专利摘要

专利摘要

本发明涉及一种隐丹参酮衍生物及其制备方法与在抗神经炎症和神经保护中的应用，所述隐丹参酮衍生物具有式I所示结构：本发明提供三个新的抗神经炎症及神经保护剂，其特征在于以本发明的式I结构的隐丹参酮衍生物或其盐作为有效成分，用于预防或治疗与神经炎症相关的神经退行性疾病，如阿尔兹海默症及帕金森综合征。

权利要求

1.一种隐丹参酮衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述隐丹参酮衍生物具有式I所示结构：

2.权利要求1所述的式Ⅰ化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)丝状真菌Cunninghamella elegans AS3.2028的培养

培养基为PDA固体培养基，使用时制成试管斜面，培养温度为25-30℃，培养时间5-7天，得丝状真菌C.elegans AS3.2028；

(2)丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增

用改良的察氏液体培养基摇床培养步骤(1)得到的丝状真菌C.elegans AS3.2028，所述改良的察氏液体培养基含有葡萄糖1.5％、蔗糖1.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸亚铁0.001％，其余为水，上述百分含量均为重量百分比；培养温度为25-30℃，摇床转速180rpm，培养时间24h，得丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增培养液。

(3)隐丹参酮的生物转化

将隐丹参酮添加到步骤(2)得到的丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增培养液中，于28℃，摇床转速180rpm的条件下摇床培养72h，得转化物；

(4)本发明式Ⅰ化合物的分离纯化

将步骤(3)得到的转化物中的转化液和菌体分离，转化液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液、减压浓缩得到转化液浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离、再进行高效液相色谱分离即得式Ⅰ化合物。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中隐丹参酮的添加量优选添加后终浓度为0.05-0.20mg/mL。

4.权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中所述正相硅胶柱色谱分离采用的固定相：100～400目硅胶，流动相：30％–90％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂；所述高效液相色谱分离采用的固定相：ODS色谱柱(Kromasil,5μm,150×10mm)，流动相：50％–60％的甲醇-水混合溶剂；上述混合溶剂百分比均为体积百分比。

5.权利要求1所述的式I结构的隐丹参酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗神经炎症药物中的应用。

6.权利要求1所述的式I结构的隐丹参酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备神经保护药物中的应用。

7.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物以权利要求1所述的式I结构的隐丹参酮衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分。

8.权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还任选包括其他抗神经炎症药物和/或神经保护药物。

9.权利要求7-8任一项所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还可包括药学上可接受的辅料。

10.权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所述药学上可接受的辅料选自药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种隐丹参酮衍生物及其制备方法与在抗神经炎症和神经保护中的应用。

背景技术

中药丹参具有显著的活血化瘀、通心包络等功效，以多种形式应用于临床，如注射液、滴丸、片剂等。其主要的药效物质为水溶性的丹酚酸和脂溶性的丹参酮类化合物。在丹参酮类成分中，丹参酮IIA已被开发为治疗心绞痛、冠心病和心肌梗死的药物。另外，有研究报道丹参中另一丹参酮类化合物隐丹参酮具有良好的抗炎和抗氧化活性，尤其在治疗神经退行性疾病方面有着潜在的应用前景。神经退行性疾病是由神经元和(或)其髓鞘的功能丧失所致的普遍性疾病，包括阿茨海默症(AD)，帕金森症(PD)，肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿舞蹈症(HD)等，是危害甚大的脑部病变，已逐渐成为世界性的卫生保健难题。其病因主要包括氧化应激、线粒体功能障碍、神经性毒素及免疫炎症。到目前为止，对这些疾病的治疗仍局限于表征的控制和缓解，尚无从根本上治疗疾病的药物。因此，开发安全、有效、可靠的神经退行性疾病药物十分迫切。许多证据表明，炎症在神经退行性疾病尤其是阿尔兹海默症的发生和发展中发挥着重要的作用。在炎症因子(脂多糖、β样淀粉蛋白等)刺激下，机体神经细胞产生大量的NO作为信号分子参与多种神经炎症疾病的发生，同时激活炎症因子IL6、IL1β及TNFα，进一步激活神经细胞的炎症通路。因此，开发安全有效的神经细胞NO及炎症因子产生抑制剂即能够有望成为治疗神经炎症疾病候选药物。

