专利摘要

本发明涉及“一种发酵中药渣有机肥菌剂的制备方法及其应用”，该方法以地衣芽孢杆菌为发酵菌，其制作过程如下：(1)菌种的活化：将低温保存的KCDS‑1菌株接种牛肉浸膏平板培养基上进行活化，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液，浓度为1.0～7.5×106；(2)种子液的制备：向牛肉浸膏液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，进行培养得种子液，浓度为1.0～7.5×106。(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液0.05～1％比例(体积百分比)接入玉米淀粉培养基中，再在26～32℃、摇床转速为150～200rpm的条件下培养30～40小时。采用本发明的菌剂能够将中药渣、畜生粪、秸秆、麦秆、厨余垃圾等发酵成有机肥，应用到中药材栽培以及农业生产过程中，能够提高中药材产量和质量。

权利要求

1.一种地衣芽孢杆菌KCDS-1(Bacillus licheniformis KCDS-1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.113800。

2.利用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌KCDS-1(Bacillus licheniformis KCDS-1)的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为地衣芽孢杆菌KCDS-1(Bacillus licheniformisKCDS-1)菌体和他的胞外代谢产物。

3.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种的活化：将低温保存的KCDS-1菌株接种牛肉浸膏平板培养基上，并在26～30℃下培养15-20小时，然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在26～30℃下培养15-20小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液，其浓度为1.0～7.5×106；

(2)种子液的制备：按照0.5～4％比例(体积百分比)向牛肉浸膏液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，并在26～32℃下震荡培养15～21小时，得种子液，其浓度为1.0～7.5×106。

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液0.05～1％比例(体积百分比)接入玉米淀粉培养基中，再在26～32℃、摇床转速为150～200rpm的条件下培养30～40小时。

其中玉米淀粉培养基中各成分的比例为：玉米淀粉0.2～0.4％、大豆蛋白粉1.0～2.0％、玉米浆2～4％、MnSO40.05～0.15％、K2HPO40.2～0.4％、KH2PO40.1～0.2％、MgSO40.02～0.10％、FeSO40.01～0.02％、CaCO30.01～0.02％、pH 6.0～7.0。

4.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌KCDS-1(Bacillus licheniformis KCDS-1)应用在发酵中药渣有机肥。

说明书

技术领域

本发明属于生物有机肥料生产技术领域，特别涉及一种有机肥发酵菌剂的制备及其应用。

背景技术

我国农业由于化肥的长期使用，已造成肥效下降，利用率不高，土壤板结、连作障碍严重等弊端，同时由于化肥的利用率只有35--40％，其余部分被土壤固定，或淋溶造成水体污染等环境问题。为了解决上述问题，专家们迫切呼吁减少化肥使用量，多使用新型生物肥，多施有机肥，广大农民也迫切需要一种新型肥料来满足农业生产的需要。欧洲一些国家生物肥料的施用量已占农业用肥总量的45％～60％，美国的施用量更高达60-70％。在我国，若生物肥能占到化肥使用量的10％，其市场容量将达到1400万吨。现在我国生物有机肥料的年产量不足20万吨，远远不能满足市场需求。同时，随着工农业的发展，工业废弃物、城市污泥、垃圾、畜禽粪便的产生量与日俱增。我国是中药资源消耗大国，由此产生了大量的中药药渣，2007年全国中药渣的年排放量达3000万吨，如江苏省中药渣的年排放量已达100万吨，仅南京六大中药制药厂年排放量达10万多吨；而2011年贵州百灵药业股份有限公司年产中药渣为3万吨；云南两家生产三七皂苷药厂每年就产生15万吨的药渣。目前这些中药渣主要当作生活垃圾进行填埋或者堆放，这不仅占用了大量的土地资源，污染了土地及地下水，而且还造成资源的浪费。中药大多是由植物的根、茎、叶、花、实、皮，以及禽兽的肢体、脏器、外壳组成，还有部分属于矿物质，它含有丰富的有机物和无机物质。提取有效成分后的药渣，一般含大量的粗纤维、粗脂肪、淀粉、粗多糖、粗蛋白、氨基酸、生物碱及微量元素等，因此，中药渣是一种优质的有机肥料。

