专利摘要

专利摘要

本发明提供了一种非共价靶向CRM1的多肽及其应用，该多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO：1‑SEQIDNO：10任一项所示的氨基酸序列。本发明提供的非共价靶向CRM1的多肽，约10个氨基酸，能与CRM1以非共价方式结合，该结合方式可逆，且毒副作用很小，对肿瘤有很好的抑制作用，且不容易产生耐药性，为广谱抗肿瘤药物提供理论基础。

权利要求

1.非共价靶向CRM1的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

2.一种DNA片段，其特征在于，包含编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的DNA片段。

4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的DNA片段或权利要求3所述的表达载体。

5.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的DNA片段在制备肿瘤抑制剂中的应用。

6.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的DNA片段以及药学上可接受的赋形剂。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种非共价靶向CRM1的多肽及其应用。

背景技术

细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构，是细胞遗传与代谢的调控中心。核被膜作为细胞核与细胞质的界膜，它通过其上的核孔复合物(NPC)调控着细胞核内外的物质交换与信息交流。NPC是一个双功能，双向性的亲水性核质运输通道。也就是其不仅可以介导蛋白质的入核转运，也介导RNA、核糖核蛋白颗粒(RNP)、蛋白质等的出核运输。而这些分子量大于近40KD的功能性蛋白质的出入核都必须要先通过与转运因子形成复合物，然后由转运因子介导着一起参与核质运输。

CRM1由20个热重复结构(Heat Repeat)组成，是非常重要的出核转运因子，其运输机制(如图1所示)：CRM1在细胞核内可以识别含有NES出核信号肽的蛋白质cargo，然后在核内RanGTP的协同促进作用下形成三元复合物出核，运往细胞质后，该CRM1-RanGTP-NES·cargo三元复合物在RanGAP和RanBP1的作用下去组装，CRM1卸货，cargo去参与其下游的信号通路，维持生物功能。

现有文献报道，CRM1在多种肿瘤细胞中高表达。CRM1的高表达，导致了细胞核内的许多含有NES的功能蛋白(如p53、p21、APC等)被CRM1过度错误定位到细胞质里，扰乱了细胞的正常功能，导致肿瘤等多种疾病。所以，针对出核因子CRM1识别NES·cargo的分子机制，基于结构靶向性设计药物，抑制CRM1的运输通路，可以有效杀死肿瘤细胞。

现已有的第一代、第二代抑制剂如LMB、KPT-SINE等，是一系列通过与CRM1的NES槽上的528位半胱氨酸共价不可逆结合的小分子，虽然杀伤力强，但存在以下缺陷：

(1)LMB与CRM1-C528形成的共价键是不可逆的，同时SINE-CRM1共价键的水解也非常缓慢。因为CRM1是人体所必须的出核转运因子，不可逆的LMB和水解非常缓慢的SINE会持久抑制CRM1，导致其在临床测试上具有较大毒性而不利后期临床的推进。

(2)LMB、SINE等小分子的反应基团在体内和体外能够和很多不同的小分子作用，尤其是SINE可以结合任何含有半胱氨酸的多肽。所以给药测试时可能会导致一些非特异性结合，引起一些不必要的副作用，降低药物有效性。

(3)由于LMB，SINE等依赖结合CRM1-528位上的半胱氨酸(Cys528)来抑制核内蛋白质出核。病人如果产生Cys528突变，或者本来存在此突变，将对共价结合在Cys528的突变体产生明显的抗药性。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种非共价靶向CRM1的多肽及其应用，可有效解决现有技术中存在的与CRM1共价结合的小分子具有不可逆，毒副作用大，有效性差，不耐受528位半胱氨酸突变的问题。

本发明的目的之一是基于CRM1与NES作用的分子机制，靶向结构，优化设计非共价靶向CRM1的多肽，设计的非共价靶向CRM1的多肽及氨基酸序列如下：

Nm2：GSTVEDMTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：1)；

Nm3：GSTVDELTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：2)；

Nm4：GSTVEDLTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：3)；

Nm12：GSTVDEMTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：4)

Nm13：GSDDTVDEMTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：5)；

Nm15：GSDDTVDELTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：6)；

Nm16：GSDDTVEDMTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：7)；

Nm17：GSDDTVEDLTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：8)；或

Nm42：DGYIEELIRMFGKLSIHDD(SEQ ID NO：10)。

本发明的第二个目的是提供一种DNA片段，该DNA片段包含编码上述多肽的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种表达载体，该表达载体包含上述的DNA片段。