本发明涉及通过生物转化的方法制备三个的隐丹参酮C-3位氧化产物，具有显著的抗神经炎症活性和神经保护作用，能明显抑制神经细胞中NO及炎症因子IL1β、IL6及TNFα释放，并抑制细胞内iNOS，COX-2及TLR4的表达通过抑制MAPK途径中JNK,ERK及p38的磷酸化而发挥抗神经炎症作用，同时缓解高浓度谷氨酸盐诱导的神经细胞死亡，有利于保护神经细胞行使正常的生理功能。

发明内容

本发明提供一种隐丹参酮衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述隐丹参酮衍生物具有式I所示结构：

本发明的另一实施方案提供上述式Ⅰ化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)丝状真菌Cunninghamella elegans AS3.2028的培养

培养基为PDA固体培养基，使用时制成试管斜面，培养温度为25-30℃，培养时间5-7天，得丝状真菌C.elegans AS3.2028；

(2)丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增

用改良的察氏液体培养基摇床培养步骤(1)得到的丝状真菌C.elegansAS3.2028，所述改良的察氏液体培养基含有葡萄糖1.5％、蔗糖1.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸亚铁0.001％，其余为水，上述百分含量均为重量百分比；培养温度为25-30℃，摇床转速180rpm，培养时间24h，得丝状真菌C.elegansAS3.2028的扩增培养液。

(3)隐丹参酮的生物转化

将隐丹参酮(底物)添加到步骤(2)得到的丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增培养液中，于28℃，摇床转速180rpm的条件下摇床培养72h，得转化物；

(4)本发明式Ⅰ化合物的分离纯化

将步骤(3)得到的转化物中的转化液和菌体分离，转化液用乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取液、减压浓缩得到转化液浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离、再进行高效液相色谱分离转化产物即得式Ⅰ化合物(化合物1-3)。

步骤(3)中隐丹参酮的添加量优选添加后隐丹参酮的终浓度为0.05-0.20mg/mL；

步骤(4)中所述正相硅胶柱色谱分离采用的固定相：100～400目硅胶，流动相：30％–90％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂；所述高效液相色谱分离采用的固定相：ODS色谱柱(Kromasil,5μm,150×10mm)，流动相：55％–60％的甲醇-水混合溶剂；上述混合溶剂百分比均为体积百分比。

本发明的另一实施方案提供上述式I结构的隐丹参酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗神经炎症药物中的应用。

本发明的另一实施方案提供上述式I结构的隐丹参酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备神经保护药物中的应用。

本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物以上述式I结构的隐丹参酮衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分。还任选包括其他抗神经炎症药物和/或神经保护药物。还可包括药学上可接受的辅料(例如药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。

附图说明

图1是式Ⅰ化合物抑制iNOS,COX-2及TLR4的表达水平，注：1：底物隐丹参酮，2：式Ⅰ化合物1，3：式Ⅰ化合物2，4：式Ⅰ化合物3。A,B,C:1μM、3μM和10μM化合物作用的westernboltting检测；D,E,F:1μM、3μM和10μM化合物作用的细胞因子表达的灰度分析，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，与LPS处理组相比。

图2是式Ⅰ化合物1抑制JNK,ERK及p38的磷酸化检测，注：A：JNK、ERK和p38磷酸化检测；B，C，D：JNK、ERK和p38磷酸化的灰度分析。

图3是式Ⅰ化合物1抑制NF-κB的免疫荧光图。

图4是式Ⅰ化合物的神经保护活性，注：Control：DMSO，Glu：5mM的谷氨酸钠。1：底物隐丹参酮，2：式Ⅰ化合物1，3：式Ⅰ化合物2，4：式Ⅰ化合物3。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，与Glu处理组相比。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅为了更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1

式Ⅰ化合物制备

(1)丝状真菌C.elegans AS3.2028的培养

培养基为PDA固体培养基，使用时制成试管斜面，培养温度为28℃，培养时间7天，得丝状真菌C.elegans AS3.2028；

(2)丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增

用改良的察氏液体培养基摇床培养步骤(1)得到的丝状真菌C.elegansAS3.2028，所述改良的察氏液体培养基含有葡萄糖1.5％、蔗糖1.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸亚铁0.001％，其余为水，上述百分含量均为重量百分比；培养温度为28℃，摇床转速180rpm，培养时间24h，得丝状真菌C.elegansAS3.2028的扩增培养液；

