专利摘要
专利摘要
本发明属于生物工程与食品技术领域，具体是一种一步转化高磷脂毛油生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：(1)配置磷脂酶和脂肪酶浓度为1‑5000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和高磷脂毛油，配成多液相体系；(2)将配置好的多液相体系在搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分为四层，收集最上层即为脂肪酸。本发明利用多液相体系同步高效分离萃取不同物质和为不同界面反应提供不同反应界面的特性，避免不同反应相互干扰，大幅提高其催化效率。同时该方法具有大幅降低分离成本、能耗小、原料利用率高、过程简单等优点。
权利要求
1.一种一步转化高磷脂毛油生产脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配置磷脂酶和脂肪酶浓度为1-5000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和高磷脂毛油，配成多液相体系；所述可溶性盐、亲水性溶剂和高磷脂毛油与酶液的质量比分别为0.03-1、0.02-1和0.02-8；所述亲水性溶剂为聚乙二醇或者[BMIM]BF
(2)将配置好的多液相体系在搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分为四层，收集最上层即为脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)酶催化反应的条件为：搅拌转速为100-1500转/分，反应温度为10-40℃，反应时间为0.1-10h，pH值为2-12。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应时间为0.5-5h，pH值为3.5-9.5。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应时间为1-2h。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述脂肪酶和磷脂酶浓度均为10-500U/mL。
6.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述可溶性盐、亲水性溶剂、高磷脂毛油与酶液的质量比分别为0.1-0.6，0.1-0.8和0.5-5。
7.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述离心条件为5000rpm离心5min。
8.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶为磷脂酶Ultra(Lecitase ultra)，所述脂肪酶为脂肪酶AYS(Candida rugosa lipase)或脂肪酶PL20000L(Rhizomucormiehei lipase)。
说明书
技术领域
本发明属于生物工程与食品技术领域，涉及到酶的分离与应用技术，特别涉及到利用酶法预处理高磷油脂生产脂肪酸的方法。
背景技术
脂肪酸作为油脂化工领域最重要的基础原料，广泛应用于表面活性剂、食品和医药等领域。目前，脂肪酸的年产量超过350万吨，其主要的工业生产途径是通过油脂水解产生的。近年来，利用脂肪酶等界面酶水解油脂生产脂肪酸由于条件温和、能耗低、副反应少等优势，已成为产业的热点。
近年来，利用米糠油等可工业化非食用油脂生产脂肪酸成为行业新宠。然而，通常这类油脂中均含有大量的磷脂，而磷脂属于表面活性剂，在油脂水解过程中，主要存在于油水界面处，容易包裹同处于油水界面的脂肪酶，严重影响水解效率。另外，磷脂还会引起油的酸败和反色，因此为了保证油品稳定，必须除去油中绝大部分的磷脂。因此，通过工业上需要水洗、酸洗以及磷脂酶水解等一系列复杂技术将油中的绝大部分磷脂脱除，然后才能进行相关脂肪酶水解反应，生产出合格的脂肪酸。利用磷脂酶可以水解磷脂的特性，将磷脂酶和脂肪酶同时加入反应体系中，使其同步水解，有望达到相互促进的作用是一个比较好的思路。然而，在实际应用，该方法却鲜有报道。主要原因是由于在传统油水体系中，两种酶和底物处于同一界面处，导致两种反应相互干扰，互相制约，反而降低了其酶催化效率，导致整个酶催化过程耗时过久，效率极低。
发明内容
