专利摘要

专利摘要

本发明公开了以羰基还原酶为生物催化剂，经不对称还原5种噻吩基酮类底物合成相应(S)构型醇的方法。该方法的催化剂易制备，水相催化，反应条件温和，反应体系简单，无副反应，ee值绝大多数大于99％，为噻吩基手性醇类生产提供了环境友好的生物催化方法，并具有工业应用潜力。

权利要求

1.一种S构型醇的制备方法，其特征在于以结构通式(I)为底物，经羰基还原酶不对称生物催化得到S构型醇，

其中R取代基为COOCH₃，所用的羰基还原酶为ChKRED12，其氨基酸序列NCBI登录号为：KC342012；R取代基为CH₂Cl或CN，所用的羰基还原酶为ChKRED07，其氨基酸序列NCBI登录号为：KC342007。

说明书

技术领域

本发明属于酶与生物催化领域，具体涉及利用羰基还原酶生物催化生产噻吩基手性醇类化合物的方法。

背景技术

度洛西汀(Duloxetine)是第三代抗抑郁药，是市场销售最主要的抗抑郁药之一，能有效地抑制5-羟色氨和去甲肾上腺素的再摄取(Wong，D.T.，et al.Life Sci，1988，43：2049-2057)，并且对全身疼痛、胃肠道紊乱等疾病也有良好的药效。研究表明(S)-度洛西汀(化学名，(S)-(+)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩)-丙胺)才具有药物活性，因此(S)构型中间体的获得成为度洛西汀合成中的关键步骤。

度洛西汀手性中间体的生产目前还采用化学工艺还原后进行手性拆分，其主要存在的问题有：需要大量的拆分剂，反应步骤长，能耗大；废物排放量大，环境污染严重；产率低，产品光学纯度不高，重金属残留问题。基于生物催化立体选择性高、副产物少、反应条件温和以及环境友好等方面的独特优势，利用生物催化生产度洛西汀中间体的研究也迅速发展。

分析(S)-度洛西汀的结构，根据反向合成策略以及底物易催化、稳定等原则，可以利用如下所列的5种噻吩基酮类底物S1-S5经不对称还原可获得度洛西汀手性中间体(Tang，C.G.，et al.Biotechnol Lett，2011，33(7)：1435-1440)。

这些噻吩酮的生物催化研究主要集中在底物S1、S2和S5，而S3和S4目前还没有生物催化的报道。噻吩酮S1、S2和S5生物催化的文献报道的主要水平如下：

(1)底物S1：底物浓度10g/l，6h反应结束，产物ee值>98％(Wada，M.，et al.BiosciBiotech Bioch，2004，68(7)：1481-1488)。

(2)底物S2：底以物Rho浓do度r1or0ugl/aL，glu反ti应ni6sh，全细产胞物为ee催>化98剂％，底物浓度30g/l，反应48h，转化率>95％，ee值>99％(Tang，C.G.，etal.Biotechnol Lett，2011，33(7)：1435-1440)；以ChKRED15粗酶液为生物催化剂，在2h内可转化20g/l的底物，转化率为99％以上，ee值大于99.9％(CN103740738A)。

(3)底物S5：以Candida tropicalis为生物催化剂，底物浓度1g/l，反应60h，产物ee值>99％(Soni，P.，et al.App Microbiol Biotechnol，2005，67(6)：771-777)；以醇脱氢酶ADH-LK为生物催化剂，底物浓度100g/l，反应24h，产物ee值>99％(Codexis，INC.WO2010025238A2)。

尽管研究者们筛选了多种微生物菌株(或者羰基还原酶)来实现上述S1、S2和S5底物的生物催化，但总体说来，酶源仍然较少，多数催化过程是以原始菌为生物催化剂；同时，底物投料浓度也普遍较低(仅有S5有专利报道投料可实现100g/l)，离应用还有较大距离。积极开发更多新的优良酶源，将为实现噻吩基手性醇类化合物的生物催化合成奠定坚实基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种以羰基还原酶为生物催化剂制备噻吩基手性醇类化合物的方法。具体地，本发明所用的底物为如下结构通式(I)，利用不同的高效高选择性羰基还原酶为生物催化剂，经不对称还原获得相应(S)构型手性醇。

