专利摘要

本发明涉及微生物和食品技术领域，具体涉及到一株产蛋白的菌株及其应用。该菌株可利用的底物非常丰富，可充分利用工业废水、农副产品等来源广泛、廉价的底物原料作为碳源或氮源。发酵获得的菌丝体中的蛋白含量非常高，且氨基酸种类齐全，具有广泛的应用价值。

权利要求

1.一株产蛋白的镰刀菌（Fusarium venenatum），其特征在于，其于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 20740。

2.如权利要求1所述的镰刀菌在生产菌丝蛋白中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，通过所述镰刀菌的发酵以产生菌丝蛋白，其中所述镰刀菌的发酵培养基的氮源为无机氮源或有机氮源。

4.一种利用权利要求3所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，所述无机氮源为尿素、或(NH4)2SO4。

5.一种利用权利要求3所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，所述有机氮源为蛋白胨、酵母粉或豆饼粉。

6.一种利用权利要求3至5任一项所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，在所述镰刀菌的发酵培养基中添加有胶原蛋白肽、乳清蛋白肽、或乳清蛋白。

7.一种利用权利要求6所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，所述胶原蛋白肽、乳清蛋白肽、或乳清蛋白在培养基中的添量为0.5g/L-2g/L。

8.一种利用权利要求3所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，所述有机氮源是对猪、牛、羊的皮或骨、水产下脚料通过酶解法制备得到的胶原蛋白。

9.一种利用权利要求8所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，所述水产下脚料是鱼皮、鱼鳞、或鱼骨。

10.一种利用权利要求3所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，所述有机氮源是生产干酪或干酪素形成的乳清副产物。

说明书

技术领域

本发明涉及食品技术领域，具体涉及到一株产菌丝蛋白镰刀菌及其在生产菌丝蛋白中的应用。

背景技术

上世纪60年代末，英国Ranks Hovis McDougall( RHM) 食品公司最先开创真菌蛋白的研究和开发工作，经广泛的全球性的寻找, 终于在英国Marlow 地区的小麦田附近的土壤中发现镰刀菌可以做为充足而又有效的蛋白质源。菌丝蛋白产品含有丰富的蛋白质，一般在40%～80%，氨基酸的种类齐全，比例适当，含动物体所需的各种氨基酸，特别是赖氨酸含量较高，色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸也较丰富，含有畜禽生长所必需的限制性氨基酸，可以最大限度的保证畜禽的生长需要；富含碳水化合物、功能性糖、核酸、维生素和无机盐等，还含有多种酶、激素、游离核苷酸等活性物质，能促进机体对营养物质的吸收利用。

与其它蛋白来源相比，菌丝蛋白营养全面，生产原料易得，周期短，单位面积产率高，且具有不受环境和气候的影响、可连续生产、绿色环保等优势，市场前景广阔。菌丝蛋白的生产可以充分利用工业废水、农副产品等广泛的原料作为培养基，然后经过净化干燥处理后制成，生产工艺简单，生产效率高，单位面积蛋白生产效率比种植大豆高8000倍，比牛的蛋白生产效率高80000倍，可以实现绿色连续生产。中国专利文献CN108077595A公开了一种通过将各车间所产生的菌丝体蛋白液经过一些处理获得蛋白粉。中国专利文献CN102860432A中公开了一种磨菇菌丝体蛋白鱼饲料的加工工艺，包括将农作物秸秆、新鲜的猪粪便和新鲜的鸡粪便混合堆置发酵，制得发酵成熟的培养料；在发酵成熟的培养料中接入磨菇菌丝体菌种，培养制得磨菇菌丝体蛋白原料；将磨菇菌丝体蛋白原料制干后粉碎。

