专利摘要

专利摘要

本申请描述了用于产生用于对映选择性反应的氧化还原酶的组合物和方法。本申请描述了用于产生(R)-2-羟基酸脱氢酶的新变体的组合物和方法，该酶能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸，或其逆反应。示例性的例子包括(a)(R)-2-羟基己二酸脱氢酶及其用于将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的用途；以及(b)(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶及其用于将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的用途。本申请还描述了用于产生非天然微生物有机体以酶法将2-氧代己二酸转换成(E)-2-己烯二酸或己二酸，或以酶法将2-氧代戊二酸转换成(E)-2-戊烯二酸或戊二酸或各自逆反应的组合物和方法。

权利要求

1.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

2.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多肽是SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、22、26、30、34或35–153，或其简并或同源的变体中的任一个。

3.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33中所示的多核苷酸序列具有至少90％同一性；

其条件是所编码的多肽具有位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

4.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是显示于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33中带有不超过120个核苷酸取代的序列；

其条件是所编码的多肽具有与位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

5.一种载体，其包含权利要求1-4任一项所述的多核苷酸。

6.一种培养的细胞，其包含权利要求5的任意所述载体。

7.一种包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的多肽，该酶用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多肽与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列具有至少90％同一性；

其条件是所述多肽具有位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用，但不破坏氧化还原酶活性。

8.一种包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的多肽，该酶用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多肽是显示于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中带有不超过40个氨基酸取代的序列；

其条件是所述多肽具有与位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用，但不破坏氧化还原酶活性。

9.一种用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的组合物，其包含：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于60℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶；

(c)包括功能性氧化还原酶的包含氨基酸序列的多肽；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的一个或多个突变；以及

其中所述多肽在NADH的存在下催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34,35–153，或其简并或同源的变体中的任一个。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11、13、17，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多肽是SEQ ID NO：12、14、18，或其简并、同源的变体。

14.根据权利要求9所述的组合物，其中有机体是大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、白地霉、白色念珠菌、深红酵母或红东孢藻。

15.一种用于包括(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的以酶法将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的方法，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、35–153或其简并、同源的变体中的任一个；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述(R)-2-羟基己二酸脱氢酶具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的一个或多个突变；以及

其中所述(R)-2-羟基己二酸脱氢酶在NADH的存在下催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸，或其逆反应。

16.一种用于包括(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的以酶法将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的方法，其包括：

(a)选择多肽2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153；

(b)将活性位点中一个或多个精氨酸残基突变成选自以下组的氨基酸：His、Lys、Gln、Asn、Leu、Ile、Val、Tyr、Phe、Trp、Cys、Ser、Thr、Met、Glu、Asp、Ala、Gly和Pro；其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的R114、R115、R124、或R143同功的位置的活性位点的一个或多个突变；以及

(c)分析氧化还原酶的酶活；

其中所述多肽在NADH的存在下催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸，或其逆反应。

17.(R)-2-羟基己二酸脱氢酶将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的用途，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、35–153或其简并、同源的变体中的任一个；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述(R)-2-羟基己二酸脱氢酶具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的一个或多个突变；以及

其中所述(R)-2-羟基己二酸脱氢酶在NADH的存在下催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸，或其逆反应。

18.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，该酶用于将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：11或13中所示。

19.一种包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的多肽，该酶用于将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多肽序列如SEQ ID NO：12或14中所示。

20.一种用于包括(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的以酶法将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的方法，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11或13；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：12或14；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其中所述(R)-2-羟基己二酸脱氢酶在NADH的存在下催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸，或其逆反应。

21.(R)-2-羟基己二酸脱氢酶将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的用途，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11或13；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：12或14；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其中所述(R)-2-羟基己二酸脱氢酶在NADH的存在下催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸，或其逆反应。

22.一种当供应2-氧代己二酸和NADH，或者己二酸和NAD⁺以及其它合适的辅因子或原料时，以酶法将2-氧代己二酸转换成己二酸或其逆反应的方法，包括非天然有机体，其包括以外源性核酸转化的微生物有机体，所述外源性核酸编码：

(a)(R)-2-羟基己二酸脱氢酶(生产(R)-2-羟基己二酸)；

(b)己二酸Co-A转移酶(生产(R)-羟基己二酰-CoA)；

(c)羟基己二酰-CoA脱水酶(生产(E)-2-己烯二酰-CoA)；

(d)己二酸Co-A转移酶(生产(E)-2-己烯二酸)；

(e)2-己烯二酸脱氢酶(生产己二酸)；

其中(a)-(e)包括催化将2-氧代己二酸转换成己二酸或其逆反应的酶。

23.一种当供应2-氧代己二酸和NADH，或者(E)-2-己烯二酸和NAD⁺以及其它合适的辅因子或原料时，以酶法将2-氧代己二酸转换成(E)-2-己烯二酸或其逆反应的方法，包括非天然有机体，其包括以外源性核酸转化的微生物有机体，所述外源性核酸编码：