(3)隐丹参酮的生物转化

将隐丹参酮添加到步骤(2)得到的丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增培养液中(隐丹参酮的终浓度为0.10mg/mL)，于28℃，摇床转速180rpm的条件下摇床培养72h，得转化物；

(4)本发明式Ⅰ化合物的分离纯化

取步骤(3)所得的转化物(10L)，将转化液和菌体分离，转化液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液、减压浓缩得到转化液浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离(固定相：300～400目硅胶，流动相：30％–90％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂)、再进行高效液相色谱分离(固定相：ODS色谱柱(Kromasil,5μm,150×10mm)，流动相：55％的甲醇-水混合溶剂)即得式Ⅰ化合物1(6.2mg，橘黄色粉末)，式Ⅰ化合物2(56.0mg)和式Ⅰ化合物3(17.8mg)。

式Ⅰ化合物1结构确证数据：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:7.65(1H,d,J＝8.1Hz,H-6),7.62(1H,d,J＝8.1Hz,H-7),4.93(1H,d,J＝9.6Hz,H-16a),4.41(1H,dd,J＝9.6,6.1Hz,H-16b),3.67(2H,m,H-1),3.63(1H,m,H-15),2.65(2H,m,H-2),1.48(3H,s,H-18),1.47(3H,s,H-19),1.38(3H,d,J＝6.1Hz,H-17).13C NMR(CDCl3,125MHz)δ:212.5(C,C-3),184.4(C,C-11),175.6(C,C-12),170.2(C,C-14),150.3(C,C-5),141.6(C,C-10),131.8(CH,C-6),128.4(C,C-9),126.9(C,C-8),123.8(CH,C-7),119.0(C,C-13),81.6(CH2,C-16),48.5(C,C-4),36.3(CH2,C-2),34.7(CH,C-15),27.1(CH3,C-19),27.0(CH3,C-18),25.9(CH2,C-1),18.8(CH3,C-17).HRESIMS m/z 311.1273[M+H]+(calcd for C19H19O4,311.1278).[α]20D-33.9(c 0.05,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)209(1.47),264(0.93)nm；IR(KBr)νmax 3741,3445,1645,1558cm-1.

式Ⅰ化合物2结构确证数据：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:7.66(1H,d,J＝8.1Hz,H-6),7.51(1H,d,J＝8.1Hz,H-7),4.90(1H,d,J＝9.6Hz,H-16a),4.37(1H,dd,J＝9.6,6.1Hz,H-16b),3.78(1H,m,H-3),3.59(1H,m,H-15),3.42(1H,m,H-1a),3.27(1H,m,H-1b),2.04(1H,m,H-2a),1.94(1H,m,H-2b),1.36(3H,d,J＝6.1Hz,H-17),1.31(3H,s,H-19),1.31(3H,d,J＝6.1Hz,H-18).13C NMR(CDCl3,125MHz)δ:183.9(C,C-11),175.3(C,C-12),170.7(C,C-14),151.2(C,C-5),142.2(C,C-10),132.9(CH,C-6),127.7(C,C-9),126.5(C,C-8),122.9(CH,C-7),118.4(C,C-13),81.5(CH2,C-16),73.8(CH,C-3),40.0(C,C-4),34.5(CH,C-15),29.4(CH3,C-19),26.2(CH2,C-2),25.9(CH2,C-1),25.3(CH3,C-18),18.7(CH3,C-17).HRESIMS m/z 313.2[M+H]+.

