IPC分类号 : C07C35/44,A61P29/00,A61P35/00,C12P15/00,C12R1/80
专利摘要
本发明涉及萜类化合物技术领域，提供的二倍半萜类化合物peniroquesines其结构如下式所示。该类化合物属于二倍半萜类化合物，具有显著的抗炎活性。本发明提供的抗炎及抗肿瘤活性化合物peniroquesines是9个具有新颖的5/6/5/6/5五环系新骨架结构的二倍半萜类化合物，丰富了二倍半萜类化合物的多样性。本发明还提供了一类抗炎及抗肿瘤活性化合物peniroquesine的制备方法，由娄地青霉发酵制备得到，该方法简单、快速、成本低，适宜大规模工业化生产。
权利要求
1.二倍半萜类化合物peniroquesines，具有式I所示的结构：
2.权利要求1所述二倍半萜类化合物peniroquesines的制备方法，包括以下步骤：
(1)将娄地青霉接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物；所述娄地青霉的保藏编号为CGMCC NO.14140；
(2)将所述步骤(1)得到的娄地青霉发酵物与醇混合后超声提取，得到peniroquesines粗提物；
(3)以体积比在100:0～20:1范围内的多组氯仿-甲醇溶液为洗脱溶剂，硅胶柱色谱洗脱所述步骤(2)得到的peniroquesines粗提物，得到的多组洗脱液再分别经硅胶柱色谱纯化，得到二倍半萜类化合物peniroquesines，
所述硅胶柱色谱洗脱为：
用氯仿-甲醇溶液将所述peniroquesines粗提物溶解，得到粗提物溶液；
将所述粗提物溶液与peniroquesines粗提物干重质量0.8～1.5倍的硅胶混合，去除溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，分别得到体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱液；
取体积比为100:0的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比100:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine D洗脱液；
取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比60:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到含有peniroquesine B洗脱液；
取体积比为50:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比25:1～10:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，分别得到含有peniroquesine C和peniroquesine H洗脱液；
取体积比为10:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1的氯仿-甲醇为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine J洗脱液；
以甲醇为溶剂，将含有各化合物的洗脱液经葡聚糖凝胶纯化，分别得到各二倍半萜类化合物peniroquesines B、C、D、H和J。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养基的制作原料中含有马铃薯或大米，所述发酵的方式为固体发酵。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵的温度为20～28℃，发酵的时间为25～32d。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，娄地青霉发酵物与醇的质量体积比为(30～80)g:(50～150)mL。
6.权利要求1所述的二倍半萜类化合物peniroquesines中的至少一种在制备抗炎药物中应用。
7.权利要求1所述的二倍半萜类化合物peniroquesines中的至少一种在制备抗肿瘤药物中应用。
说明书
技术领域
本发明涉及萜类化合物技术领域，特别涉及一种二倍半萜类化合物peniroquesines B、C、D、H和J及其制备方法和应用。
背景技术
萜类化合物(terpenes)-分子式为异戊二烯单位的倍数的烃类及其含氧 衍生物，是具有高度多样性的一天然产物，包括单萜、倍半萜、二萜、二倍 半萜、三萜等。许多萜类衍生物已被发展为治疗癌症、细菌感染、疟疾和其 他各种人类疾病的重要药物，因此萜类的合成就显得非常的重要。但由于生 源合成途径仍未完全阐明、萜类化合物具有非模块化的结构、没有普适的统 一的合成策略等因素，因而萜类化合物的来源途径依赖于天然产物的提取。
二倍半萜类化合物(sesterterpenes)大部分属于海洋中各种海绵和藻类 植物及其内生真菌的次级代谢产物，在陆生植物中极为罕见，以往的研究发 现有极少数的微生物能够产生此类化合物。据文献报道，二倍半萜类化合物 具有抗炎、抗细胞毒、抗肿瘤以及抗菌等多种生物活性。
发明内容
本发明的目的在于提供可以通过微生物发酵得到的、新的具有抗炎及抗 肿瘤活性的二倍半萜类化合物。
本发明提供了二倍半萜类化合物peniroquesines，具有式I所示的结构：
本发明还提供了上述技术方案所述二倍半萜类化合物peniroquesines、 C、D、H和J的制备方法，包括以下步骤：
(1)将娄地青霉接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物； 所述娄地青霉的保藏编号为CGMCC NO.14140；
(2)将所述步骤(1)得到的娄地青霉发酵物与醇混合后超声提取，得 到peniroquesines粗提物；
(3)以体积比在100:0～20:1范围内的多组氯仿-甲醇溶液为洗脱溶剂， 硅胶柱色谱洗脱所述步骤(2)得到的peniroquesines粗提物，得到的多组洗 脱液再分别经硅胶柱色谱纯化，得到二倍半萜类化合物peniroquesines，
所述硅胶柱色谱洗脱为：
用氯仿-甲醇溶液将所述peniroquesines粗提物溶解，得到粗提物溶液；