(a)(R)-2-羟基己二酸脱氢酶(生产(R)-2-羟基己二酸)；

(b)己二酸Co-A转移酶(生产(R)-2-羟基己二酰-CoA)；

(c)羟基己二酰-CoA脱水酶(生产(E)-2-己烯二酰-CoA)；

(d)己二酸Co-A转移酶(生产(E)-2-己烯二酸)；

其中(a)-(d)包括催化将2-氧代己二酸转换成(E)-2-己烯二酸或其逆反应的酶。

24.一种当供应2-氧代戊二酸和NADH，或者戊烯二酸和NAD⁺以及其它合适的辅因子或原料时，以酶法将2-氧代戊二酸转换成戊二酸或其逆反应的方法，包括非天然有机体，其包括以外源性核酸转化的微生物有机体，所述外源性核酸编码：

(a)(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶(生产(R)-2-羟基戊二酸)；

(b)戊烯二酸Co-A转移酶(生产(R)-2-羟基戊二酰-CoA)；

(c)羟基己二酰-CoA脱水酶(生产(E)-戊烯二酰-CoA)；

(d)戊烯二酸Co-A转移酶(生产(E)-戊烯二酸，即(E)-戊烯二酸；

(e)戊烯二酸脱氢酶(生产戊二酸，即戊二酸)；

其中(a)-(e)包括催化将2-氧代戊二酸转换成戊二酸或其逆反应的酶。

25.一种当供应2-氧代己二酸和NADH，或者己二酸和NAD⁺以及其它合适的辅因子或原料时，以酶法将2-氧代己二酸转换成己二酸或其逆反应的方法，包括非天然有机体，其包括微生物有机体，所述微生物有机体包括：

(a)编码包括SEQ ID NO：155(HIDH)的(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶(生产(R)-2-羟基己二酸)的SEQ ID NO：154(Lys12)；

(b)编码包括SEQ ID NO：158(gctA)和161(gctB)的己二酸Co-A转移酶(生产(R)-羟基己二酰-CoA)的SEQ ID NO：156或157(gctA)和SEQ ID NO：159或160(gctB)；

(c)编码包括SEQ ID NO：164(hgdA)、167(hgdB)和170(hgdc)的羟基己二酰-CoA脱水酶的SEQ ID NO：162或163(hgdA)和SEQ ID NO：162或163(hgdB)和SEQ ID NO：168或169(hgdc)(生产(E)-2-己烯二酰-CoA)；

(d)编码包括SEQ ID NO：158(gctA)和161(gctB)的己二酸Co-A转移酶(生产(E)-2-己烯二酸)的SEQ ID NO：156或157(gctA)和SEQ ID NO：159或160(gctB)；

(e)编码包括SEQ ID NO：173(gdh)的2-己烯二酸脱氢酶(生产己二酸)的SEQ ID NO：171或172(gdh)；

其中(a)-(e)包括催化将2-氧代己二酸转换成己二酸或其逆反应的酶。

26.一种当供应2-氧代己二酸和NADH，或者(E)-2-己烯二酸和NAD⁺以及其它合适的辅因子或原料时以酶法将2-氧代己二酸转换成(E)-2-己烯二酸或其逆反应的方法，包括非天然有机体，其包括以外源性核酸转化的微生物有机体，所述外源性核酸编码：

(a)编码包括SEQ ID NO：155(HIDH)的(R)-2-羟基己二酸脱氢酶(生产(R)-2-羟基己二酸)的SEQ ID NO：154(Lys12)；

(b)编码包括SEQ ID NO：158(gctA)和161(gctB)的己二酸Co-A转移酶(生产(R)-羟基己二酰-CoA)的SEQ ID NO：156或157(gctA)和SEQ ID NO：159或160(gctB)；

(c)编码包括SEQ ID NO：164(hgdA)、167(hgdB)和170(hgdc)的羟基己二酰-CoA脱水酶(生产(E)-2-己烯二酰-CoA)的SEQ ID NO：162或163(hgdA)和SEQ ID NO：162或163(hgdB)和SEQ ID NO：168或169(hgdc)；