本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述DNA片段。

本发明的第五个目的是将上述多肽或DNA片段用于制备肿瘤抑制剂中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物包括上述所述的多肽或DNA片段以及药学上可接受的赋形剂。

本发明提供的非共价靶向CRM1的多肽及其应用，具有以下有益效果：

本发明提供的非共价靶向CRM1的多肽，约10个氨基酸，能与CRM1以非共价方式结合，该结合方式可逆，且毒副作用很小，对肿瘤有很好的抑制作用，且不容易产生耐药性，为广谱抗肿瘤药物提供理论基础。

附图说明

图1为CRM1的核转运机制。

图2为MVM和CRM1/Ran/RanBP1的晶体结构图。

图3为MVM与CRM1的疏水槽的相互作用图。

图4为PD检测分析各NES突变体与CRM1的结合强弱结果图。

图5为ITC定量分析各NES突变体与CRM1的亲和力结果图。

图6为Nm2与CRM1的晶体结构。

图7为Nm12与CRM1的晶体结构。

图8为Nm13与CRM1的晶体结构。

图9为Nm15与CRM1的晶体结构。

图10为GFP-NES与CRM1在293T，HeLa细胞中的共定位分析结果。

图11为GFP-NES免疫共沉淀293T，HeLa细胞裂解中的CRM1量分析结果。

图12为Nm15的核输出抑制作用结果图。

图13为细胞存活率与NES出核率分析结果图。

图14为Nm42与CRM1亲和力分析结果图。

图15为Nm42与CRM1的结构。

图16为iDPP/DNA纳米复合物模拟图。

图17为iDPP/Nm42纳米复合物对肿瘤细胞B16-F10 cells的存活率分析结果图。

图18为小鼠活体成像结果图。

图19为iDPP/Nm42在体内的抗肿瘤活性结果图。

图20为iDPP/Nm42的安全评估结果图。

图21为iDPP/Nm42对小鼠体重的影响结果图。

图22为iDPP/Nm42对小鼠ALT、AST和CREA水平的影响结果图。

图23为KPT-330和Nm42对CRM1的C528S突变细胞的耐药性分析结果图。

具体实施方式

实施例1解析NS2 NES与CRM1/Ran/RanBP1的晶体结构

NS2是小鼠微小病毒(MVM)的一个结构蛋白，它上面有一段超生理的NES，与CRM1的亲和力较高，以致可以在没有RanGTP的协同促进条件下与CRM1的NES疏水槽稳定结合。所以，首先基于这段NS2 NES(后面简称MVM)与CRM1结合的分子机制来设计优化一些亲和力更高的非共价结合CRM1的多肽。

为了从结构上观察MVM与CRM1的相互作用，本发明解析了MVM/CRM1/Ran/RanBP1四元复合物的晶体结构。选择四元复合物的原因(1)CRM1/Ran/RanBP1三元复合物的晶体结构已有报导，为本发明四元复合物的结构解析奠定了基础。(2)本发明选择的四元复合物中的CRM1的H9 loop(406-426)是删掉的，以致于在结构上该CRM1的NES结合槽是开放的，有利MVM的结合。最终形成稳定的MVM/CRM1/Ran/RanBP1四元复合物。具体方案如下：

(1)MVM的克隆，表达纯化：

先将MVM的序列(GSTVDEMTKKFGTLTIHDT)克隆到pGEX-4T1的表达载体上的GST标签后面，中间用TEV酶切位点相连，然后将重组好的质粒转化到BL21(DE3)表达宿主中，用1升LB培养基培养。在OD为0.8～1.0时，加入0.5mM IPTG诱导剂，18℃诱导15个小时。之后将大肠杆菌菌液4000rpm离心，弃上清，用20mL悬菌buffer(50mM Tris pH 8.0,200mM NaCl,10％glycerol,2mM DTT,1mM EDTA和1mM PMSF)重悬。接着将菌液进行600-900Mpa高压破碎，15000rpm离心40min，将上清与GST-beads柱在4℃旋转结合2个小时，之后将GST-beads用wash buffer(20mM Tris8.0 200mM NaCl，10％Glycerol，2mM EDTA，2mM DTT)洗6次，每次14mL。最后用20mM Tris pH8.0,200mMNaCl,1mM EDTA,2mM DTT,10mM GSH buffer将GST-MVM洗脱下来。浓缩至1mL，用Superdex 200进行纯化。取峰值蛋白跑12％SDS-PAGE，检查蛋白的纯度。并将纯度较高的蛋白分装，并测蛋白浓度，储存在-80℃以供实验所需。