有机肥发酵生产需要通过微生物将植物残体中的纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等大分子有机物快速分解，提高发酵堆体温度，促进有机物料的矿质化，形成作物可直接吸收利用的速效养分。目前堆肥接种的微生物大都属于中温性的微生物菌剂，微生物的数量和种类对有机肥发酵过程起着非常重要和关键性的作用，发酵菌剂的选择是生物有机肥生产的关键。目前应用的微生物种类有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、烟曲霉、酵母菌、木霉菌、热性纤维素分解细菌、光合放线菌、细菌、乳酸菌等多种微生物。

地衣芽孢杆菌是一种极具潜力的益生菌，可产生内生芽抱，耐热抗逆性强，在土壤和植物表面普遍存在。地衣芽孢杆菌能产生各种活性酶，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白质酶等，能够分解植物中的有机物，促进植物有机物料的矿质化；分泌活性物质，促进植物的生长；产生抗菌物质，用于防治植物和动物病害等。目前地衣芽孢杆菌被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。

发明内容

本发明目的在于：提供一种能将中药渣发酵成有机肥的地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis KCDS-1(该菌株已于2015年9月16日包藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.11380)；提供一种地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis KCDS-1生产的微生物菌剂及其制备方法；提供了一种将牲畜粪便、秸秆、厨余垃圾发酵成有机肥的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis KCDS-1。

地衣芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种的活化：将低温保存的KCDS-1菌株接种牛肉浸膏平板培养基上，并在26～30℃下培养15-20小时，然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在26～30℃下培养15-20小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液，其浓度为1.0～7.5×106；

(2)种子液的制备：按照0.5～4％比例(体积百分比)向牛肉浸膏液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，并在26～32℃下震荡培养15～21小时，得种子液，其浓度为1.0～7.5×106。

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液0.05～1％比例(体积百分比)接入玉米淀粉培养基中，再在26～32℃、摇床转速为150～200rpm的条件下培养30～40小时。

其中玉米淀粉培养基中各成分的比例为：玉米淀粉0.2～0.4％、大豆蛋白粉1.0～2.0％、玉米浆2～4％、MnSO4 0.05～0.15％、K2HPO4 0.2～0.4％、KH2PO4 0.1～0.2％、MgSO4 0.02～0.10％、FeSO4 0.01～0.02％、CaCO3 0.01～0.02％、pH 6.0～7.0。

本发明通过以下技术方案实现：

实例1

微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行：

1、菌株分离

(1)样品处理：将丹参大田土壤样品混合均匀并碾碎后过60目筛，收集筛下样品。

(2)在赫奇逊培养基平板上按一定间距放置灭菌后的滤纸条，用赫奇逊液体培养基将滤纸条润湿。

(3)在滤纸一端放过筛后的土壤样品，样品量约1～3g，样品在滤纸上直径不超过滤纸宽度。然后置于26～30℃培养箱中。

(4)2～4天后观察滤纸的变化，直到滤纸有颜色变化或明显被腐解时，将变色或腐烂滤纸取出。

(5)在无菌条件下将有颜色变化或被腐解的部分切下接于蛋白胨纤维素培养基平板上。

(6)等蛋白胨纤维素培养基平板上长出细菌时用划线法在羧甲基纤维素钠培养基平板上划线分离，将长出真菌的菌块同样接种于羧甲基纤维素钠培养基平板上。

(7)将纯化的单菌落细菌或单一真菌接种于羧甲基纤维素钠培养基斜面进行保存。

2、实验菌株的纤维分解能力试验

(1)将试验细菌接种于NA培养基上26～30℃培养，将试验真菌接于PDA上23～27℃培养。

(2)在赫奇逊培养基平板上按一定间距放置灭菌后的滤纸条，用赫奇逊液体培养基将滤纸条润湿。

(3)在滤纸一端接种培养好的细菌或真菌菌块，细菌置于26～30℃、真菌置于23～27℃培养箱中培养。

(4)2-4天后观察滤纸的变化，观察滤纸是否有颜色变化或明显被腐解。

3、菌株活化

挑取在4℃冰箱里的NA斜面培养基上保存的菌种，接种到的NA斜面培养基上，在26～30℃恒温培养箱中培养16～20h。

4、种子准备

分别在已经活化的菌株的试管中加入无菌水3-7mL，振荡制成菌悬液，接入各相应已经提前配置好的NA三角瓶液体培养基中。每菌株接种一个三角瓶，在26～30℃，150～200rpm摇床上振荡培养16～20h。