生物催化过程可表示如下：

其中，R取代基可以为含酯结构，卤素取代烷基或者含氨基结构等；

进一步，R取代基为COOCH₃，COOCH₂CH₃，CONHCH₃，CH₂Cl，CN或者CH₂N(CH₃)₂，这些底物经羰基还原酶生物催化获得S构型醇，可作为度洛西汀合成中的手性中间体。

本发明涉及的生物催化剂来自本实验构建的羰基还原酶工具箱。根据本领域的公共知识，本领域技术人员可通过以下方式获得生物催化剂。首先，羰基还原酶的信息(基因序列和氨基酸序列)可通过该酶的NCBI登录号查询(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者从说明书序列表中的序列(SEQ ID：No.1-4)中获知，然后经基因合成公司合成获得，并以常规技术手段构建大肠杆菌表达体系，经过量表达获得下述酶作为生物催化剂。

本发明最适的底物和相应羰基还原酶如下：

(1)

催化底物S1的羰基还原酶有：KRED2157(基因序列为SEQ ID：No.1，氨基酸序列为SEQ ID：No.2)，ChKRED07(NCBI登录号：KC342007)，ChKRED10(NCBI登录号：KC342010)，ChKRED11(NCBI登录号：KC342011)，ChKRED12(NCBI登录号：KC342012)或者ChKRED14(NCBI登录号：KC342014)。

底物S1的同系物S1-1，其结构式为 本发明中能催化S1的上述羰基还原酶同样能够催化该化合物，得到相应S构型醇。

(2)

催化底物S2的羰基还原酶有：ChKRED07(NCBI登录号：KC342007)，KRED2157(基因序列为SEQ ID：No.1，氨基酸序列为SEQ ID：No.2)，ChKRED03(NCBI登录号：KC342003)，ChKRED10(NCBI登录号：KC342010)，ChKRED23(NCBI登录号：KC342023)，ChKRED24(NCBI登录号：KC342024)，ChKRED26(NCBI登录号：KC342026)或者ChKRED14(NCBI登录号：KC342014)。

(3)

催化底物S3的羰基还原酶有：ChKRED07(NCBI登录号：KC342007)或者KRED2935(基因序列为SEQ ID：No.3，氨基酸序列为SEQ ID：No.4)。

(4)

催化底物S4的羰基还原酶有：ChKRED07(NCBI登录号：KC342007)，ChKRED10(NCBI登录号：KC342010)，ChKRED11(NCBI登录号：KC342011)，ChKRED12(NCBI登录号：KC342012)，ChKRED14(NCBI登录号：KC342014)，KRED2157(基因序列为SEQ ID：No.1，氨基酸序列为SEQID：No.2)，ChKRED03(NCBI登录号：KC342003)或者KRED2935(基因序列见SEQ ID：No.3，氨基酸序列见SEQ ID：No.4)。

(5)

催化底物S5的羰基还原酶有：ChKRED10(NCBI登录号：KC342010)，ChKRED03(NCBI登录号：KC342003)或者ChKRED05(NCBI登录号：KC342005)。

本发明的生物催化体系及反应条件：

(1)生物催化剂为休止细胞时，生物催化体系为：磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6～8)、羰基还原酶重组菌休止细胞、结构通式(I)底物和葡萄糖。休止细胞浓度为50～300g/l(以湿菌体计)；结构通式(I)底物的终浓度为1～100g/l；葡萄糖的浓度为1％～5％(w/v)。

底物先溶解于DMSO中配制成30～50％(w/v)贮存液。

(2)生物催化剂为羰基还原酶纯酶或者粗酶时，生物催化体系为：

磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6～8)、羰基还原酶、结构通式(I)底物和还原型辅酶NAD(P)H；

或者，生物催化体系为：

磷酸盐缓冲(0.1M，pH6～8)、羰基还原酶、结构通式(I)底物、氧化型辅酶NAD(P)⁺，葡萄糖脱氢酶和葡萄糖。

羰基还原酶的酶量可根据底物浓度调整，较优的浓度为纯酶0.1～10g/l，粗酶1～20g/l(以总蛋白量计)；底物终浓度为1～150g/l；NAD(P)⁺浓度0.1～1g/l；葡萄糖脱氢酶浓度2U/ml～50U/ml；葡萄糖的浓度为5％～15％(w/v)。