(d)编码包括SEQ ID NO：158(gctA)和161(gctB)的己二酸Co-A转移酶(生产(E)-2-己烯二酸)的SEQ ID NO：156或157(gctA)和SEQ ID NO：159或160(gctB)；

其中(a)-(d)包括催化将2-氧代己二酸转换成(E)-2-己烯二酸或其逆反应的酶。

27.一种当供应2-氧代己二酸和NADH，或者己二酸和NAD⁺以及其它合适的辅因子或原料时，以酶法将2-氧代己二酸转换成己二酸或其逆反应的方法，包括非天然有机体，其包括：

(a)编码包括SEQ ID NO：155(HIDH)的(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶(生产(R)-2-羟基己二酸)的SEQ ID NO：154(Lys12)；

(b)编码包括SEQ ID NO：158(gctA)和161(gctB)的己二酸Co-A转移酶(生产(R)-羟基己二酰-CoA)的SEQ ID NO：156或157(gctA)和SEQ ID NO：159或160(gctB)；

(c)编码包括SEQ ID NO：164(hgdA)、167(hgdB)和170(hgdc)的羟基己二酰-CoA脱水酶(生产(E)-2-己烯二酰-CoA)的SEQ ID NO：162或163(hgdA)和SEQ ID NO：162或163(hgdB)和SEQ ID NO：168或169(hgdc)；

(d)编码包括SEQ ID NO：173(gdh)的2-己烯二酸脱氢酶(生产己二酰-CoA)的SEQ ID NO：171或172(gdh)；

(e)编码包括SEQ ID NO：158(gctA)和161(gctB)的己二酸Co-A转移酶(生产己二酸)的SEQ ID NO：156或157(gctA)和SEQ ID NO：159或160(gctB)；

其中(a)-(e)包括催化将2-氧代己二酸转换成己二酸或其逆反应的酶。

28.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：3,5,7,9,11,13,17,21,25,29或33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

29.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多肽是SEQ ID NO：4,6,8,10,12,14,16,18,22,26,30,34或35–153，或其简并或同源的变体中的任一个。

30.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33中所示的多核苷酸序列具有至少90％同一性；

其条件是所编码的多肽具有位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

31.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是显示于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33中带有不超过120个核苷酸取代的序列；

其条件是所编码的多肽具有与位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

32.一种载体，其包含权利要求28-31任一项所述的多核苷酸。

33.一种培养的细胞，其包含权利要求32的任意所述载体。

34.一种包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的多肽，该酶用于催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列具有至少90％同一性；

其条件是所述多肽具有位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

35.一种包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的多肽，该酶用于催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多肽是显示于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中带有不超过40个氨基酸取代的序列；

其条件是所述多肽具有与位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

36.一种用于催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的组合物，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于60℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶；

(c)包括功能性氧化还原酶的包含氨基酸序列的多肽；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的一个或多个突变；并且

其中所述多肽在NADH的存在下催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

38.根据权利要求36所述的组合物，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、35–153，或其简并或同源的变体中的任一个。

39.根据权利要求36所述的组合物，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11、13、17，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

40.根据权利要求36所述的组合物，其中所述多肽是SEQ ID NO：12、14、18，或其简并或同源的变体中的任一个。

41.根据权利要求36所述的组合物，其中所述有机体是大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、白地霉、白色念珠菌、深红酵母或红东孢藻。

42.一种用于包括(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的以酶法将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的方法，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA和65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、35–153或其简并或同源的变体中的任一个；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；并且

其中所述(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶在NADH的存在下催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸，或其逆反应。

43.一种用于包括(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的以酶法将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的方法，包括：

(a)选择多肽2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、或35–153；

(b)将活性位点中一个或多个精氨酸残基突变成选自以下组的氨基酸：His、Lys、Gln、Asn、Leu、Ile、Val、Tyr、Phe、Trp、Cys、Ser、Thr、Met、Glu、Asp、Ala、Gly和Pro；其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的R114、R115、R124、或R143同功的位置的活性位点的一个或多个突变；以及

(c)分析氧化还原酶的酶活；

其中所述多肽在NADH的存在下催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸，或其逆反应。

44.(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的用途，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA和65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、35–153或其简并或同源的变体中的任一个；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的一个或多个突变；并且

其中所述(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶在NADH的存在下催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸，或其逆反应。

45.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，该酶用于将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：11或13中所示。

46.一种包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的多肽，该酶用于将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多肽如SEQ ID NO：12或14中所示。

47.一种用于包括(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的以酶法将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的方法，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11或13；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA和65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：12或14；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其中所述(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶在NADH的存在下催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸，或其逆反应。