5、发酵培养条件的研究

(1)最佳培养时间的测定

按3-8％的接种量将种子培养液接入到液体培养基中(150mL/500mLNA液体培养基)，26～30℃，150～200rpm摇床振荡培养36h。分别在0h，12h，15h，18h，21h，24h，27h，30h，36h时从3个重复中取出适量菌液，用平板菌落计数法测定培养液中的总活菌数，结果表明当培养时间为15～20h时，菌株KCDS-1菌所产生的菌量最大；然后随着培养时间的继续延长，菌体量呈下降趋势。综上确定菌株KCDS-1菌可能的最佳培养时间为15～20h。

(2)菌株最佳培养温度的测定

按5％的接种量将种子培养液接入到液体培养培养基中(150mL/500mLNA液体培养基)，在150～200rpm摇床振荡培养15～20h。设置的温度梯度为26℃，28℃，30℃，32℃。在培养终点用平板菌落计数法测定培养液中的总活菌数。结果表明在发酵时间为15h，同时其他条件恒定的情况下，在所设定的温度范围内(28℃，30℃，32℃，34℃，36℃)菌株KCDS-1菌可能的最佳的发酵温度为31～33℃。

(3)初始pH对菌株液体培养的影响

将NA液体培养基的初始pH分别调节为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，按5％的接种量将的种子培养液接入到初始pH不同的各液体培养基中(150mL/500mLNA液体培养基)，在26～30℃，150～200rpm摇床振荡培养15-20h。测定培养终点pH，用平板菌落计数法测定菌液的总活菌数。结果表明初始pH为6.0～7.0，菌株KCDS-1菌都较多。

(4)摇瓶不同装液量对菌株液体培养的影响

在500mL三角瓶中分别装入50mL，100mL，150mL，200mLNA液体培养基，按5％的接种量将KCDS-1菌的种子培养液接入到液体培养基中，在26～30℃，150～200rpm摇床振荡培养15～20h。在液体培养终点用平板菌落计数法测定菌液的总活菌数。结果表明在150～200rpm的摇床转速下，150～200mL/500mL的装液量能够较好的满足菌体生长过程中对氧的需求，作为最佳的装液量标准。

(5)摇床转速对菌株液体培养的影响

按5％的接种量将KCDS-1菌的种子培养液接入到液体培养基中(200mL/500mLNA液体培养基)，在26～30℃摇床上振荡培养15-20h。设置的摇床转速为静置(0rpm)，100rpm，150rpm，200rpm，250rpm转速。在液体培养终点用平板菌落计数法测定培养液中的总活菌数。结果表明当摇床转速为100～150rpm时，菌株的产量最高，因此确定最佳摇床转速为100～150rpm。

(6)接种量对菌株液体培养的影响

将培养好的KCDS-1种子液按0.5％、1％、2％、4％、8％的接种量接种到NA培养基中，在26～30℃，100～150rpm摇床上振荡培养15h。在液体培养终点用平板菌落计数法测定培养液中的总活菌数。结果表明其中以4％接种量下所产生的菌量最多，高接种量或低接种量都不利于菌体的形成。

实例2

应用地衣芽孢杆菌将苦参渣发酵成有机肥，其步骤如下：

(1)将发酵液分别按吸附比例(发酵液∶吸附剂＝1∶1～1.5)进行吸附、干燥，得到固体物质，吸附剂为麦麸∶稻糠为1∶1～1.5。

(2)将步骤(1)得到的固体物质与尿素、鱼粉进行混合，混合比例为菌剂固体物∶尿素∶鱼粉为60～70∶7∶25。

(3)将300公斤～500公斤的药渣摊平(药渣的湿度为55％～60％)，撒上步骤(2)得到的菌剂，用工具将药渣和菌剂拌匀。拌好后将药渣堆成圆锥形，宽1～2米，高1～2米，不能低于0.8米，上面盖上塑料薄膜，发酵时间10～20天，当药渣原料为变成褐色或黑褐色，湿时用手握之柔软有弹性，干时很脆容易破碎，完成发酵。发酵后的药渣，经过干燥、粉碎处理，成为实用的中药渣有机肥。。