式Ⅰ化合物3结构确证数据：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:7.66(1H,d,J＝8.1Hz,H-6),7.53(1H,d,J＝8.1Hz,H-7),4.90(1H,d,J＝9.5Hz,H-16a),4.37(1H,dd,J＝9.3,6.0Hz,H-16b),3.79(1H,m,H-3),3.60(1H,m,H-15),3.46(1H,m,H-1a),3.28(1H,m,H-1b),2.06(1H,m,H-2a),1.93(1H,m,H-2b),1.37(3H,d,J＝6.1Hz,H-17),1.36(3H,s,H-19),1.34(3H,d,J＝6.1Hz,H-18).13C NMR(CDCl3,125MHz)δ:184.0(C,C-11),175.4(C,C-12),170.6(C,C-14),151.1(C,C-5),142.1(C,C-10),132.8(CH,C-6),127.8(C,C-9),126.6(C,C-8),123.0(CH,C-7),118.5(C,C-13),81.5(CH2,C-16),73.9(CH,C-3),40.0(C,C-4),34.6(CH,C-15),29.3(CH3,C-19),26.3(CH2,C-2),25.9(CH2,C-1),25.3(CH3,C-18),18.8(CH3,C-17).HRESIMS m/z 313.2[M+H]+.

实施例2

式Ⅰ化合物制备

(1)丝状真菌C.elegans AS3.2028的培养

培养基为PDA固体培养基，使用时制成试管斜面，培养温度为25℃，培养时间5天，得丝状真菌C.elegans AS3.2028；

(2)丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增

用改良的察氏液体培养基摇床培养步骤(1)得到的丝状真菌C.elegansAS3.2028，所述改良的察氏液体培养基含有葡萄糖1.5％、蔗糖1.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸亚铁0.001％，其余为水，上述百分含量均为重量百分比；培养温度为30℃，摇床转速180rpm，培养时间24h，得丝状真菌C.elegansAS3.2028的扩增培养液；

(3)隐丹参酮的生物转化

将隐丹参酮添加到步骤(2)得到的丝状真菌C.elegans AS3.2028的扩增培养液中(隐丹参酮的终浓度为0.05mg/mL)，于28℃，摇床转速180rpm的条件下摇床培养72h，得转化物；

(4)本发明式Ⅰ化合物的分离纯化

取步骤(3)所得的转化物(10L)，将转化液和菌体分离，转化液用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液、减压浓缩得到转化液浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离(固定相：200～300目硅胶，流动相：30％–90％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂)、再进行高效液相色谱分离(固定相：ODS色谱柱(Kromasil,5μm,150×10mm)，流动相：60％的甲醇-水混合溶剂)即得式Ⅰ化合物1(2.9mg，橘黄色粉末)，式Ⅰ化合物2(22.4mg)和式Ⅰ化合物3(8.3mg)。

实施例3

本发明式Ⅰ化合物抑制NO产生活性测试

式Ⅰ化合物的抑制NO产生以小胶质细胞BV-2为评价模型，实验在96孔板中进行，添加不同浓度的式Ⅰ化合物、底物隐丹参酮、阳性对照槲皮素及空白对照DMSO，然后每孔中添加1μg/mL的LPS孵育24h。通过Griess反应检测NO产生量，每孔中吸取50μL的细胞上清液转移到新的96孔板中，加入等量的Griess试剂混匀，540nm下检测吸光度，计算NO产生量及抑制率。实验重复3次，结果以均值±SD表示，如表1所示。底物隐丹参酮的抗神经炎症活性比阳性对照槲皮素高2.5倍，而式Ⅰ化合物的抗神经炎症活性比底物高6.7倍。这表明通过生物转化的方法能使得隐丹参酮的抗炎活性明显提高。

表1本发明的式Ⅰ化合物对LPS诱导BV2细胞产NO的抑制活性

实施例4

本发明式Ⅰ化合物抑制炎症因子IL1β、IL6及TNFα释放的活性测试

神经细胞BV-2培养于6孔板中，添加10μM化合物1和化合物2，37℃孵育1h后，每孔添加1μg/mL LPS并设置未加LPS为对照培养16h，4000rpm离心5min，收集上清液于新的1.5mL无菌离心管，重复三次。

神经炎症因子释放测定采用联科ELSIA试剂盒，IL1β(EK201B-01)、IL6(EK206-01)及TNFα(EK282-01)。

(1)加样：加适当稀释的待检样品100μl于上述已包被的反应孔中。(同时做空白孔，倍比稀释的标准品孔，以阴性对照孔及阳性对照孔作为质控点)。

(2)温育：用封板膜封板后置37℃孵育1-2h。

(3)洗涤：弃去液体，每孔加入300uL洗液，浸泡1-2min，在吸水纸上拍干，重复3遍。

(4)加抗体：于各孔中加稀释好的生物素化抗体工作液100μl。

(5)温育：用封板膜封板后置37℃孵育1h。

(6)洗涤：同步骤3。

(7)加酶结合物：于各孔中加稀释好的酶结合物工作液100μl。

(8)温育：用封板膜封板后置37℃避光孵育30min。

(9)洗涤：同步骤3。

(10)加显色底物：于各孔中加入TMB底物溶液100μl，37℃避光反应10～30min，直到倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止。

