专利摘要
专利摘要
基于尼罗蓝母体的荧光识别染料、其制备方法及应用。所述荧光识别染料具有通式Ⅰ的结构，通式Ⅰ中：R1、R2、R3和R4各自独立的选自C1?8烷基、C1?6烷基磺酸基、C1?6烷基羧酸基；X为卤素；n为1?4的整数。本发明所述荧光识别染料可专一性、特异性地靶向识别酶KIAA1363，并且具有优良的组织渗透性、光稳定性、水溶性，低得生物毒性，优异的近红外荧光特性，高灵敏度，低背景干扰，适用于生物样品的检测。本发明所述荧光识别染料依靠KIAA136表达的差异性对癌症细胞和组织和非癌症细胞和组织进行识别区分，尤以离体的癌症细胞和组织样本和非癌症细胞和组织样本区分效果明显。本发明所述荧光识别染料可应用于深层组织成像和小鼠活体成像。本发明所述荧光识别染料在癌症早期确诊和癌症手术治疗中辅助成像确定边界方面拥有良好的应用价值。
权利要求
1.基于尼罗蓝母体的荧光识别染料，具有通式Ⅰ的结构：
通式Ⅰ中：
R1、R2、R3和R4各自独立的选自C1-8烷基、C1-6烷基磺酸基、C1-6烷基羧酸基；
X为卤素；
n为1-4的整数。
2.权利要求1所述的荧光识别染料，其特征在于，所述的R1、R2、R3和R4各自独立的选自C1-8烷基。
3.权利要求2所述的荧光识别染料，其特征在于，所述的R1、R2、R3和R4各自独立的选自C1-4烷基。
4.权利要求1所述的荧光识别染料，其特征在于，所述X选自Cl和Br。
5.权利要求1所述的荧光识别染料，其特征在于，所述n选自3和4。
6.权利要求1所述的荧光识别染料，具有化学式N1结构：
7.权利要求1所述的基于尼罗蓝母体的荧光识别染料的制备方法，包括下述步骤：
(1)6-羟基-2-萘甲酯与卤代试剂按摩尔比1：1～2反应，制备式Ⅱ的化合物：
反应时间为6～36h，反应温度为10～80℃，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、二甲基甲酰胺乙醇、乙酸乙酯或其混合物；
(2)式Ⅱ的化合物与式Ⅲ的化合物按摩尔比1:1～5反应制备式Ⅳ的化合物：
反应时间为16～48h，反应温度为-5～5℃，反应使用碱性物质作为缚酸剂，反应溶剂为丙酮、乙腈、DMSO或其混合物；
(3)式Ⅳ的化合物与式Ⅴ的化合物按照摩尔比1～3:1反应制备式Ⅰ的化合物，
反应时间为12～48h，反应温度为10～100℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺，乙二醇单甲醚，THF(四氢呋喃)或者其混合物，反应使用催化剂为有机弱碱。
8.权利要求1-6中任一权利要求所述的基于尼罗蓝母体的荧光识别染料在生物样品识别标记中的应用。
说明书
技术领域
本发明涉及一类基于尼罗蓝母体的荧光识别染料、其制备方法，以及利用该类荧光识别染料对癌症细胞和组织识别中的应用。
背景技术
医疗卫生一直是全球关注的重点问题之一。世界卫生组织发布的《世界癌症报告》显示，在全球范围内癌症的发病形势严峻，发病率和死亡率均明显上升。新增病例一半出现在亚洲，并且大部分集中在中国。癌症在我国已经超越其他疾病成为致死率最高的疾病，因此建立一种快速、灵敏、简便的癌症诊断手段显得尤为重要。当前成熟的癌症诊断技术主要有核磁共振成像、红外成像、超声波成像、正电子发射断层成像，单电子发射计算机断层成像等。然而，上述的癌症检测技术有一定的缺点：仪器成本高，医疗价格昂贵；放射性损伤大，对身体造成伤害；空间分辨率低，容易造成误诊；时间效率差，只能到癌症的中晚期才能得到有效的诊断结果。另外，上述诊断方法在治疗过程中，特别是手术切除过程中，不能实时监测，指导医生辨别肿瘤边界，这也造成了癌症治愈难，易反复。荧光成像技术由于其简便、毒性低、灵敏度高、非入侵性实时监测等优点，逐渐发展为肿瘤识别和动态监测的有效技术，开发良好性能的肿瘤荧光识别染料则是荧光成像技术的关键。