将所述粗提物溶液与peniroquesines粗提物干重质量0.8～1.5倍的硅胶 混合，去除溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的 氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，分别得到体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、 5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱液；
取体积比为100:0的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比100:1的石油醚 -丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine D洗脱液；
取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比60:1的石油醚- 丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到含有peniroquesine B洗脱液；
取体积比为50:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比25:1～10:1的石油 醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，分别得到含有peniroquesine C和 peniroquesine H洗脱液；
取体积比为10:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1的氯仿-甲 醇为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine J洗脱液；
以甲醇为溶剂，将含有各化合物的洗脱液经葡聚糖凝胶纯化，分别得到 各二倍半萜类化合物peniroquesines B、C、D、H和J。
优选地，所述步骤(1)中发酵培养基的制作原料中含有马铃薯或大米， 所述发酵的方式为固体发酵。
优选地，所述步骤(1)中发酵的温度为20～28℃，发酵的时间为25～32d。
优选地，所述步骤(2)中，娄地青霉发酵物与醇的质量体积比为(30～80) g:(50～150)mL。
本发明还提供了所述的二倍半萜类化合物peniroquesines中的至少一种 在制备抗炎药物中应用。
本发明还提供了所述的二倍半萜类化合物peniroquesines中的至少一种 在制备抗肿瘤药物中应用。
本发明提供的二倍半萜类化合物peniroquesines是具有新颖的5/6/5/6/5 五环系新骨架结构，丰富了二倍半萜类化合物的多样性。同时，对化合物 peniroquesines B、C、D、H和J的NO(一氧化氮)抑制活性及对5种肿瘤 细胞抑制活性筛选试验表明，化合物peniroquesines B,D和H对NO的生成 表现出了明显的抑制活性，化合物peniroquesinesB-D及H对5种肿瘤细胞 表现出了明显的抑制活性。
进一步地，本发明提供的二倍半萜类化合物peniroquesines为娄地青霉 的代谢产物，可以通过微生物发酵制备得到，制备方法周期短、培养条件温 和、副产物少、立体选择性强、成本低。本发明提供的二倍半萜类化合物 peniroquesines制备方法简单易行，易于实现工业化，不仅符合现代环保和低 碳经济的需求，还能够为二倍半萜类化合物的量产提供新途径。
本发明提供的二倍半萜类化合物peniroquesines能够应用于制备抗炎及 抗肿瘤药物，为开发抗炎和抗肿瘤药物提供新的选择。
生物保藏说明：
娄地青霉(Penicillium roqueforti)，于2017年8月4日保藏在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所；生物保藏编号为CGMCC No.14140。
附图说明
图1为peniroquesine B的
图2为peniroquesine B的HMBC谱；
图3为peniroquesine B的HSQC碳谱；
图4为peniroquesine B的HR-ESI-MS谱；
图5为peniroquesine C的
图6为peniroquesine C的HMBC谱；
图7为peniroquesine C的HSQC碳谱；
图8为peniroquesine C的HR-ESI-MS谱；
图9为peniroquesine D的
图10为peniroquesine D的HMBC谱；
图11为peniroquesine D的HSQC碳谱；
图12为peniroquesineD的HR-ESI-MS谱；
图13为peniroquesine H的
图14为peniroquesine H的HMBC谱；
图15为peniroquesine H的HSQC碳谱；
图16为peniroquesine H的HR-ESI-MS谱；
图17为peniroquesine J的
图18为peniroquesine J的HMBC谱；
图19为peniroquesine J的HSQC碳谱；
图20为peniroquesine J的HR-ESI-MS谱。
具体实施方式
本发明提供了二倍半萜类化合物peniroquesines，具有式I所示的结构：
本发明中二倍半萜类化合物peniroquesines B、C、D、H和J的化学名 称分别为：
peniroquesine B：
(1S,3aR,5aS,5cS,8aS,10R,10aS,11bR)-1,6,6,8a,10a,11b-六甲基 -2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-十六氢-1H-双环戊[a,g]芴-10-醇；
peniroquesine C：
(1S,3aR,5aS,5cS,8aR,10R,10aS,11bR)-8a-(羟甲基)-1,6,6,10a,11b-五甲基 -2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-十六氢-1H-双环戊[a,g]芴-10-醇；
peniroquesine D：