48.(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶的将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的用途，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11或13；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA和65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶；

(c)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶，其中所述多肽是SEQ ID NO：12或14；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其中所述(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶在NADH的存在下催化将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸，或其逆反应。

49.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性氧化还原酶(即，(R)-2-羟基酸脱氢酶)，该酶能够以酶法将1-羧基-2-酮酸(即，1-羧基-2-氧代酸，α-酮羧酸，α-氧代酸)转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸(即，1-羧基-羧基-D-2-羟基羧酸，(R)-α-羟基羧酸)，或其逆反应，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

50.一种包括功能性氧化还原酶的多肽，该酶能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34，或其简并或同源的变体中的任一个。

51.一种包括功能性氧化还原酶的多肽，该酶能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸，其中所述多肽是SEQ ID NO：35–153或其简并或同源的变体中的任一个。

52.一种包括编码多肽的包含核苷酸序列的多核苷酸的载体，所述多肽包括能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸的功能性氧化还原酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

53.一种载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸的功能性氧化还原酶，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35-153，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

54.一种培养的细胞，其包含权利要求52或53所述的载体。

55.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸的功能性氧化还原酶，其中所述核苷酸序列是与SEQ ID NO：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31或33中所示的多核苷酸序列具有至少90％同一性；

其条件是所编码的多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

56.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸的功能性氧化还原酶，其中所述核苷酸序列是与SEQ ID NO：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31或33中所示的序列之一，具有不多于120个核苷酸取代；

其条件是所编码的多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

57.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸的功能性氧化还原酶，其中所编码的多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列具有至少90％同一性；

其条件是所编码的多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

58.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸的功能性氧化还原酶，其中所述多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列之一具有不多于40个氨基酸取代；

其条件是所编码的多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

59.一种载体，其包含权利要求55-58任一项所述的多核苷酸。

60.一种培养的细胞，其包含权利要求59的任意所述载体。

61.一种包括能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸的功能性氧化还原酶的多肽，其中所述多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列具有至少90％同一性；

其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

62.一种包括能够以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸的功能性氧化还原酶的多肽，其中所述多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列之一具有不多于40个氨基酸取代；

其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

63.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，其用于催化将1-羧基-2-酮酸对映选择性转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

64.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，其用于催化将1-羧基-2-酮酸对映选择性转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应，其中所述多肽是SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、22、26、30、34或35–153，或其简并、同源的变体中的任一个。

65.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，其用于催化将1-羧基-2-酮酸对映选择性转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33中所示的多核苷酸序列具有至少90％同一性；

其条件是所编码的多肽具有位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

66.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，其用于催化将1-羧基-2-酮酸对映选择性转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33中所示带有不超过120个核苷酸取代的序列；

其条件是所编码的多肽具有与位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

67.一种载体，其包含权利要求63-66任一项所述的多核苷酸。

68.一种培养的细胞，其包含权利要求67的任意所述载体。

69.一种包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶的多肽，该酶用于催化将1-羧基-2-酮酸对映选择性转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应，其中所述多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列具有至少90％同一性；

其条件是所述多肽具有位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

70.一种包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶的多肽，该酶用于催化将1-羧基-2-酮酸对映选择性转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列具有不多于40个氨基酸取代；

其条件是所述多肽具有位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

71.一种用于催化将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应的组合物，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于60℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶；

(c)包括功能性氧化还原酶的包含氨基酸序列的多肽，；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的一个或多个突变；并且

其中所述多肽在NADH的存在下催化将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸。

72.根据权利要求71所述的组合物，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

73.根据权利要求71所述的组合物，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34,35–153，或其简并或同源的变体中的任一个。

74.根据权利要求71所述的组合物，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11、13、17，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

75.根据权利要求71所述的组合物，其中所述多肽是SEQ ID NO：12、14、18，或其简并或同源的变体中的任一个。

76.根据权利要求71所述的组合物，其中所述有机体是大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、白地霉、白色念珠菌、深红酵母或红东孢藻。

77.一种用于包括(R)-2-羟基酸脱氢酶的以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应的方法，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基羧酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,35–153或其简并或同源的变体中的任一个；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述(R)-2-羟基酸脱氢酶具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的一个或多个突变；并且

其中所述(R)-2-羟基酸脱氢酶在NADH的存在下催化将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸，或其逆反应。

78.一种用于包括(R)-2-羟基酸脱氢酶的以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应的方法，包括：