但是利用微生物发酵高效直接产生的菌丝蛋白尚需进一步开发研究。

发明内容

针对现实的需求，本发明人经过研究筛选获得一株能够高效生产菌丝蛋白的镰刀菌，其能够利用不同的氮源，获得的蛋白含量非常高的菌丝蛋白产物。

因此，本发明首先提供一株镰刀菌TB01，其中镰刀菌TB01的保藏编号为CGMCC NO.20740，分类命名为镰刀菌Fusarium venenatum，于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。所述镰刀菌TB01是从土壤中筛选获得，经鉴定是镰刀菌Fusarium venenatum。

本发明由此提供所述的镰刀菌在生产菌丝蛋白中的应用。

进一步地，本发明提供利用所述的镰刀菌生产菌丝蛋白的方法，其特征在于，通过所述镰刀菌的发酵以产生菌丝蛋白，其中所述镰刀菌的发酵培养基的氮源为无机氮源或有机氮源。

在一些具体实施方式中，所述无机氮源为尿素、或(NH4)2SO4，或所述有机氮源为蛋白胨、酵母粉或豆饼粉。更优选地，在所述镰刀菌的发酵培养基中添加有胶原蛋白肽、乳清蛋白肽、或乳清蛋白优化氮源。进一步优选地，所述胶原蛋白肽、乳清蛋白肽、或乳清蛋白在培养基中的添量为0.5g/L-2g/L，更优选添加量为1g/L。

在另一些实施方式中，所述有机氮源是对猪、牛、羊的皮或骨、水产下脚料通过酶解法制备得到的胶原蛋白。其中，所述水产下脚料优选的是鱼皮、鱼鳞、或鱼骨。

在另一些实施方式中，所述有机氮源是生产干酪或干酪素形成的乳清副产物。

本发明的镰刀菌可利用的底物非常丰富，可充分利用工业废水、农副产品（如水产加工副产物、奶酪加工副产物）等来源广泛、廉价的底物原料作为碳源或氮源，可极大降低工业化应用成本；不同氮源条件下发酵，获得的菌丝体中菌丝蛋白的含量均大于40%，甚至高于60%，同时菌丝蛋白作为丰富蛋白含量的载体，氨基酸种类齐全，且根据食品毒素检测标准要求，未检测出毒素，具有良好的食品应用基础。该镰刀菌产物种类丰富，可发酵获得包括蛋白质、脂质、膳食纤维等多种营养成分，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为镰刀菌TB01菌株的菌落形态图；

图2为镰刀菌TB01菌株的菌丝体形态图；

图3为基于ITS序列构建镰刀菌Fusarium venenatum TB01系统发育树。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、镰刀菌Fusarium venenatum TB01的获得

2020年07月在天津市滨海新区采集小麦土地的根际土壤。

分离过程：根际土样混匀，称取5 g，放入盛有95 mL无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于30℃、180 rpm振荡30 min。取土壤悬液1 mL进行10 -1 -10 -7 系列浓度梯度稀释，然后取10 -5、10 -6、10 -7三个稀释度涂布至合成低营养SNA培养基的平板上，于28℃倒置培养2d。

纯化过程：采用菌丝末端逐级移植法进行纯化。菌落在平板上形成后，挑取单菌落边缘处的菌丝于PDA培养基平板上，继续28℃恒温培养，直至获得纯菌落，将获得菌落4℃保存。

复筛过程：将获得的菌落用接种环接2环至盛有200 μl 无机盐培养基的98孔酶标板中，在28℃条件下利用Microscreen仪器检测生长速度，挑选生长速度最快20菌株；并将获得的20株菌的培养液离心，培养物利用总有机碳/总氮分析仪（N/C 2100S）测定蛋白含量，筛选出蛋白含量最高菌株（编号TB01），将获得菌落4℃保存以备进行形态特征和分子鉴定。

其中，所述合成低营养琼脂SNA培养基的配方为： KH2PO4 1 g/L，KNO3 1g/L，MgSO4. 0.5 g/L，KCl 0.5g/L，蔗糖 0.2 g/L，琼脂 20 g/L，高压蒸汽灭菌（121℃）灭菌20min。SNA培养基加入适量抗生素，氯霉素（抑制革兰氏阳性菌），母液50 mg/mL，工作浓度50mg/L；链霉素（抑制革兰氏阴性菌），母液 350 mg/mL，工作浓度 350 mg/L；将配置好的两种抗生素按 1:1 的比例混匀备用，待培养基冷却至 50℃时，1:1 比例加入SNA培养基。