生物催化条件：温度20～35℃，转速50～220rpm，转化时间为1～24h。

本发明的有益效果：

本发明公开了以羰基还原酶生物催化方法获得噻吩基手性醇类化合物，该方法的催化剂易制备，水相催化，反应条件温和，反应体系简单，无副反应，ee值绝大多数大于99％，为噻吩基手性醇类生产提供了可选择的环境友好的生物催化方法。本发明涉及的羰基还原酶较多，为这类化合物生物催化提供了丰富的酶源。

本发明所获得的手性中间体P1-P5均可作为度洛西汀合成中的中间体。以生产P1产物为例，ChKRED12催化底物S1时，底物浓度为100g/l时,转化率>99％，ee值>99％，具有很强的工业应用潜力。

需要说明的是，根据本领域公共知识，由于核苷酸的密码子的简并性，凡是上述羰基还原酶经等位基因突变或者具有一个或多个氨基酸添加、插入、缺失或/和取代且具有催化结构式(I)底物生成相应(S)构型醇的酶均属于本发明的保护范围。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1：羰基还原酶的筛选

以本领域熟知的方法，将羰基还原酶基因连入pET28a(+)载体，转入大肠杆菌BL21-DE3中异源表达，获得休止细胞作为生物催化剂。筛选时，生物催化及体系为：磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)、羰基还原酶重组菌休止细胞150g/l(以湿菌体计)、底物1g/l和葡萄糖2％(w/v)。反应时间为24h，反应温度30℃，转速200rpm。

同时，将没有连入羰基还原酶基因的pET28(+)空载体同样转入大肠杆菌BL21-DE3中异源表达，以此休止细胞为空白对照转化各类底物。以下展示的筛选结果，空白对照均不能转化底物。

反应结束后，以等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，而后减压旋蒸除去溶剂，加入异丙醇(HPLC级)溶解样品，高速离心后HPLC测定样品的转化率及产物ee值。

(1)羰基还原酶催化底物S1：

转化率检测：SIL-100A(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝70:30；流速：0.4ml/min；出峰时间：底物9.3min，产物10.1min。

产物ee值检测：Daicel CHIRALCEL AD-H(4.6×250mm)柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝98:2；流速：0.8ml/min；出峰时间：S型39.0min，R型40.5min。

能够转化底物S1的羰基还原酶及其转化率和ee值见下表1：

表1

(2)羰基还原酶催化底物S1-1：

转化率检测：SIL-100A(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝70:30；流速：0.4ml/min；出峰时间：底物9.9min，产物11.2min。

产物ee值检测：Daicel CHIRALCEL AS-H(4.6×250mm)柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝95:5流速：0.8ml/min；出峰时间：S型42.2min，R型43.3min。

能够转化底物S1的羰基还原酶及其转化率和ee值见下表2：

表2

由于底物S1和S1-1结构很类似，因此能转化两者的羰基还原酶相同，只是转化率有差异。

(3)羰基还原酶催化底物S2：

转化率测定：SIL-100A(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝70:30；流速：0.8ml/min；出峰时间：底物12.0min，产物8.9min。

产物ee值检测：Daicel CHIRALCEL OJ-H(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝90:10；流速：0.5ml/min；出峰时间：S型22.8min，R型24.2min。

能够转化底物S2的羰基还原酶及其转化率和ee值见下表3：

表3

(4)羰基还原酶催化底物S3：

转化率检测：SIL-100A(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝70:30；流速：0.4ml/min；出峰时间：底物8.9min，产物9.8min。

产物ee值检测时：Daicel CHIRALCEL AS-H(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝97:3；流速：0.8ml/min；出峰时间：S型21.6min，R型23.7min。

能够转化底物S3的羰基还原酶及其转化率和ee值见下表4：

表4

(4)羰基还原酶催化底物S4：

转化率检测：SIL-100A(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝70:30；流速：0.8ml/min；出峰时间：底物7.8min，产物5.3min。

产物ee值测定：Daicel CHIRALCEL OJ-H(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v)：hexane:isopropanol＝80:20；流速：0.8ml/min；出峰时间：S型21.0min，R型23.7min。

能够转化底物S4的羰基还原酶及其转化率和ee值见下表5：

表5

(5)羰基还原酶催化底物S5：

转化率检测和产物ee值检测条件：Daicel CHIRALCEL OJ-H(4.6×250mm)；柱温：35℃；流动相(v/v),hexane:isopropanol:triethylamine＝95:5:1.5；流速：0.8ml/min；出峰时间：底物11.2min,S型产物13.5min，R型12.2min。