通过上述步骤获得的苦参渣有机肥营养成分为：全氮为33.0(g/kg)、全磷为10.46(g/kg)、全钾为10.46(g/kg)、全铜为15.03(mg/kg)、全锌为65.87(mg/kg)、全铁为2237.5(mg/kg)、全锰为166.57(mg/kg)、全钙为5.38(g/kg)全镁为2.69(g/kg)、有机质为88.6(％)。

实例3

应用地衣芽孢杆菌将生脉饮渣发酵成有机肥，其步骤如下：

(1)将发酵液分别按吸附比例(发酵液∶吸附剂＝1∶1)进行吸附、干燥，得到固体物质，吸附剂为麦麸∶稻糠为1∶1。

(2)将步骤(1)得到的固体物质与尿素、鱼粉进行混合，混合比例为菌剂固体物∶尿素∶鱼粉为60～70∶7∶25。

(3)将300公斤～500公斤的药渣摊平(药渣的湿度为55％～60％)，撒上步骤(2)得到的菌剂，弄工具将药渣和菌剂拌匀。拌好后将药渣堆成圆锥形，宽1-～2米，高1～2米，不能低于0.8米，上面盖上塑料薄膜，发酵时间10～20天，当药渣原料为变成褐色或黑褐色，湿时用手握之柔软有弹性，干时很脆容易破碎，完成发酵。发酵后的药渣，经过干燥、粉碎处理，成为实用的中药渣有机肥。

通过上述步骤获得的生脉饮渣有机肥营养成分为：全氮为32.6(g/kg)、全磷为2.81(g/kg)、全钾为11.45(g/kg)、全铜为17.78(mg/kg)、全锌为74.77(mg/kg)、全铁为1438.2(mg/kg)、全锰为182.64(mg/kg)、全钙为6.32(g/kg)、全镁为2.67(g/kg)、有机质为77.0(％)。

实例4

应用地衣芽孢杆菌将秸秆发酵成有机肥，其步骤如下：

(1)将发酵液分别按吸附比例(发酵液∶吸附剂＝1∶1～2)进行吸附、干燥，得到固体物质，吸附剂为麦麸∶稻糠为1∶1～2。

(2)将步骤(1)得到的固体物质与尿素、鱼粉进行混合，混合比例为菌剂固体物∶尿素∶鱼粉为60～70∶7∶25。

(3)将300公斤～500公斤的秸秆粉碎后摊平(秸秆的湿度为55％～60％)，撒上步骤(2)得到的菌剂，弄工具将秸秆和菌剂拌匀。拌好后将药渣堆成圆锥形，宽1～2米，高1～2米，不能低于0.8米，上面盖上塑料薄膜，发酵时间10～20天，当药渣原料为变成褐色或黑褐色，湿时用手握之柔软有弹性，干时很脆容易破碎，完成发酵。发酵后的药渣，经过干燥、粉碎处理，成为实用的秸秆有机肥。。

通过上述步骤获得的秸秆有机肥营养成分为：全氮为83.6(g/kg)、全磷为5.65(g/kg)、全钾为14.25(g/kg)、全铜为3.98(mg/kg)、全锌为64.26(mg/kg)、全铁为376.4(mg/kg)、全锰为47.34(mg/kg)、全钙为18.32(g/kg)、全镁为12.67(g/kg)、有机质为80.19(％)。

附图说明

图1是时间对培养液含菌量的影响

图2是温度对培养液含菌量的影响

图3是初始pH对培养液含菌量的影响

图4是装液量对培养液含菌量的影响

图5是转速对培养液含菌量的影响

图6是接种量对培养液含菌量的影响。

一种发酵中药渣有机肥菌剂的制备方法及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。