本发明的目的是针对目前高磷脂毛油在工业上难于直接水解，需要通过复杂工艺将绝大部分磷脂脱除，然后才能进行相关脂肪酶水解反应，导致该过程副反应多，能耗大，时间长，成本高等问题，提供了一种利用多液相体系固载双酶从高磷脂毛油中同步脱除磷脂和水解生产脂肪酸的方法，使工艺得以简化，处理时间短，成本降低，经济可行。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种一步转化高磷脂毛油生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：
(1)配置磷脂酶和脂肪酶浓度为1-5000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和高磷脂毛油，配成多液相体系；所述可溶性盐、亲水性溶剂和高磷脂毛油与酶液的质量比分别为0.03-1、0.02-1和0.02-8；
(2)将配置好的多液相体系在搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分为四层(上层为脂肪酸相；第二层为富含磷脂的固相，第三层和第四层分别为富醇相或富盐相，酶主要集中于后两相其中一相)，收集最上层即为脂肪酸。
优选地，步骤(1)所述亲水性溶剂为亲水性有机溶剂，选自聚乙二醇、乙醇、聚丙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇和正丁醇中的一种或两种以上。
优选地，步骤(1)所述亲水性溶剂为亲水性离子液体，选自[BMIM]Br、[BMIM]BF4、[DMIM]Cl、[EMIM]ETSO4和[OMIM]Cl中的一种或两种以上。
优选地，步骤(1)所述可溶性盐是柠檬酸钠、硫酸铵、硫酸钠、碳酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或两种以上。
优选地，步骤(1)所述可溶性盐、亲水性溶剂，高磷脂毛油与酶液的质量比分别为0.1-0.6，0.1-0.8和0.5-50。
优选地，步骤(2)酶催化反应的条件为：搅拌转速为100-1500转/分，反应温度为10-40℃，反应时间为0.1-10h。
优选地，所述反应时间为0.5-5h。
更优选地，所述反应时间为1-2h。
反应操作一般在低于溶剂易挥发的温度下进行。为了使富集效果尽可能达到最佳，可以调节体系的pH值，所述三液相体系的pH值为2-12。
优选地，pH值为3.5-9.5。
优选地，步骤(1)所述脂肪酶和磷脂酶浓度均为10-500U/mL。
优选地，所述可溶性盐、亲水性溶剂、高磷脂毛油与酶液的质量比分别为0.1-0.6，0.1-0.8和0.5-5。
优选地，步骤(2)所述离心条件为5000rpm离心5min。
优选地，所述磷脂酶为磷脂酶Ultra(Lecitase ultra)，所述脂肪酶为脂肪酶AYS(Candida rugosa lipase)、脂肪酶PL20000L(Rhizomucormiehei lipase)。
收集步骤(2)所得富酶层重新取出加入反应器，补充新的高磷脂毛油，于反应器中反应，静置或离心至分层，回收富酶相，可用作重复反应；所述重复过程为重复1～500次；优选地，重复过程为重复3～100次。
上述磷脂酶和脂肪酶催化反应中，磷脂酶和脂肪酶可以来自天然，也可以通过人工发酵产生。可以是发酵液，可以是经简单纯化后的粗酶，也可是经纯化后纯酶。
前期的研究中发现多液相体系能够促进磷脂酶和脂肪酶催化效率。然而，在近期研究中意外发现，将两种酶同时加入该体系中，还能够起到相互促进的作用，这源于在该体系下，两种反应同时发生于不同界面，大幅提高酶的效率。
本发明的效果和益处：
本发明利用多液相体系同步高效分离萃取不同物质和为不同界面反应提供不同反应界面的特性，为磷脂水解开辟第二“战场”，避免不同反应相互干扰，大幅提高其催化效率。在该体系中，可将水解产物脂肪酸分配在上相，磷脂转化的更亲水胶质富集于第二层固相，而将酶富集于另一相，便于纯化与回收，从而大幅降低分离成本。该方法具有能耗小、原料利用率高、过程简单等优点，解决了高磷脂毛油水解生产脂肪酸过程中，存在工艺复杂，副反应多，能耗大，时间长的技术难题。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
本实施例中所用磷脂酶，Ultra、PL20000L购于Novozyme公司，AYS购于Amano公司。
实施例1