(1S,3aS,4R,5aS,8aS,10R,10aS,11bR)-1,6,6,8a,10a,11b-六甲基 -2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-十六氢-1H-双环戊[a,g]芴-4,10-二醇；peniroquesine H：
(1S,3aS,4S,5aS,5cS,8S,8aS,10aS,11bR)-1,6,6,8a,10a,11b-六甲基 -2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-十六氢-1H-双环戊[a,g]芴-4,8-二醇；peniroquesine J：
(1S,3aR,5aS,5cS,8S,8aS,10R,10aS,11bR)-1,6,6,8a,10a,11b-六甲基 -2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-十六氢-1H-双环戊[a,g]芴-8,10-二醇。
本发明还提供了上述技术方案所述二倍半萜类化合物peniroquesines的 制备方法，包括以下步骤：
(1)将娄地青霉接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物； 所述娄地青霉的保藏编号为CGMCC NO.14140；
(2)将所述步骤(1)得到的娄地青霉发酵物与醇溶液混合后超声提取， 得到peniroquesines粗提物；
(3)以体积比在100:0～20:1范围内的多组氯仿-甲醇溶液为洗脱溶剂， 硅胶柱色谱洗脱所述步骤(2)得到的peniroquesines粗提物，得到的多组洗 脱液再分别经硅胶柱色谱纯化，得到二倍半萜类化合物peniroquesines，
所述硅胶柱色谱洗脱为：
用氯仿-甲醇溶液将所述peniroquesines粗提物溶解，得到粗提物溶液；
将所述粗提物溶液与peniroquesines粗提物干重质量0.8～1.5倍的硅胶 混合，去除溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的 氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，分别得到体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、 5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱液；
取体积比为100:0的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比100:1的石油醚 -丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine D洗脱液；
取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比60:1的石油醚- 丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到含有peniroquesine B洗脱液；
取体积比为50:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比25:1～10:1的石油 醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，分别得到化合物peniroquesine C和 peniroquesine H洗脱液；
取体积比为10:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1的氯仿-甲 醇为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine J洗脱液；
以甲醇为溶剂，将含有各化合物的洗脱液经葡聚糖凝胶纯化，分别得到 各二倍半萜类化合物peniroquesines B、C、D、H和J。
本发明将保藏编号为CGMCC NO.14140的娄地青霉接种于发酵培养基 中发酵，得到娄地青霉发酵物。在本发明中，所述发酵的温度优选为20～28℃， 更优选为25～27℃，所述发的酵时间优选为25～32d，更优选为30d。
在本发明中，所述娄地青霉进行接种前还优选包括在PDA斜面培养基 中活化。在本发明中，所述活化的温度优选为28℃，所述活化的时间优选为 3～7d。在本发明中，所述娄地青霉活化后优选置于4℃冰箱中储存备用。
本发明中，所述娄地青霉(Penicillum rpqueforti)保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14140。该娄 地青霉来源于黄草乌，是黄草乌(Aconitum vilmorinianum Kom.)的内生真 菌，更具体来说，所述娄地青霉从黄草乌根部分离得到。
在本发明中，所述发酵培养基的制作原料中优选包括马铃薯或大米，更 优选为以马铃薯为原料制作的发酵培养基。本发明中，所述发酵培养基能够 使娄地青霉生长繁殖即可。
在本发明中，所述发酵培养基优选经过灭菌处理。在本发明中，所述灭 菌的温度优选为120℃，所述灭菌的时间优选为30min。
在本发明中，所述娄地青霉的发酵方式优选为固体发酵。娄地青霉在液 体发酵中的代谢时间较长，本发明采用固体发酵方式能够缩短发酵时间。
在本发明中，所述娄地青霉的接种量优选为0.5～2.5g。
得到娄地青霉发酵物后，本发明将所述娄地青霉发酵物与醇溶液混合后 超声提取，得到peniroquesines粗提物。在本发明中，所述娄地青霉发酵物 与醇的质量体积比优选为(30～80)g:(50～150)mL，更优选为40～60g:80～120 mL，最优选为50g:100mL。在本发明中，所述醇溶液优选为甲醇、乙醇、 丙醇或异丙醇。本发明采用醇溶液将二倍半萜类化合物peniroquesines从娄 地青霉发酵物中分离出来。
本发明对所述混合的具体方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟 知的混合方式即可。
在本发明中，所述超声的时间优选为20～40min，更优选为30min；所 述超声的功率优选为250W～350W，更优选为300W。