近几年，越来越多的癌症治疗的靶点被研究者发现，相关生物标志物的功能，代谢通路逐渐清晰，基于生物标志物得荧光识别染料的设计开发取得了良好的进展。本发明中所涉及荧光识别染料靶向的生物标志物为KIAA1363(中性胆固醇酯水解酶)，该酶是调节生物体内脂质代谢的重要水解酶，其表达含量与癌症的发生，肿瘤生长转移密切相关。在大部分癌症组织中，特别是原发性肿瘤和侵略性肿瘤，例如乳腺癌以及前列腺癌中，酶KIAA1363表达的含量远超出正常水平。基于酶KIAA1363在癌症和非癌症细胞核组织中表达量的差异而进行识别和标记，有助于癌症的早期发现及诊断，该领域需要具有酶特异性的荧光标记化合物来实现此目的。
发明内容
本发明提供一类基于尼罗蓝母体的荧光识别染料，所述荧光识别染料依靠酶KIAA1363在癌症和非癌症细胞核组织中表达量的差异，对离体的癌症细胞和组织和非癌细胞和组织样本进行区分。
本发明首先提供一类基于尼罗蓝母体的荧光识别染料，具有通式Ⅰ的结构：
通式Ⅰ中：
R1、R2、R3和R4各自独立的选自C1-8烷基、C1-6烷基磺酸基、C1-6烷基羧酸基；
X为卤素；
n为1-4的整数。
另一方面，本发明提供上述基于尼罗蓝母体的荧光识别染料的制备方法，包括下述步骤：
(1)6-羟基-2-萘甲酯与卤代试剂按摩尔比1：1～2反应，制备式Ⅱ的化合物：
反应时间为6～36h，反应温度为10～80℃，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、二甲基甲酰胺、甲醇、乙酸乙酯或其混合物；
(2)式Ⅱ的化合物与式Ⅲ的化合物按摩尔比1:1～5反应制备式Ⅳ的化合物：
反应时间为16～48h，反应温度为-5～5℃，反应使用碱性物质作为缚酸剂，反应溶剂为丙酮、乙腈、DMSO或其混合物；
(3)式Ⅳ的化合物与式Ⅴ的化合物按照摩尔比1～3:1反应制备式Ⅰ的化合物:
反应时间为12～48h，反应温度为10～100℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺，乙二醇单甲醚，THF(四氢呋喃)或者其混合物，反应使用催化剂为有机弱碱。
另一方面，本发明提供上述基于尼罗蓝母体的荧光识别染料在生物样品识别标记中的应用，尤其是离体的癌症细胞和组织样本与非癌症细胞和组织样本的差异标记与识别。
本发明所述的基于尼罗蓝母体的荧光识别染料通过特异性识别基团靶向到生物标志物KIAA1363，并依靠KIAA1363在癌症和非癌症细胞和组织中表达量的显著差异识别癌症和非癌症细胞和组织。并且，本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料激发和发射波长均在近红外区域，具有低的生物质背景荧光，大的信噪比，具有高的灵敏性。同时，本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料具有低生物毒性和光毒性，良好的光稳定性、细胞通透性。因此，本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料是一类操作简便，灵敏度高，特异性的原位实时监测识别染料，有良好的癌症检测以及术中辅助成像的应用前景。
附图说明
本发明附图7幅：
图1是本发明所述的基于尼罗蓝母体的荧光识别染料的结构通式I。
图2是荧光识别染料N1(5μM)分别加入不同溶剂中的紫外吸收光谱(图2a)、荧光发射光谱(图2b)、摩尔消光系数及荧光量子产率(图2c)。所用仪器分别是AgIIlent8453紫外分光光度计，AgIIlentCaryEclIIpse荧光分光光度计，绝对荧光量子产率仪。
图3是荧光识别染料N1(2.5μM)对癌症细胞与非癌症细胞识别的激光共聚焦成像图。荧光识别染料N1(2.5μM)分别对已经孵育好的MCF-7细胞，Hela细胞，RWPE-1细胞，LO-2细胞(细胞培养密度105cells/ml，皿底覆盖70-80％)在培养皿中，37℃，5％CO2条件下孵育染色20min，然后使用PBS震荡漂洗1min×3，再加入无血清培养基。选择代表性区域使用OlympusFV1000-IX81激光共聚焦显微镜成像，激发波长635nm，接收波段655-755nm，重复实验3次。a,a’,b,b’,c,c’,d,d’分别为MCF-7，Hela，RWPE-1，LO-2的荧光通道图和白光通道图。