能够转化底物S5的羰基还原酶及其转化率和ee值见下表6：

表6

实施例2：高效辅酶循环体系的构建

以纯酶或者粗酶作催化剂时，可加入葡萄糖脱氢酶和葡萄糖构建辅酶循环体系。

辅酶循环体系可以表示为(底物以S2为例)：

葡萄糖脱氢酶采用已商品化的高效葡萄糖脱氢酶，购买于Sigma(CAS：9028-53-9)。为保证反应的高效进行，辅酶的供应必须充足。反应体系中葡萄糖浓度为10％(w/v),葡萄糖脱氢酶为20U/ml。随着反应的进行，葡萄糖酸的量逐步累积，反应体系pH随之下降。为了使反应高效的持续进行，反应体系的pH应控制在6.5-8.0之间，实际应用中使用10％NaOH水溶液采取间歇的方式调节pH。

实施例3：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化10g/l底物S1

取新鲜培养的羰基还原酶ChKRED12重组菌湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。

磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，羰基还原酶ChKRED12浓度10mg/ml(粗酶液)，底物S1浓度10g/l，GDH浓度20U/ml，葡萄糖10％(w/v)，NADP⁺浓度0.2mM，30℃，转化时间2h，反应过程中每30min调节一次pH至8.0。等体积乙酸乙酯萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1(1)相同。结果表明2h内10g/l底物就能转化完全，且产物的ee值大于99.9％。

实施例4：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化20g/l底物S1

除S1底物浓度增加到20g/l以外，其余反应体系与实施例3相同，转化时间5h，反应过程中每30min调节一次pH至8.0。等体积乙酸乙酯萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1(1)相同。结果表明5h内10g/l底物就能转化完全，且产物的ee值大于99.9％。

实施例5：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化50g/l底物S1

除S1底物浓度增加到50g/l以外，其余反应体系与实施例3相同，转化时间12h，反应过程中每30min调节一次pH至8.0。等体积乙酸乙酯萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1(1)相同。结果表明12h内50g/L底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。

实施例6：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化100g/l底物S1

除S1底物浓度增加到100g/l以外，其余反应体系与实施例3相同，转化时间24h，反应过程中每30min调节一次pH至8.0。等体积乙酸乙酯萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1(1)相同。结果表明24h内100g/l底物S1可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。

实施例7：羰基还原酶KRED2157粗酶液催化10g/l底物S2

取新鲜培养的羰基还原酶KRED2157重组菌湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。

磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，羰基还原酶KRED2157浓度10mg/ml(粗酶液)，底物S2浓度10g/l，GDH浓度20U/ml，葡萄糖10％(w/v)，NADP⁺浓度0.2mM，30℃，转化时间2h，反应过程中每2h调节一次pH至8.0。等体积乙酸乙酯萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1(3)相同。结果表明24h内10g/l底物S2就能转化完全转化，且产物的ee值大于99.9％。

实施例8：羰基还原酶ChKRED07粗酶液催化20g/l底物S3

取新鲜培养的羰基还原酶ChKRED07重组菌湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。

磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，羰基还原酶ChKRED07浓度10mg/ml(粗酶液)，底物S3浓度20g/l，GDH浓度20U/ml，葡萄糖10％(w/v)，NADP⁺浓度0.2mM，30℃，转化时间24h，反应过程中每2h调节一次pH至8.0。等体积乙酸乙酯萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1(4)相同。结果表明，转化率大于99％，且产物的ee值大于99.9％。

实施例9：羰基还原酶ChKRED07粗酶液催化20g/l底物S4

取新鲜培养的羰基还原酶ChKRED07重组菌湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。

磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，羰基还原酶ChKRED07浓度10mg/ml(粗酶液)，底物S4浓度20g/l，GDH浓度20U/ml，葡萄糖10％(w/v)，NADP⁺浓度0.2mM，30℃，转化时间24h，反应过程中每2h调节一次pH至8.0。等体积乙酸乙酯萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1(5)相同。结果表明，转化率大于99％，且产物的ee值大于99.9％。

羰基还原酶生物催化生产噻吩基手性醇类化合物专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。