苷元及其衍生物对HaCaT细胞的IC50测定

实施例2杠柳苷元及其衍生物对皮下结缔组织细胞无毒剂量的检测

接种皮下结缔组织细胞A9细胞于96孔板中，细胞密度为1.2×104个/ml；12h后加药，药物均用含3％FBS的DMEM培养基进行倍比稀释，阴性组用含有DMSO的3％FBS的DMEM培养基作对照，每组设3复孔，给药容积为100μl/孔；细胞在含5％CO2的37℃培养箱继续培养44h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h；吸弃上清，每孔加入100μl DMSO，在酶标仪上，振动10min，检测570nm处的OD值；独立实验重复三次以上，实验数据均用SPSS统计软件计算IC10值，有90％以上的细胞存活的药物浓度为无毒或低毒剂量。结果见表2，表明杠柳苷元及579-1到579-27衍生物对皮下结缔组织A9细胞无明显毒性。

表2杠柳苷元及其衍生物对A9细胞的IC10测定

实施例3杠柳苷元及其衍生物对HaCaT细胞DNA合成的影响

为了进一步探讨杠柳苷元及其衍生物对HaCaT细胞增殖的影响，我们又进行了BrdU掺入实验。使用终浓度2μg/ml的杠柳苷元及其衍生物处理HaCaT细胞，同时用DMSO处理组作阴性对照，加药作用不同时间后，掺入BrdU 6h后，经过一系列处理，用酶标仪在450nm处检测其OD值。结果见图1，杠柳苷元处理后的HaCaT细胞在12h、24h、36h和48h各个时间段，其BrdU掺入量都低于DMSO对照组，且处理24h时就达到了极显著水平，表明杠柳苷元可以通过抑制HaCaT细胞的DNA合成来抑制其增殖。其它衍生物亦显示出类似的结果。

实施例4杠柳苷元对HaCaT细胞细胞周期的影响

将HaCaT细胞用2μg/ml的杠柳苷元处理12h后，收集培养基到离心管中，PBS洗一遍，用0.25％胰酶消化细胞一段时间后，弃去胰酶，用先前收集的培养液吹下细胞并离心收集细胞；PBS洗一遍，再次离心沉淀细胞；用冰浴的75％乙醇重悬细胞，4℃固定12h；离心沉淀细胞，PBS洗一遍，再次离心沉淀细胞；每管样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min，随后冰浴避光存放，用流式细胞仪进行细胞周期检测。结果显示，对照组G1期细胞比例为28.18％，加药组G1期细胞明显升高为37.95％，结果表明杠柳苷元将HaCaT细胞阻滞在G1期，其可能是通过对HaCaT细胞周期阻滞来抑制细胞活力。

实施例5杠柳苷元对豚鼠银屑病模型作用的研究

1)心得安软膏和杠柳苷元及其衍生物软膏的制备

心得安(5％)软膏的制备：先将心得安药片压制成粉末，称重并按药品说明书含量计算心得安重量，之后加少量纯净水溶解至糊状；称取适量的凡士林，使心得安含量占膏剂总重量的5％；加热水浴锅，将凡士林和心得安水溶剂一同水浴，水温60℃左右；待凡士林熔化至半透明状，将二者缓慢混合，并充分搅拌，混合在水浴环境进行；混合均匀后，将乳膏在室温放置降温，之后密封保存。

杠柳苷元及其衍生物(0.2‰)软膏的制备：先将杠柳苷元及其衍生物粉末称重后加少量纯净水溶解至糊状；称取适量的凡士林，使杠柳苷元及其衍生物含量占膏剂总重量的0.2‰；加热水浴锅，将凡士林和杠柳苷元及其衍生物水溶剂一同水浴，水温60℃左右；待凡士林熔化至半透明状，将二者缓慢混合，并充分搅拌，混合在水浴环境进行；混合均匀后，将乳膏在室温放置降温，之后密封保存

2)豚鼠400g左右，适应性饲养7天，注意补充维生素C及新鲜蔬菜。将其随机分为3组，对照组、模型组和实验组，每组10只。对照组一直用软膏基质涂抹豚鼠的外耳廓，每日两次，持续30天。模型组和杠柳苷元软膏组用心得安(Inderal)软膏涂抹外耳廓，每日两次，持续16天。第17天时停止药物诱导，模型组涂抹软膏基质，实验组涂抹杠柳苷元(0.2‰)软膏，每日两次，持续14天。第31天时，过量麻醉法处死豚鼠，取耳朵清洗标记，用10％甲醛固定，进行石蜡切片及HE染色。

3)各组豚鼠耳朵一般形态学变化

结果，模型组和实验组涂抹心得安软膏16天后耳廓涂抹处局部皮肤红肿明显，发热，耳廓厚度明显增加，并覆有细小银白色鳞屑且脱落明显，毛细血管扩张充血，银屑病病症明显。对照组豚鼠耳廓皮肤平坦，毛细血管扩张不明显，双耳无红肿。给予杠柳苷元软膏治疗14天后，豚鼠耳廓厚度明显缩小，鳞屑消失。

4)各组豚鼠耳朵组织病理学变化

结果如图2所示，各组豚鼠耳朵组织切片观察可见，模型组棘层肥厚，乳突内有炎性细胞浸润，颗粒层变薄或消失，表皮突延伸呈棒状，乳突上呈杵状延伸。给与杠柳苷元软膏治疗后，角化不全减轻，炎细胞浸润减少，多数出现1-2层颗粒层，毛细血管扩张等明显减轻。

实施例6杠柳苷元及其衍生物治疗银屑病的临床研究

在全国各地选取76名症状典型的银屑病患者，进行本发明的中药组合物的临床实验。此76名患者男性32人，女性44人，年龄最大的68岁，最小的16岁，平均年龄38岁。

治疗方法：使用实施例5中杠柳苷元及其衍生物软膏进行治疗，每周治疗2次，4周为1疗程，治疗1个疗程后观察疗效，随访4周。

疗效标准：根据患者的症状变化情况及主要症状进行分级。

痊愈：皮疹全部消退或消退＞95％。

显效：皮疹消退75％～94％。

有效：皮疹消退31％～74％。

无效：皮疹消退＜30％。

治疗结果统计如表3：

表3皮肤增生性疾病治疗效果

性别痊愈显效有效无效观察疗效男20人10人2人0人无复发女27人16人1人0人无复发

由表3结果统计可知，76名患者中，47名患者痊愈，痊愈率达到了61.84％，26名患者症状明显改善，显效率达到了34.21％，3人有效，总有效率高达100％，且随后进行跟踪观察未出现复发状况。

一种杠柳苷元及其衍生物用于防治皮肤增生性疾病的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。