超声完成后，本发明优选将超声提取产物过滤，取滤液并去除溶剂，得 到含有peniroquesines的粗提物。本发明优选采用减压蒸馏的方式去除所述 滤液中的溶剂，具体的如，将滤液减压浓缩至无醇味。在本发明中，所述减 压浓缩的压力优选为10～15kPa，更优选为13kPa；所述减压浓缩的温度优 选为48～55℃，更优选为50℃。
得到含有peniroquesines粗提物后，本发明以体积比在100:0～20:1范围 内的多组氯仿-甲醇溶液为洗脱溶剂，硅胶柱色谱洗脱所述peniroquesines粗 提物，得到的多组洗脱液再分别经硅胶柱色谱纯化，得到二倍半萜类化合物 peniroquesines，
所述硅胶柱色谱洗脱为：
用氯仿-甲醇溶液将所述peniroquesines粗提物溶解，得到粗提物溶液；
将所述粗提物溶液与peniroquesines粗提物干重质量0.8～1.5倍的硅胶 混合，去除溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的 氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，分别得到体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、 5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱液；
取体积比为100:0的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比100:1的石油醚 -丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine D洗脱液；
取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比60:1的石油醚- 丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到含有peniroquesine B洗脱液；
取体积比为50:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比25:1～10:1的石油 醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，分别得到含有peniroquesine C和 peniroquesine H洗脱液；
取体积比为10:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1的氯仿-甲 醇为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine J洗脱液；
以甲醇为溶剂，将含有各化合物的洗脱液经葡聚糖凝胶纯化，分别得到 各二倍半萜类化合物peniroquesines B、C、D、H和J。
在本发明中，所述用于溶解peniroquesines粗提物的氯仿-甲醇溶液为任 意体积比的氯仿-甲醇溶液。本发明优选采用200～300目硅胶进行洗脱。在 本发明中，所述去除溶剂的方法为减压蒸馏法；所述减压浓缩的温度优选为 48～55℃，更优选为50℃。
本发明对所获得的各氯仿-甲醇溶液洗脱部分进行硅胶柱层析洗脱时， 所述洗脱溶剂流速优选为2～4mL/min，更优选为3mL/min；所述洗脱溶剂 优选为氯仿-甲醇体系或石油醚-丙酮体系，更优选为石油醚-丙酮体系，具体 的，如取体积比为100:0的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比100:1的石油 醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine D洗脱液，取体积比 为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比60:1的石油醚-丙酮为溶剂过 硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine B洗脱液，取体积比为50:1的氯仿-甲 醇溶液洗脱部分，以体积比25:1～10:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，分别得到peniroquesine C和peniroquesine H洗脱液,取体积比为10:1的 氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1的氯仿-甲醇为溶剂过硅胶柱层析 洗脱，得到peniroquesine J洗脱液。
得到含有各化合物的洗脱液后，发明对所述洗脱液进行柱凝胶柱色谱纯 化，分别得到peniroquesines B、C、D、H和J。在本发明中，所述凝胶柱色 谱优选为葡聚糖凝胶柱色谱。在本发明中，所述凝胶柱色谱纯化时的溶剂优 选为甲醇。
在本发明中，所述甲醇的流速优选为0.4～0.6mL/min，更优选为0.5 mL/min。
本发明还提供了上述技术方案所述二倍半萜类化合物peniroquesines中 的至少一种在制备抗炎药物中的应用。在本发明中，所述抗炎药物中抗炎及 二倍半萜类化合物peniroquesines的质量百分数优选为1～99％，更优选为 55～90％。
本发明还提供了上述技术方案所述二倍半萜类化合物peniroquesines中 的至少一种在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述抗肿瘤药物中二 倍半萜类化合物peniroquesines的质量百分数优选为1～99％，更优选为 55～90％。
在本发明中，所述抗炎及抗肿瘤药物中还优选包括药用辅料，选择本领 域常规的制药辅料即可。
在本发明中，所述抗炎及抗肿瘤药物采用本领域熟知的制备方法制成片 剂、颗粒剂、注射剂剂型均可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行 详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
制备二倍半萜类化合物peniroquesines B、C、D、H和J