其中，所述PDA培养基的配方为： 称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，高压蒸汽灭菌（121℃）灭菌20 min。

无机盐培养基：Na3C6H5O7·2H2O 2.6 g/L，KNO3 2.52 g/L，(NH4)2SO4 2.88 g/L，KH2PO4 1.6 g/L，MgSO4 0.2 g/L，添加葡萄糖为2%，高压蒸汽灭菌（121℃）灭菌20 min。

实施例2、菌株TB01的形态特征

将菌株TB01接种到PSA培养基中，24-25℃下培养基4 d。根据生长速度，描述菌丝形状，菌落色泽、小型分生孢子、大型分生孢子的数量及形状，产孢细胞，厚垣孢子的形状和有无，子实体类型等，对该菌株进行鉴定。

培养性状：4 d菌落直径3.8 cm，PSA培养基上菌丝初期絮状，后变为绒状至粉状，白色至粉红色，基物表面白色，基物不变色；

形态特征：大型分生孢子大小比较一致，粗胖，中部比较均匀，顶部细胞楔形，基胞无足跟，3-4分隔，多为4-6分隔。量度: 28. 32-42. 50 μm×4. 63-4. 54 μm；小型分生孢子缺或极少；无厚垣孢子；单瓶梗产孢，有性阶段未见。

其中，马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA培养基）：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20 g蔗糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，高压蒸汽灭菌（121℃）灭菌20 min。

实施例3、菌株TB01的ITS序列分析

将菌株TB01接种到PDA培养基中，于30℃，180 rpm摇床培养24 h，收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，采用下述真核生物ITS基因序列的通用引物按常规的方法进行ITS基因序列的PCR扩增：FP1:5′- AGTAAAAGTCGTAACAAGGT-3′和FP2:5′-TTCACTCGCCGTTACTAGGG-3′。

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果表明该菌株的ITS基因序列如SEQ ID No.1所示。将其与GenBank数据库中的序列进行比对，并利用MEGA 7.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图3所示。

通过形态特征和TIS序列分析可知，菌株TB01为镰刀菌Fusarium venenatum，命名为镰刀菌Fusarium venenatum TB01。该菌株于2020年10月12日藏保于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO. 20740。

实施例4、以不同氮源发酵生产菌丝蛋白

将镰刀菌TB01接种与PDA平板种子培养基中，30℃，培养48 h活化菌株。将活化好的菌株用接种环接3环到盛有20 mL种子培养基的100 mL摇瓶中， 30℃，250 rpm培养48 h。按照5%的接种量，取5 ml种子液接种到盛有95 ml不同氮源发酵培养基的250 ml摇瓶中，30℃，250 rpm培养48 h。离心收集发酵菌体蛋白，用无菌水清洗三遍后60℃烘干24 h。称取0.1g干菌丝体至20 ml无菌水中，震荡摇匀后，利用超声仪超声使菌丝体完全混匀，形成均一溶液，利用总有机碳/总氮分析仪（N/C 2100S ）测定总氮含量并计算菌丝体蛋白含量。

研究了不同氮源对蛋白含量的影响，当以硫酸铵为氮源时，随着硫酸铵浓度的增加蛋白含量增加；以尿素为氮源时，其蛋白含量也可以达到45%以上；有机氮源中蛋白胨获得蛋白含量最高，可达到55.8%。

表1 不同氮源对蛋白含量的影响

由上表可知，虽然采用不同的氮源，获得的菌丝体中菌丝蛋白的含量均大于40%，但不同氮源对蛋白含量仍有不同的影响，当以硫酸铵为氮源时，随着硫酸铵浓度的增加蛋白含量增加；以尿素为氮源时，其蛋白含量也可以达到45%以上；有机氮源中蛋白胨获得蛋白含量最高，可达到55.8%。