图4是荧光识别染料N1(2.5μM,5μM)进行细胞毒性实验图。选取MCF-7细胞为研究对象，MTT实验方法，24h实验时间，测定570nm、630nm处的吸光值，计算细胞的存活率，并以细胞的存活率来表征荧光识别染料N1对细胞毒性的大小。
图5是荧光识别染料N1(2.5μM)用流式细胞仪对癌症细胞和非癌症细胞分选图。激发波长为630nm，接受波段为700±10nm。a,e；b,f；c,g和d,h分别为RWPE-1，LO-2，MCF-7和Hela的分选结果。
图6是荧光识别染料N1(10μM)对癌症组织与非癌症组织识别的激光共聚焦成像图。荧光识别染料N1(10μM)分别对癌症组织和非癌症组织切片染色5min，然后使用PBS震荡漂洗5min×3，选择代表性区域使用OlympusFV1000-IX81激光共聚焦显微镜成像，激发波长635nm，接收波段655-755nm，重复实验3次。a,c和b，d分别为癌症组织和正常组织的荧光通道图和白光通道图。
图7是荧光识别染料N1(50μM)对癌症组织与非癌症组织识别的活体仪成像结果。荧光识别染料N1(50μM)分别对癌症组织和非癌症组织块染色10min，空白对照组使用癌症组织块使用PBS震荡漂洗5min×3，激发波长630nm，接收波段700±10nm，重复实验3次。组织1，1’为正常组织，组织2，2’为癌症组织实验组，组织3，3’为癌症组织对照组。
具体实施方式
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本发明提供一类基于尼罗蓝母体的荧光识别染料，具有通式Ⅰ的结构：
通式Ⅰ中：
R1、R2、R3和R4各自独立的选自C1-8烷基、C1-6烷基磺酸基、C1-6烷基羧酸基；
X为卤素；优选Cl或Br，最优选Br。
n为1-4的整数，优选n＝3或4，最优选n＝3。
实施方式之一，所述的R1优选C1-8烷基，进一步优选C1-4烷基，尤其优选甲基或乙基。
实施方式之一，所述的R2优选C1-8烷基，进一步优选C1-4烷基，尤其优选甲基或乙基。
实施方式之一，所述的R3优选C1-8烷基，进一步优选C1-4烷基，尤其优选甲基。
实施方式之一，所述的R4优选C1-8烷基，进一步优选C1-4烷基，尤其优选甲基。
具体实施方式中，也可以由所述优选技术特征组合构成本发明所述荧光识别染料的优选技术方案，优选的技术方案包括，所述的R1、R2、R3和R4均为甲基。
最为优选的技术方案中，本发明所述的荧光识别染料，具有化学式N1结构：
本发明另一方面提供一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)6-羟基-2-萘甲酯与卤代试剂按摩尔比1：1～2反应，制备式Ⅱ的化合物：
反应时间为6～36h，反应温度为10～80℃，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、二甲基甲酰胺、甲醇、乙酸乙酯或其混合物；
优选的实施方式中，6-羟基-2-萘甲酯与卤代试剂按摩尔比为1：1～1.5，反应时间为10-30h，反应温度为20～60℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺、乙醇、乙酸乙酯或其混合物；
更优选实施方式中，6-羟基-2-萘甲酯与卤代试剂按摩尔比为1:1～1.3，反应时间为20-30h，反应温度为25～40℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺、乙酸乙酯或其混合物；
最优选实施方式中，6-羟基-2-萘甲酯与卤代试剂按摩尔比为1:1～1.2，反应时间为22-25h，反应温度为28～32℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺；
(2)式Ⅱ的化合物与式Ⅲ的化合物按摩尔比1:1～5反应制备式Ⅳ的化合物：
反应时间为16～48h，反应温度为-5～5℃，反应使用碱性物质作为缚酸剂，反应溶剂为丙酮、乙腈、DMSO或其混合物；