(a)选择多肽2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153；

(b)将活性位点中一个或多个精氨酸残基突变成选自以下组的氨基酸：His、Lys、Gln、Asn、Leu、Ile、Val、Tyr、Phe、Trp、Cys、Ser、Thr、Met、Glu、Asp、Ala、Gly和Pro；其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的R114、R115、R124、或R143同功的位置的活性位点的一个或多个突变；以及

(c)分析氧化还原酶的酶活；

其中所述多肽在NADH的存在下催化将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸，或其逆反应。

79.(R)-2-羟基酸脱氢酶将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应的用途，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个；

(b)包括能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交的核苷酸序列的多核苷酸，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA和65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，其编码包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶的多肽；

(c)包括功能性(R)-2-羟基羧酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、35–153或其简并或同源的变体中的任一个；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其条件是所述(R)-2-羟基酸脱氢酶具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的一个或多个突变；并且

其中所述(R)-2-羟基酸脱氢酶在NADH的存在下催化将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸，或其逆反应。

80.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，该酶用于将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：11或13中所示。

81.一种包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶的多肽，该酶用于将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应，其中所述多肽如SEQ ID NO：12或14中所示。

82.一种用于包括(R)-2-羟基酸脱氢酶的以酶法将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应的方法，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11或13；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基羧酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：12或14；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其中所述(R)-2-羟基酸脱氢酶在NADH的存在下催化将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸，或其逆反应。

83.(R)-2-羟基酸脱氢酶的将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸或其逆反应的用途，包括：

(a)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：11或13；

(b)多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够与(a)的互补物在杂交条件下杂交，所述杂交条件包括于60℃7％十二烷基硫酸钠、0.5M Na₂HPO₄、1mM EDTA，于65℃1×SSC、0.1％SDS中洗涤，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基酸脱氢酶；

(c)包括功能性(R)-2-羟基羧酸脱氢酶的包含氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：12或14；

(d)包含(a)或(b)或能够表达(c)的载体；或

(e)用(d)转化的有机体；以及

其中所述(R)-2-羟基酸脱氢酶在NADH的存在下催化将1-羧基-2-酮酸转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸，或其逆反应。

84.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性氧化还原酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

85.一种包括功能性氧化还原酶的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34，或其简并或同源的变体中的任一个。

86.一种包括功能性氧化还原酶的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：35–153或其简并或同源的变体中的任一个。

87.一种载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性氧化还原酶，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

88.一种载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性氧化还原酶，其中所编码的多肽是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153或其简并或同源的变体中的任一个。

89.一种培养的细胞，其包含权利要求87或88所述的载体。

90.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性氧化还原酶，其中所述核苷酸序列是与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33中所示的多核苷酸序列具有至少90％同一性；

其条件是所编码的多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

91.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性氧化还原酶，其中所述核苷酸序列是与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33中所示的序列之一具有不多于120个核苷酸取代；

其条件是所编码的多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

92.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性氧化还原酶，其中所编码的多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列具有至少90％同一性；

其条件是所编码的多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

93.一种多核苷酸，其包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性氧化还原酶，其中所编码的多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列之一具有不多于40个氨基酸取代；

其条件是多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

94.一种载体，其包含权利要求90-93任一项所述的多核苷酸。

95.一种培养的细胞，其包含权利要求94的任意所述载体。

96.一种包括功能性氧化还原酶的多肽，其中所述多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列具有至少90％同一性；

其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

97.一种包括功能性氧化还原酶的多肽，其中所编码的多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的多肽序列之一具有不多于40个氨基酸取代；

其条件是所述多肽具有与位于酿酒酵母高异柠檬酸脱氢酶(ScHIDH)即SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功的位置的活性位点的至少一个或多个突变；

其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

说明书

相关申请

本申请是非临时申请，其要求递交于2012年2月29日的美国临时专利申请号61/604,630的优先权的权益，其在此以全文引用的方式并入本发明。本申请与递交于2013年2月27日的美国专利申请号13/___,___有关。

技术领域

本发明记载的是用于产生用于对映选择性反应的氧化还原酶的组合物和方法。本发明记载的是用于产生新变体(R)-2-羟基酸脱氢酶的组合物和方法，该酶能够以酶法将1-羧基-2-酮酸(即，1-羧基-2-含氧酸，α-酮羧酸，α-含氧酸)转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸(即，1-羧基-D-2-羟基酸，(R)-α-羟基羧酸)，或其逆反应。示例性的例子包括(a)(R)-2-羟基己二酸脱氢酶及其用于将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的用途；以及(b)(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶及其用于将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的用途。本发明还记载的是用于产生非天然微生物有机体以酶法将2-氧代己二酸转换成(E)-2-己烯二酸或己二酸，或酶法将2-氧代戊二酸转换成(E)-2-戊烯二酸或戊二酸或各自逆反应的组合物和方法。