其中，本实施例中所用的种子培养基：2.6 g/L Na3C6H5O7·2H2O，2.52 g/L KNO3，2.88 g/L (NH4)H2PO4，1.6 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，添加葡萄糖为2%；所述不同氮源发酵培养基：2.6 g/L Na3C6H5O7·2H2O，2.52 g/L KNO3，1.6 g/LKH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，氮源种类和含量如表1，葡萄糖为5%。

实施例5、添加胶原蛋白肽发酵生产菌丝蛋白

将镰刀菌TB01接种与PDA平板种子培养基中，30℃，培养48 h活化菌株。将活化好的菌株用接种环接3环到盛有20 mL种子培养基的100 mL摇瓶中， 30℃，250 rpm培养48 h。按照5%的接种量，取5 ml种子液接种到盛有95 ml胶原蛋白肽氮源发酵培养基的250 ml摇瓶中，30℃，250 rpm培养48 h。离心收集发酵菌体蛋白，用无菌水清洗三遍后60℃烘干24 h。称取0.1g 干菌丝体至20 ml无菌水中，震荡摇匀后，利用超声仪超声使菌丝体完全混匀，形成均一溶液，利用总有机碳/总氮分析仪（N/C 2100S）测定总氮含量并计算菌丝体蛋白含量。实验中设置不添加胶原蛋白肽的发酵培养基作为对照（即相对于胶原蛋白肽氮源发酵培养基而言，不添加胶原蛋白肽），实验重复三次，记录和计算获得结果。实验结果表明发酵液中添加胶原蛋白肽为氮源的菌丝体中蛋白含量为46.82±0.62%，不添加胶原蛋白肽发酵获得菌丝蛋白含量仅为44.87±0.53%，蛋白含量提高比例为4.34%。该实验也表明即使不添加胶原蛋白肽这一氮源，所述的菌丝蛋白的蛋白含量也是非常高的（达44.87%）。但与不添加胶原蛋白肽发酵相比，添加胶原蛋白肽发酵菌丝体蛋白含量均有一定量提高。

其中，所述种子培养基：2.6 g/L Na3C6H5O7·2H2O，2.52 g/L KNO3，2.88 g/L(NH4)H2PO4，1.6 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，添加葡萄糖为2%；所述胶原蛋白肽氮源发酵培养基：10 g/L酵母粉，2.6 g/L Na3C6H5O7·2H2O，2.52 g/LKNO3，2.88 g/L (NH4)H2PO4，1.6 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，胶原蛋白肽1 g/L，添加葡萄糖为5%。

实施例6、添加乳清蛋白肽发酵生产菌丝蛋白

将镰刀菌TB01接种与PDA平板种子培养基中，30℃，培养48 h。将活化好的菌株用接种环接3环到盛有20 mL种子培养基的100 mL摇瓶中， 30℃，250 rpm培养48 h。按照5%的接种量，取5 ml种子液接种到盛有95 ml乳清蛋白肽氮源发酵培养基的250 ml摇瓶中，30℃，250rpm培养48 h。离心收集发酵菌体蛋白，用无菌水清洗三遍后60℃烘干24 h。称取0.1g 干菌丝体至20 ml无菌水中，震荡摇匀后，利用超声仪超声使菌丝体完全混匀，形成均一溶液，利用总有机碳/总氮分析仪（N/C 2100S）测定总氮含量并计算菌丝体蛋白含量。

实验中设置不添加乳清蛋白肽的发酵培养基作为对比（即相对于乳清蛋白肽氮源发酵培养基而言，不添加乳清蛋白肽），实验重复三次，记录和计算结果。实验结果表明，通过添加乳清蛋白肽发酵获得菌丝蛋白，经检测蛋白含量达到48.04±0.81%。而未添加乳清蛋白肽的发酵培养基，发酵获得的菌丝蛋白含量为44.87±0.53%。因此，添加乳清蛋白肽发酵获得菌丝蛋白含量提高比例达到7.06%。