优选的实施方式中，具有通式Ⅱ的化合物与具有通式Ⅲ的化合物按摩尔比为1:2～5，反应时间为20～45h，反应温度为-3～4℃，反应使用缚酸剂为碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠、氢氧化钠或其混合物，反应溶剂为丙酮、乙腈或其混合物；
更优选的实施方式中，具有结构通式Ⅱ的化合物与具有结构通式Ⅲ的化合物按摩尔比为1:2.5～4.5，反应时间为25～40h，反应温度为-2～2℃，反应使用缚酸剂为碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯或其混合物，反应溶剂为丙酮、乙腈或其混合物；
最优选的实施方式中，具有结构通式Ⅱ的化合物与具有结构通式Ⅲ的化合物按摩尔比为1:3～3.5，反应时间为28～30h，反应温度为0～1℃，反应使用缚酸剂为碳酸铯，反应溶剂为丙酮；
(3)式Ⅳ的化合物与式Ⅴ的化合物按照摩尔比1～3:1反应制备式Ⅰ的化合物，
反应时间为12～48h，反应温度为10～100℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺，乙二醇单甲醚，THF(四氢呋喃)或者其混合物，反应使用催化剂为有机弱碱。
优选的实施方式中，具有结构通式Ⅳ的化合物与具有结构通式Ⅴ的化合物按照摩尔比为1.5～2.5:1，反应时间为18～40h，反应温度为15～80℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺，乙二醇单甲醚，THF(四氢呋喃)或者其混合物，反应使用催化剂为吡啶，三乙胺，DMAP，EDC，苯胺，HOBT或者其混合物；
更优选的实施方式中，具有结构通式Ⅳ的化合物与具有结构通式Ⅴ的化合物按照摩尔比为1.5～2.0:1，反应时间为20～35h，反应温度为20～60℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺，乙二醇单甲醚或者其混合物，反应使用催化剂为三乙胺，DMAP，EDC，HOBT或者其混合物；
最优选的实施方式中，具有结构通式Ⅳ的化合物与具有结构通式Ⅴ的化合物按照摩尔比为1.6～1.8:1，反应时间为24～28h，反应温度为25～35℃，反应溶剂为二甲基甲酰胺，反应使用催化剂为DMAP，HOBT或者其混合物。
本发明上述的制备方法中溶剂最优选均为除水溶剂；
本发明上述的制备方法中，各个取代基(R1，R2，R3，R4)，X和n的定义及优选均与本发明中所述化合物的定义及优选相同；
本发明上述的制备方法中提纯方法采用常规方法，没有特别限制，优选二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂色谱柱分离、重结晶或两者结合。并且所得染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，已达到需要纯度；
本发明上述的制备方法中所使用的原料均可市售或本领域内公知的方法制备得到；
本发明上述的制备方法中合成的化合物均采用高分辨质谱，核磁共振氢谱和核磁共振碳谱来确认结构。
本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料具有如下优点：
本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料荧光激发和发射波长大于630nm，具有优异的近红外荧光染料特性，适用于生物样本检测，具有低的生物质背景荧光干扰，高灵敏度；
本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料具有低的生物毒性，良好的光稳定性、生物相容性、细胞及组织渗透性，可以对生物组织快速检测，并且具有优良的深度成像功能；
本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料引入专一性靶向识别基团，特异性识别癌症细胞及组织中过量表达的酶KIAA1363，具有良好的特异性，可以对癌症细胞及组织识别，对离体的癌症细胞和组织样本和非癌症细胞和组织样本差异性识别尤为突出；