1、菌种活化：将娄地青霉(保藏编号为CGMCC NO.14140)接种到PDA 斜面培养基上，28℃恒温培养3～7d后，置于4℃冰箱中储存备用。
2、发酵培养基的制备：取洗净的土豆，分成直径1cm的土豆块置于组 织培养瓶中，50g/瓶，组织培养瓶加盖后在120℃下高温灭菌30min，冷却， 即得发酵培养基。
3、将步骤1活化的娄地青霉按照1％的接种量接种到步骤2制得的发 酵培养基，加盖后在28℃下恒温培养30d，得到娄地青霉发酵物。
4、取50g步骤3得到的娄地青霉发酵物与100mL甲醇混合，混合溶 液在40kHz条件下超声30min，过滤，取滤液进行减压浓缩至无醇味，得 到25.0gpeniroquesines粗提物。
5、用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液30mL溶解25.0g的peniroquesines 粗提物，再与25.0g硅胶(200目)混合，减压浓缩去除溶剂，装柱；依次 以体积比100:0，100:1，50:1，10:1，5:1的氯仿:甲醇进行梯度洗脱，洗脱流 速为2mL/min，各洗脱段得到5个部分；
取体积比为100:0的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比100:1的石油醚 -丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine D洗脱液，以体积比80:1 的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶 液洗脱部分，以体积比60:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到 peniroquesine B洗脱液，取体积比为50:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体 积比25:1～10:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine C和peniroquesine H洗脱液,取体积比为10:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分， 以体积比200:1的氯仿-甲醇为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine J 洗脱液；洗脱时，洗脱剂的流速为4mL/min。
以甲醇为溶剂，对洗脱液进行葡聚糖凝胶柱色谱纯化，干燥，得到化合 物peniroquesines B、C、D、H和J，甲醇的流速为0.4mL/min。
取实施例1制备得到的二倍半萜类化合物peniroquesines B、C、D、H 和J，通过2DNMR(二维核磁共振波谱)以及HR-ESI-MS(高分辨电喷雾 电离质谱)鉴定得到的化合物的结构，其中图1为peniroquesine B的
化合物peniroquesines B、C、D、H和J的H和与之相连接的C的化学 位移δ归属如表1所示，表2为peniroquesines B、C、D、H和J的
表1 peniroquesines B、C、D、H和J的
表2 peniroquesines B、C、D、H和J的
以peniroquesines B为例：
根据peniroquesines B的
由peniroquesines B的HMBC谱和
与peniroquesine B的碳谱数据对比显示，peniroquesine C、D、H和J 有着与peniroquesine B相同的骨架，其中peniroquesine C的HMBC谱中的 H-15，H-17与C-23相关，确定了C-23的甲基上连接了一个羟基； peniroquesine D的ROESY谱中H-5与H-4确定了C-5的绝对够型为R；
实施例2化合物peniroquesines B、C、D、H和J的抗炎活性：
一氧化氮(NO)具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症、肿瘤及 心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺 激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，产生NO进行免疫应 答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(购自中科院上海细 胞库)，用1μg/ml LPS进行诱导刺激，同时加入实施例1制备得到的化合物 peniroquesines B、C、D、H和J处理，化合物peniroquesines B、C、D、H 和J的终浓度依次为3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM和50μM五个梯 度，每个梯度设置三个平行样，25℃条件下培养。
设置不含药物组和L-NMMA(总NOS抑制剂)阳性药物组按照上述相 同步骤进行处理，作为对照。
(2)细胞过夜(10h)培养后，在570nm处检测各组的NO生成量； 向过夜培养得到的培养液中加入MTS进行细胞存活率检测，排除化合物对 细胞的毒性影响。
NO生成抑制率(％)＝(不含药物组OD570nm-药物组OD570nm)/不含 药物组OD570nm×100％；
IC50(半数抑制浓度)按Reed&Muench法计算，得到化合物 peniroquesines B、C、D、H和J的NO抑制活性的IC50。结果如表3所示。
实施例3化合物peniroquesines B、C、D、H和J的抗肿瘤活性：
MTS法检测细胞活性原理：MTS全称为3-(4， 5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetraz olium，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原 MTS，生成可溶性的甲臜(Formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在 490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可 根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