背景技术

己二酸，即，1,4-正丁烷二羧酸；COOH(CH₂)₄COOH，是世界范围内最常生产的化学物质之一，每年大约合成25亿千克以及80亿美元的全球市场。己二酸最常见的用途是用于室内装饰、汽车配件、服装和其它产品的尼龙6,6的合成。己二酸合成的标准工业方法是昂贵的，其主要缺点包括消耗化石燃料、效率低下的产出以及温室气体的产生。为了解决该需要，已经证实了生产己二酸的“更加绿色”的方法，但是这些方法还没有被广泛应用，部分原因是因为它们依赖于大规模的过氧化氢氧化，或是因为它们涉及非生物合成反应的非环保的发酵反应。Sato et al.Science 281:1646-1647(1998)；Niu et al,Biotechnol.Prog.18:201-211(2002)。

已经讨论了在细菌中通过一系列重组酶合成己二酸的生物学方法。Burgard et al，美国专利号7,799,545；Burgard et al.，美国专利申请公开号US 2009/0305364；US 2010/0330626和US 2011/0195466。该生物合成途径具有降低输入材料的量和花费、减少化石燃料底物的需要以及降低污染物释放的潜能。在该方法中，来自共生梭菌(Clostridia symbiosum)的编码谷氨酸发酵酶的基因表达于合适的细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))以将2-氧代己二酸通过(R)-2-羟基己二酸、(R)-2-羟基己二酰-CoA、2-己烯二酰-CoA和2-己烯二酸转换成己二酸(图1A)。Parthasarathy et al.,Biochemistry 50:3540-3550(2011)。所述化合物，2-氧代己二酸(即，2-氧代己二酸)，在几种有机体中(即，在赖氨酸分解代谢中)是天然代谢中间物并且实验显示己二酸可以在细菌中添加葡萄糖合成而得。Goh et al.,Mol.Genet.Metab.76:172-180(2002)。在其它例子中，谷氨酸通过(R)-2-羟基戊二酸、(R)-2-羟基戊二酰基-CoA、(E)-戊烯二酰-CoA、(E)-戊烯二酸((E)-glutaconate)(即，戊烯二酸((E)-pentenedioic acid))和戊二酸(glutarate)(即，戊二酸(pentanedioic acid))转换成戊二酸。

尽管其它生物合成方法已经在技术上成为可能，仍然没有建立用于有效将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸的酶。发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)2-羟基戊二酸脱氢酶(HghH)被认为是用于将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸((R)-2-hydroxyadipate)(即，(R)-2-羟基己二酸((R)-2-hydroxyhexanedioate))的酶。Parthasarathy et al.,Biochemistry 50:3540-3550(2011)。但是，HghH和2-羟基己二酸脱氢酶的缺点通常在于它们的天然底物是2-氧代己二酸的5碳类似物，2-氧代戊二酸。结果，由HghH转换2-氧代己二酸的效率比2-氧代戊二酸低20倍。因此，特异性将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸的酶，称为(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，需要克服效率低下的2-氧代己二酸催化和不期望的HghH对2-酮戊二酸的催化。虽然在自然界中观察到2-羟基己二酸脱氢酶活性，但编码该酶的基因还没有被鉴定出来。此外，该酶对该方法来说不是理想的，因为其底物特异性是混杂的并且2碳产物的立体化学是未知的。Suda,et al.,Arch.Biochem.Biophys.176(2):610-620(1976)；Suda et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.77(2):586-591(1977)；Suda et al.Pediatric Res.12(4):297-300(1978)。

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenases，IDH)是将异柠檬酸转换成2-氧代戊二酸(α-酮戊二酸)的β-羟基酸氧化脱羧酶(图1B)并且在整个生命中无处不在。Northrop和Cleland,J.Biol.Chem.249:2928-2931(1974)；Uhr et al.,J.Biol.Chem.249:2920-2927(1974)。