本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料原料易得，制备简单，易产业化。
鉴于此，本发明所述的一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料可用于癌症细胞和组织识别，可用于深度组织成像和动物活体成像，对癌症的实时原位检测以及手术术中辅助成像有着良好的应用前景。除了以本文中所述的形式直接用于肿瘤细胞和组织的染色外，含有本发明所述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料的组合物也可以用于肿瘤细胞和组织的染色。该组合物中应当包含有效量的本发明所提供的双光子荧光探针化合物之一或其混合物。另外，生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
再一方面，本发明还提供使用上述一类基于尼罗蓝母体荧光识别染料识别癌症细胞核组织生物样品的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
荧光探针化合物N1的合成：
(1)中间体2的合成
将6-羟基-2-萘甲酯(10mmol)、NBS(12mmol)分别用10ml二甲基甲酰胺溶解，将6-羟基-2-萘甲酯的二甲基甲酰胺溶液加入圆底烧瓶中，NBS使用恒压滴液漏斗逐滴加入圆底烧瓶。反应过程中，控制反应温度在28～32℃，反应体系充氮气保护、加快速磁力搅拌，反应持续时间24h。反应完成后将反应液倒入冰水中，静置后有白的沉淀析出，抽滤干燥，色谱柱分离得到白色固体中间体1(60.5％)。
(2)中间体2的合成
将中间体1(3mmol)溶解在10ml丙酮中和碳酸铯(6mmol)加入圆底烧瓶，N,N-2甲基甲酰氯(10.5mmol)使用5ml丙酮溶解，使用恒压滴液漏斗缓慢滴加到圆底烧瓶。反应过程中，控制反应温度在0～1℃，反应体系充氮气保护、加快速磁力搅拌，反应持续时间30h。反应完成后，加压旋蒸出去溶剂，色谱柱分离得到淡黄色固体中间体2(82.07％)
(3)荧光识别染料N1的合成
将中间体2(1.6mmol)、中间体3(1mmol)、DMAP(2mmol)、HOBT(2mmol)用20ml二甲基甲酰胺溶解，加入圆底烧瓶中。反应过程中，控制反应温度在30℃，反应体系充氮气保护、加快速磁力搅拌，反应持续时间28h。反应完成后反应液用二氯甲烷稀释20倍，色谱柱分离得到蓝紫色固体荧光识别染料N1(31.59％)。
1HNMR(400MHz,MeOD),δ8.84(d,J＝8.0Hz,1H),8.35(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(s,1H),8.14–8.06(m,1H),7.91(t,J＝7.5Hz,1H),7.83(dd,J＝18.4,9.1Hz,4H),7.36(d,J＝8.8Hz,1H),7.22(d,J＝9.4Hz,1H),6.93(s,1H),6.76(s,1H),3.78(t,J＝7.0Hz,2H),3.66(s,3H),3.48(t,J＝6.8Hz,2H),3.28(d,J＝8.8Hz,6H),3.07(s,3H),2.00–1.94(m,2H),1.80–1.74(m,2H),1.62(m,4H).13CNMR(100MHz,DMSO),δ165.52,154.89,154.02,152.87,152.06,148.91,148.01,147.33,145.70,141.51,132.84,132.46,131.03,130.14,129.74,129.60,129.44,127.81,126.38,126.13,124.22,123.97,123.76,123.20,114.20,109.20,96.75,95.83,50.27,38.58,36.44,36.26,30.68,29.09,26.88,26.43.TOFMS:m/zcalcdforC43H43ClN5O4+:708.2185,710.2165,found:708.2176,710.2176.