其中，所述种子培养基：2.6 g/L Na3C6H5O7·2H2O，2.52 g/L KNO3，2.88 g/L(NH4)H2PO4，1.6 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，添加葡萄糖为2%；所述乳清蛋白肽氮源发酵培养基：10 g/L酵母粉，2.6 g/L Na3C6H5O7·2H2O，2.52 g/LKNO3，2.88 g/L (NH4)H2PO4，1.6 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，乳清蛋白肽1 g/L，添加葡萄糖为5%。

实施例7、添加乳清蛋白发酵生产菌丝蛋白

将镰刀菌TB01接种与PDA平板培养基中，30℃，培养48 h。将活化好的菌株用接种环接3环到盛有20 mL种子培养基的100 mL摇瓶中，30℃，250 rpm培养48 h。按照5%的接种量，取5ml种子液接种到盛有95 ml乳清蛋白氮源发酵培养基的250 ml摇瓶中，30℃，250 rpm培养48 h。离心收集发酵菌体蛋白，用无菌水清洗三遍后60℃烘干24 h。称取0.1g 干菌丝体至20 ml无菌水中，震荡摇匀后，利用超声仪超声使菌丝体完全混匀，形成均一溶液，利用总有机碳/总氮分析仪（N/C 2100S）测定总氮含量并计算菌丝体蛋白含量。

实验中设置不添加乳清蛋白的发酵培养基作为对比（即相对于乳清蛋白氮源发酵培养基而言，不添加乳清蛋白），实验重复三次，记录和计算结果。实验结果表明，通过添加乳清蛋白发酵生产的菌丝体蛋白含量，经检测可高达到61.64±0.79%。而未添加乳清蛋白肽的发酵培养基，发酵获得的菌丝蛋白含量为44.87±0.53%。因此，过添加乳清蛋白发酵生产的菌丝体蛋白含量提高比例达到37.37%。

将获得菌丝蛋白进行LC-MS分析，结果如表5。乳清蛋白作为有机氮源添加，提高菌丝体蛋白中必需氨基酸占比，提高范围从10%-77%，增加了菌丝体蛋白的营养价值。

表2 菌丝蛋白氨基酸分析

注：必须氨基酸：缬氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，色氨酸，苏氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸。

由上表可知，通过添加乳清蛋白的发酵培养基，可明显提高菌丝体蛋白中必需氨基酸占比，提高范围从10%-77%，增加了菌丝体蛋白的营养价值。本实施例中所用的种子培养基：2.6 g/L Na3C6H5O7·2H2O，2.52 g/L KNO3，2.88 g/L (NH4)H2PO4，1.6 g/L KH2PO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，添加葡萄糖为2%；所述的乳清蛋白氮源发酵培养基：10 g/L酵母粉，2.6 g/L Na3C6H5O7·2H2O，2.52 g/L KNO3，2.88 g/L (NH4)H2PO4，1.6 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，乳清蛋白1 g/L，添加葡萄糖为5%。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一株产蛋白的菌株及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> Fusarium venenatum TB01

<400> 1

agtaaaagtc gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt accgagttta 60

caactcccaa acccctgtga acatacctct atgttgcctc ggcggatcag cccgttcctc 120

acggaacggc ccgccgcagg acccctaaac tctgttttta gtggaacttc tgagtaaaaa 180

aacaaataaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc 240

agcaaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg 300

cacattccgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgttc gagcgtcatt tcaaccctca 360

agcccagctt ggtgttggga gctgttttag ttaacactcc ccaaattgat tggcggtcac 420

gtcgagcttc catagcgtag taatttacac atcgttactg gtaatcgacg cggccacgcc 480

gttaaacccc aacttctgaa tgttgacctc ggatcaggta ggaatacccg ctgaacttaa 540

gcatatcaat aagcggagga aaagaaacca acagggattg ccctagtaac ggcgagtgaa 600

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtaaaagtc gtaacaaggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcactcgcc gttactaggg 20

一株产蛋白的菌株及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。