(11)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸100μl，颜色由蓝色变为黄色。

(12)结果测定：10min内，在酶标仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

LPS刺激神经细胞BV-2产生释放了炎症因子IL1β、IL6及TNFα。式Ⅰ化合物和隐丹参酮均能显著抑制炎症因子的释放，而且式Ⅰ化合物的抑制活性更强(表2)。

表2本发明的式Ⅰ化合物抑制炎症因子的活性(IC50±SD(μM))

注：LPS组:IL1β,70.05±7.71pg/mL,IL6,377.77±39.02pg/mL,TNFα,759.44±45.55pg/mL；Control组:IL1β,7.77±0.96pg/mL,IL6,1.27±0.12pg/mL,TNFα,70.84±9.93pg/mL。

实施例5

本发明式Ⅰ化合物1抑制炎症因子iNOS、COX-2和TLR4的表达及JNK、ERK和p38的磷酸化水平检测

BV-2细胞接种于6孔培养板中，与化合物共孵育1h，再与LPS(1μg/mL)共孵育16h。用Pierce-Rapid-Gold-BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对每个定量的蛋白样品进行电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5％(W/V)脱脂乳在TBST缓冲液(含0.1％吐温20的三缓冲盐水)中封闭膜2h，然后在4℃下用一级抗体孵育膜过夜。TBST洗涤三次后，在室温下与相应的二级抗体孵育2小时，最后用化学发光成像仪(GE-Amersham成像仪600，美国)检测，并使用Image J密度成像软件(国立卫生研究院，MD)进行量化。结果如图1，式Ⅰ化合物均能显著抑制iNOS、COX-2和TLR4的表达，从而发挥抗炎效果。并且式Ⅰ化合物1还能抑制JNK、ERK和p38的磷酸化并呈现浓度依赖关系(图2)，说明式Ⅰ化合物1主要是通过TLR4/MAPK通路发挥抗神经炎症作用。

实施例6

本发明式Ⅰ化合物1够抑制NF-κB p65的效果检测

BV-2细胞接种于6孔培养板中，与化合物共孵育1h，再与LPS(1μg/mL)共孵育16h。细胞爬片采用4％多聚甲醛和0.2％Triton X-100(PBS)处理。然后，用5％牛血清白蛋白(PBS)封闭1h，并在4℃条件下与抗体NF-κB p65孵育过夜，然后添加标记有Alexa Fluor594的抗体孵育1h。用DAPI染色后，清洗并密封盖玻片，荧光显微镜拍照。结果表明，LPS能够激活NF-κB p65的产生和定位，式Ⅰ化合物1能够明显抑制NF-κB p65的效果(图3)。

实施例7

本发明式Ⅰ化合物的神经保护活性测试

式Ⅰ化合物的神经保护活性采用高浓度谷氨酸钠诱导的小鼠海马神经元细胞HT-22细胞毒性为评价模型。该实验在96孔板中进行，首先加入1μM和0.1μM式Ⅰ化合物、底物隐丹参酮和空白对照DMSO，预处理1h。每孔中添加5mM的谷氨酸钠，37℃孵育12h。采用MTT法评价细胞存活率。实验重复3次，采用Graphpad prism 7计算细胞存活率。结果如图4所示，在1μM和0.1μM浓度下，式Ⅰ化合物与底物隐丹参酮有着明显的神经保护活性。

4讨论

本发明提供一个新的抗神经炎症剂和神经保护剂，其特征在于以本发明的隐丹参酮C-3位羰基化产物或其盐作为有效成分，用于预防或治疗与神经炎症相关的神经退行性疾病，如阿尔兹海默症及帕金森综合征。且原料隐丹参酮来源广泛，菌体可大规模培养，均不受资源限制，因此应用前景广阔。

一种隐丹参酮衍生物及其制备方法与在抗神经炎症和神经保护中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。