实施例2
荧光识别染料N1的光物理性质
使用实施例1中制备的荧光识别染料N1分别加入到Tris-HCl缓冲液，PBS缓冲液，HEPES缓冲液，二甲基亚砜，甲醇，丙酮，1,4-二氧六环，氯仿，乙酸乙酯，四氢呋喃，二氯甲烷中测试紫外吸收光谱(图2a)、荧光发射光谱(图2b)、摩尔消光系数及荧光量子产率(图2c)，染料浓度5μM。所用仪器分别是AgIIlent8453紫外分光光度计和AgIIlentCaryEclIIpse荧光分光光度计。图2表明荧光识别染料N1最大吸收和发射波长大于630nm处于红外区，具有良好的光物理性能，适用于生物成像应用。
实施例3
荧光识别染料N1对癌症细胞和非癌症细胞的识别
使用实施例1中制备的荧光识别染料N1对癌症细胞与非癌症细胞识别的激光共聚焦成像图。荧光识别染料N1(2.5μM)分别对已经孵育好的MCF-7细胞，Hela细胞，RWPE-1细胞，LO-2细胞(细胞培养密度105cells/ml，皿底70-80％覆盖)培养皿中，37℃，5％CO2条件下孵育染色20min，然后使用PBS震荡漂洗1min×3，再加入无血清培养基。选择代表性区域使用OlympusFV1000-IX81激光共聚焦显微镜成像，激发波长635nm，接收波段655-755nm，重复实验3次(图3)。结果显示，a,a’,b,b’,c,c’,d,d’分别为MCF-7，Hela，RWPE-1，LO-2的荧光通道图和白光通道图。通过对a，b，c，d的荧光强度对比发现，癌症细胞MCF-7，Hlea细胞的有强的荧光信号，而正常细胞RWPE-1，LO-2只有微弱的荧光信号，表明荧光识别染料N1可以对癌症细胞和非癌症细胞区分。
实施例4
使用实施例1中制备的荧光识别染料N1(2.5μM,5μM)进行细胞毒性实验结果。选取MCF-7细胞为研究对象，MTT实验方法，24h实验时间，测定570nm、630nm处的吸光值，计算细胞存活率，并以细胞的存活率来表征荧光识别染料N1对细胞毒性的大小(图4)。荧光识别染料N1在2.5μM,5μM细胞的存活率都在90％以上，说明荧光识别染料N1具有低的生物毒性，具有良好的生物检测应用前景。
实施例5
使用实施例1中制备的荧光识别染料N1流式细胞仪对癌症细胞和非癌症细胞分选结果。荧光识别染料N1浓度为2.5μM，激发波长630nm，接收波段690±10nm(图5)。结果显示，非癌症细胞RWPE-1，LO-2的的荧光强度在102数量级，而癌症细胞MCF-7，Hlea的荧光强度在104数量级，癌症细胞与非癌症细胞经过荧光识别染料N染色后1的荧光强度差别明显，荧光识别染料N1可以满足在大量细胞分选中对癌症细胞和非癌症细胞识别区分。
实施例6
使用实施例1中制备的荧光识别染料N1(10μM)对癌症组织与非癌症组织识别的激光共聚焦成像图。荧光识别染料N1(10μM)分别对癌症组织和非癌症组织切片染色5min，然后使用PBS震荡漂洗5min×3，选择代表性区域使用OlympusFV1000-IX81激光共聚焦显微镜成像，重复实验3次，激发波长635nm，接收波段655-755nm(图6)。a,c和b，d分别为癌症组织和正常组织的荧光通道图和白光通道图，癌症组织和正常组织经过荧光识别染料N1染色后，使用635nm激光激发，获得不同强度的荧光信号，并且癌症组织的荧光信号远强于正常组织的荧光信号，荧光识别染料N1可以应用于对癌症组织与正常组织的区分，具有重要的医学诊断以及荧光导向治疗的意义。
实施例7
使用实施例1中制备的荧光识别染料N1(50μM)对癌症组织与非癌症组织识别的活体仪成像图。荧光识别染料N1(50μM)分别对癌症组织和非癌症组织块染色10min，空白对照组使用癌症组织块一直使用PBS作用。然后使用PBS震荡漂洗5min×3，重复实验3次。激发波长630nm，接收波段700±10nm(图7)。组织1，1’为正常组织，组织2，2’为癌症组织实验组，组织3，3’为癌症组织对照组，实验结果显示，荧光识别染料N1可以通过荧光强度的对比对癌症组织肿块和正常组织小块明显区分，有潜在的癌症治疗手术中术中成像应用前景，可以应用为良好的癌症治疗检测荧光识别染料工具。
基于尼罗蓝母体的荧光识别染料、其制备方法及应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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