(1)接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640) 配成单个细胞悬液，以每孔3000～15000个细胞接种到96孔板，每孔体积 100μl，贴壁细胞提前12～24小时接种培养。
(2)加入待测化合物溶液：化合物用DMSO溶解，化合物以40μM、 8μM、1.6μM、0.32μM、0.064μM浓度复筛，每孔终体积200μL，每种处理 均设3个复孔。
(3)显色：37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加 MTS溶液20μL和培养液100μl；悬浮细胞弃100μL培养上清液，每孔加20μL 的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)， 继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
(4)比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取 各孔光吸收值，数据处理后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞 生长曲线，应用两点法(ReedandMuench法)计算化合物的IC50值。
(5)阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol) 两个阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线， 应用两点法(ReedandMuench法)计算化合物的IC50值。结果如表3所示。
表3为peniroquesines B、C、D、H和J的NO抑制活性及抗肿瘤活性 筛选结果，由表3可知，在对化合物peniroquesines B、C、D、H和J的NO 抑制活性(阳性对照为：L-NMMA)筛选试验中，化合物peniroquesine B， peniroquesine D以及peniroquesine H对一氧化氮(NO)的生成表现出了明 显的抑制活性。在对化合物peniroquesinesB、C、D、H和J对体外五种肿瘤 细胞的抑制活性(阳性对照为：顺铂，紫杉醇)筛选试验中,peniroquesines B-D，peniroquesine H及peniroquesine J均表现出了良好的抗肿瘤活性，因此，peniroquesinesB、C、D、H和J具有作为先导化合物开发抗炎及抗肿瘤药物 的研究价值。而基于微生物发酵的大量而简单的产生抗炎及抗肿瘤化合物 peniroquesines B、C、D、H和J的方法，不仅可以现代环境保护和低碳经济 的需求，而且为后期该抗炎及抗肿瘤化合物工业化量产的进一步研究和开发 打下了坚实的基础，具有显著的应用价值。
表3 peniroquesinesB、C、D、H和J的NO抑制活性及抗肿瘤活性筛选(IC50)
实施例3
1、菌种活化：将娄地青霉(保藏编号为CGMCC NO.14140)接种到PDA 斜面培养基上，28℃恒温培养3～7d后，置于4℃冰箱中储存备用。
2、发酵培养基的制备：取50g大米浸泡在40ml水中12h，取出大米 置于组织培养瓶中，50g/瓶，组织培养瓶加盖后在120℃下高温灭菌30min， 冷却，即得发酵培养基。
3、将步骤1活化的娄地青霉按照1％的接种量接种到步骤2制得的发酵 培养基，加盖后在26℃下恒温培养25d，得到娄地青霉发酵物。
4、取45g步骤3得到的娄地青霉发酵物与120ml甲醇按照质量体积比 混合，混合溶液在40kHz条件下超声30min，过滤，取滤液进行减压浓缩 至无醇味，得到peniroquesines粗提物。
5、用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液30ml溶解25.0g的peniroquesines粗 提物，再与25.0g硅胶(300目)混合，减压浓缩去除溶剂，装柱；依次以 体积比100:0，100:1，50:1，10:1，5:1的氯仿:甲醇进行梯度洗脱，合并各洗 脱段得到5个部分，取体积比为100:0的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比 100:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine D洗脱液， 取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比60:1的石油醚-丙酮 为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到peniroquesine B洗脱液，取体积比为50:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比25:1～10:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶 柱层析洗脱，得到peniroquesine C和peniroquesine H洗脱液,取体积比为10:1 的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1的氯仿-甲醇为溶剂过硅胶柱层 析洗脱，得到peniroquesine J洗脱液。以甲醇为溶剂，对洗脱液进行葡聚糖 凝胶柱色谱纯化，干燥，得到化合物peniroquesines B、C、D、H和J。
对本实施例制得的化合物peniroquesinesB、C、D、H和J的结构进行表 征，结果与实施例1类似。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
一种二倍半萜类化合物peniroquesines及其制备方法和应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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