高异柠檬酸脱氢酶(Homoisocitrate dehydrogenases，HIDH)是来自IDH同一亚家族的β-羟基酸氧化脱羧酶，其将高异柠檬酸，异柠檬酸的7碳类似物，转换成2-氧代己二酸(2-氧代己二酸(2-oxohexanedioic acid))(图1C)。HIDH参与酵母、嗜热细菌和古细菌中一种替代的赖氨酸合成途径。Miyazaki et al.J.Biol.Chem.278:1864-1871(2003)；Xu et al.,Cell Biochem.Biophys.46:43-64(2006)。最近外显子测序显示NADP⁺-依赖的IDH中的错义突变，其突变了催化过程中负责接触异柠檬酸的β-羧基的精氨酸残基。Yan et al.,N.Engl.J.Med.360:765-773(2009)；Mardis et al.,N.Engl.J.Med.361:1058-1066(2009)。这些突变使得IDH酶失去它们天然的异柠檬酸脱氢酶活性并且获得将2-氧代戊二酸(α-酮戊二酸)转换成2-氧代戊二酸(2-羟基戊二酸)的新变体活性(图1D)。Dang et al.,Nature 462:739-744(2009)；Ward et al.,Cancer Cell 17,225-234(2010)。

由于与癌症和先天性代谢缺陷相关，所述化合物2-氧代己二酸是目前感兴趣的小生化物质。令人感兴趣的是检测和定量该化合物，特别是在对映体选择性的方式(即，从(S)-2-羟基戊二酸区分(R)-对映体)。这对于癌症和先天性代谢缺陷的研究或诊断将会是有用的。目前用质谱定量该化合物，但是这种仪器专业且昂贵。因此，更易用的定量方法将会是有用的。

连接(R)-2-羟基戊二酸至NAD⁺/NADH的酶可以允许开发NADH联的分析以定量(R)-2-羟基戊二酸。该分析的原理是将含有未知量的(R)-2-羟基戊二酸的样品加入含有(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶和NAD⁺的反应混合物。然后，(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶将等量的(R)-2-羟基戊二酸和NAD⁺按化学计量转换成NADH和2-氧代戊二酸。然后，NADH的量，其正好等于样品中输入(R)-2-羟基戊二酸的量，可以通过紫外光吸收(例如，340nm)或荧光(例如，340nm激发；450nm发射)来测量，或通过转换例如刃天青的第二探针来检测。这种“酶联比色法”方案已经可用于大量常见化学物质，例如葡萄糖、谷氨酸等。这对于降低目前需要质谱的(R)-2-羟基戊二酸定量的花费将是有用的。其可用于实验室研究，或甚至通过检测肿瘤、组织样品、血液等中的(R)-2-羟基戊二酸给临床提供诊断测试。

已经研究了来自酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)和嗜热细菌极端嗜热菌(T.thermophilus)的HIDH。Miyazaki et al.J.Biol.Chem.278:1864-1871(2003)；Lin et al.,Biochemistry 46:890-898(2007)；Lin et al.,Biochemistry 47:4169-4180(2008)；Lin et al.,Biochemistry 48:7305-7312(2009)；Aktas和Cook,Biochemistry 48:3565-3577(2009)。

由于IDH和HIDH是同源的且功能上相关，类似的对HIDH的突变可以导致它们失去其天然HIDH活性并获得将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸的能力(图1E)。其它β-羟基酸氧化脱羧酶的活性位点残基的突变可以把这些酶转换成2-羟基酸脱氢酶。也就是说，不是催化底物上3-羧基的去除和2-醇基的氧化而产生2-酮产物，而是突变体催化相同2-酮产物至相应2-醇的还原。该酶还催化逆反应(即，2-醇至2-酮的氧化)。

已经进行了人IDH1或IDH2和高异柠檬酸脱氢酶的比对，显示这些酶间明显的同源性。参见Aktas和Cook,Biochemistry 48:3565-3577(2009)。但是，这些蛋白的正确比对不是微不足道的。例如，Aktas和Cook不正确比对了人IDH1。参见Aktas和Cook，第3569页图3。比对中的第四条，Human_ICDH_NADP(即，HsIDH1)，没有正确比对；该序列应当右移8个残基。当Aktas和Cook的图3中Human_ICDH_NADP和S.cerevisiae_HICDH进行比较时可以发现该错误。

在正确的比对中，功能上关键的残基互相对齐(参见图2B和3)。残基HsIDH1-R132与ScHIDH-R143对齐。对底物结合重要的HsIDH1-R100、-R109和-R132以及对催化必需的-Y139分别与ScHIDH-R114、-R124和-R143以及Y150对齐。相反，Aktas和Cook的比对将HsIDH1-R132与ScHIDH序列中E132和K133之间的缺口对齐。该比对也是不正确的，因为HsIDH1-G148与ScHIDH-R143对齐。关键的精氨酸残基是不可能被甘氨酸替换的。此外，在HsIDH1-R100和ScHIDH-R114之前有一个保守支链氨基酸(例如，Ile或Leu)，并且在关键的催化精氨酸和酪氨酸残基(即，HsIDH1-R132/ScHIDH-R143和HsIDH1-R139/ScHIDH-Y150)之间有六个中间氨基酸。另外，本发明所述的实验证据强烈支持图2B和3中的比对。位置上对齐的残基如HsIDH1-R132H和ScHIDH-R143H的突变具有类似的功能改变。除其他事项外，这些例子证实IDH和HIDH序列中的类似残基的正确比对是无法预期的并且需要实验验证。