取6.2g含磷脂酶Ultra(70U/mL)和脂肪酶AYS(100U/mL)的粗酶磷酸盐混合液(0.1Mm，pH 7.0)，加入1.1g的硫酸钠，混匀后加入2.5g聚乙二醇400和2g高磷脂毛油(磷脂含量2％)，装入具塞三角瓶中混合均匀，配成多液相体系；在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应10min。反应结束后，设定5000rpm转速离心5min，分为四相，上液相产物为脂肪酸相，第二层为富含胶质的磷脂固相，第三层和第四层分别为富醇相或富盐相，酶主要集中于第三层。
另取6.2g仅含脂肪酶AYS(100U/mL)的粗酶液，加入1.1g的硫酸钠，混匀后加入2.5g聚乙二醇400和2g高磷脂毛油(2％)，在相同条件下反应作为对照组。
取多液相上、中、下相分别测量其脂肪酸含量、酶活和磷含量，可得油相中磷脂去除率和脂肪酸含量分别达到了为66.8％和55.24％，而对照组的脂肪酸含量仅为33.71％，另外，其脂肪酶和磷脂酶主要分配于中相，中下相的分配系数分别为32.64和25.00，两种酶的回收率均超过了98％。
实施例2
取6.5g含磷脂酶Ultra(70U/mL)和脂肪酶TL-100L(100U/mL)的粗酶混合液，加入2g的硫酸铵，混匀后加入2g聚乙二醇400和2g高磷脂毛油(2％)，装入具塞三角瓶中混合均匀，配成多液相体系；在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应2h。反应结束后，设定5000rpm转速离心5min，分为四相，上液相产物为脂肪酸相，第二层为富含胶质的磷脂固相，第三层和第四层分别为富醇相或富盐相，酶主要集中于第三层。
另取6.5g仅含脂肪酶TL-100L(100U/mL)的粗酶液，2g的硫酸铵，混匀后加入2g聚乙二醇400和2g高磷脂毛油(2％)，在相同条件下反应作为对照组。
取多液相上、中、下相分别测量其脂肪酸含量、酶活和磷含量，可得油相中磷脂去除率和脂肪酸含量分别达到了为94.3％和57.68％，而对照组的脂肪酸含量仅为36.68％，另外，其脂肪酶和磷脂酶主要分配于中相，中下相的分配系数分别为182.91和15.00，脂肪酶的回收率超过了99％，磷脂酶的回收率达到了97.5％。
实施例3
取6.5g含磷脂酶Ultra(70U/mL)和脂肪酶AYS(100U/mL)的粗酶混合液，加入1.5g的硫酸钠，混匀后加入2g[BMIM]BF4和2g高磷脂毛油(2％)，装入具塞三角瓶中混合均匀，配成多液相体系；在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应2h。反应结束后，设定5000rpm转速离心5min，分为四相，上液相产物为脂肪酸相，第二层为富含胶质的磷脂固相，第三层和第四层分别为富醇相或富盐相，酶主要集中于第四层。
另取6.5g仅含脂肪酶AYS(100U/mL)的粗酶液，加入1.5g的硫酸钠，混匀后加入2g[BMIM]BF4和2g高磷脂毛油(2％)，在相同条件下反应作为对照组。
取多液相上、中、下相分别测量其脂肪酸含量、酶活和磷含量，可得油相中磷脂去除率和脂肪酸含量分别达到了为94.26％和38.73％，而对照组的脂肪酸含量仅为33.71％，另外，其脂肪酶和磷脂酶主要分配于下相，回收率分别达到了99.25％和95.21％。
实施例4
取6.2g含磷脂酶Ultra(35U/mL)和脂肪酶AYS(100U/mL)的粗酶混合液，加入1.1g的硫酸钠，混匀后加入2.5g聚乙二醇400和2g高磷脂毛油(2％)，装入具塞三角瓶中混合均匀，配成多液相体系；在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应1h。反应结束后，设定5000rpm转速离心5min，分为四相，上液相产物为脂肪酸相，第二层为富含胶质的磷脂固相，第三层和第四层分别为富醇相或富盐相，酶主要集中于第三层。
取出用第三层含酶相加入新的富盐相及高磷脂毛油，重复上述反应共7次。7次重复反应后，脂肪酶和磷脂酶的活力保持初次活力的92.85％和92.70％，油相中磷脂去除率和脂肪酸含量分别达到了86.07％和88.13％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
一种一步转化高磷脂毛油生产脂肪酸的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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