本发明所述的是负责创造催化2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸的(R)-2-羟基己二酸脱氢酶(即，氧化还原酶)的HIDH活性位点的残基的突变。用于创造该突变体的方法也已经对来自多个种属的各种HIDH酶进行过。采用本发明所述的方法产生了独特的核苷酸和蛋白序列。用于产生这些酶构建体的方法通过生化分析确认显示在HIDH突变体中的催化活性(在这种情况下，2-羟基己二酸脱氢酶活性)。所述HIDH突变体引入载体中以产生非天然微生物有机体(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母)。转化的酵母可用于将来自有机体代谢的2-氧代己二酸转换成商业上有用的(E)-2-己烯二酸和/或己二酸产物。

异丙基苹果酸脱氢酶(Isopropylmalate dehydrogenases，IPMDH)和酒石酸脱氢酶(tartarate dehydrogenases，TDH)也是β-羟基酸氧化脱羧酶，可以采用本发明所述的方法被突变以改变活性。突变体IPMDH将4-甲基-2-酮戊酸还原成4-甲基-2-羟基戊酸。突变体TDH将3-羟基-2-氧代丙酸(β-羟基丙酮酸)还原成2,3-二羟基丙酸。

发明概述

本发明记载的是用于产生用于对映选择性反应的氧化还原酶的组合物和方法。本发明记载的是用于产生新变体(R)-2-羟基酸脱氢酶的组合物和方法，该酶能够以酶法将1-羧基-2-酮酸(即，1-羧基-2-含氧酸，α-酮羧酸，α-含氧酸)转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸(即，1-羧基-D-2-羟基酸，(R)-α-羟基羧酸)，或其逆反应。示例性的例子包括(a)(R)-2-羟基己二酸脱氢酶及其用于将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应的用途；以及(b)(R)-2-羟基戊二酸脱氢酶及其用于将2-氧代戊二酸转换成(R)-2-羟基戊二酸或其逆反应的用途。本发明还记载的是用于产生非天然微生物以酶法将2-氧代己二酸转换成(E)-2-己烯二酸或己二酸，或酶法将2-氧代戊二酸转换成(E)-2-戊烯二酸或戊二酸或各自逆反应的组合物和方法。

本发明所述的一个实施方案是一个能够以酶法将1-羧基-2-酮酸(即，1-羧基-2-含氧酸，α-酮羧酸，α-含氧酸)转换成1-羧基-(R)-2-羟基酸(即，1-羧基-D-2-羟基酸，(R)-α-羟基羧酸)，或其逆反应的功能性氧化还原酶(即，(R)-2-羟基酸脱氢酶)。

本发明所述的另一个实施方案是功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶。

本发明所述的一个方面是编码多肽的包括核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其用于催化将2-酮己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33，或其简并、同源或密码子优化的变体中的任一个。

本发明所述的另一个方面是编码多肽的包括核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多肽是SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、22、26、30、34或35–153，或其简并或同源的变体中的任一个。

本发明所述的另一个方面是编码多肽的包括核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33中所示的多核苷酸序列具有至少90％同一性；其条件是所编码的多肽具有位于SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150位置的活性位点的至少一个或多个突变；其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

本发明所述的另一个方面是编码多肽的包括核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶，其用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多核苷酸是显示于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、17、21、25、29或33中带有不超过120个核苷酸取代的序列；其条件是所编码的多肽具有位于与SEQ ID NO：2的V111、R114、R115、R124、R143或Y150同功(analogous)的位置的活性位点的至少一个或多个突变；其中所述一个或多个突变破坏氧化脱羧作用但不破坏氧化还原酶活性。

本发明所述的另一个方面是包括编码多肽的包括核苷酸序列的多核苷酸的载体，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶。

本发明所述的另一个方面是包括任何一个包括多核苷酸的载体的培养的细胞，所述多核苷酸包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶。

本发明所述的另一个方面是包括功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶的多肽，所述功能性(R)-2-羟基己二酸脱氢酶用于催化将2-氧代己二酸转换成(R)-2-羟基己二酸或其逆反应，其中所述多肽是与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或35–153中所示的

用于对映选择性反应的新的氧化还原酶专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。