(2)CRM1,Ran,RanBP1的表达纯化：

CRM1与Ran的蛋白均用pET-28a表达，用载体上面的His标签进行纯化。CRM1用TB培养基，在OD约1.8-2.2时，加入IPTG，在25℃过夜表达10个小时。而Ran用LB培养基表达，在37℃诱导。之后收菌时，由于CRM1与Ran的纯化是用Ni-beads纯化，所以其悬菌buffer用50mMTris pH8.0，10mM Imidazole pH 7.5,300mM NaCl,2mM MgCl2，10％甘油，1mM PMSF。在清洗beads上的杂蛋白时，所用wash buffer是20mM Tris pH8.0，10mM Imidazole pH 7.5,300mM NaCl,2mM MgCl2，10％甘油。最后Ni beads的洗脱buffer是300mM Imidazole pH7.5,300mM NaCl,2mM MgCl2，10％甘油，2mM BME。纯化的方式与前面一样。

最后RanBP1的表达纯化与GST-MVM一样。不同的是本发明会用TEV酶将GST标签从RanBP1上面切掉，所用方法是将TEV蛋白酶与纯化的GST-RanBP1蛋白进行4℃过夜孵育，然后将混合液蛋白进行阳离子柱纯化。最终得到纯的RanBP1蛋白。

(3)四元复合物的获得与结晶：

将以上纯化好的蛋白(CRM1，RanBP1,RanGTP,GST-MVM)按一定比例混合，保证CRM1少量，RanGTP稍过量，GST-MVM完全过量，同时体积应小于1mL，此时它们已形成有四元复合物。然后加入少量TEV酶，4℃过夜酶切掉GST-MVM，保证四元复合物没有GST标签。然后用buffer(10mM Tris 7.5,100mM NaCl,5mM Mg(OAc)2,0.1mM GTP,2mM BME)经S200i纯化，分离。最终取峰值两边蛋白跑12％SDS-PAGE，检查复合物的形成。取形成复合物的峰，浓缩至6mg/mL，在16℃环境中，在0.1M Bis-Tris(pH 6.6),0.2M NH4NO3和18％PEG3350的条件下进行悬滴结晶。

(4)晶体的获得与结构的解析：

当晶体长到一定程度，以最快的速度在显微镜下将晶体捞出，并过一遍防冻buffer(结晶条件再补加12％甘油)，立即放入液氮并送上海光源(SSRF)收集X-光衍射数据。之后利用已有的yCRM1-hRan-yRanBP1(pdb code:4HAT)结构模型来搭建解析并优化本发明的结构数据。

实施例2基于MVM-CRM1的结构设计NES突变体

由以上方案，本发明解析到了MVM的结构。发现MVM符合class 1a NES类型，与PKI结合CRM1的类型相同(如图2和图3所示，图2为MVM和CRM1/Ran/RanBP1的晶体结构图，图3为MVM与CRM1的疏水槽的相互作用图)。从结构上可以看到D80/E81MVM(MVM上面80位的天冬氨酸ASP和81位的谷氨酸)和K533/N571CRM1(CRM1上533位的赖氨酸和571位的天冬酰胺)有轻微的抵触。

若将MVM突变成E80/D81，其与CRM1的亲和力有可能会上升，所以本发明设计了Nm2：GSTVEDMTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：1)。将NES序列上Φ1位置的氨基酸突变成L(亮氨酸)亲和力会更高，所以本发明设计了Nm3：GSTVDELTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：2)。本发明也将Nm2和Nm3进行了共同突变，设计了Nm4：GSTVEDLTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：3)。在结构上观察，发现MVM的两端都特别靠近CRM1的碱性电子云表面，所以推测把MVM的两端分别加上两个酸性氨基酸DD(天冬氨酸)，可能会增加其与CRM1的亲和力，所以本发明设计了Nm12：GSTVDEMTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：4)、Nm13：GSDDTVDEMTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：5)。

本发明把Nm2-4与Nm12,Nm13突变到一起，也分别设计了Nm15-17，Nm15:GSDDTVDELTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：6)；Nm16:GSDDTVEDMTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：7)；Nm17:GSDDTVEDLTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：8)。

突变体和WT的序列汇总如下：

WT(MVM)：GSTVDEMTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：9)；

Nm2：GSTVEDMTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：1)；

Nm3：GSTVDELTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：2)；

Nm4：GSTVEDLTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：3)；

Nm12：GSTVDEMTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：4)

Nm13：GSDDTVDEMTKKFGTLTIHDT(SEQ ID NO：5)；

Nm15:GSDDTVDELTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：6)；

Nm16:GSDDTVEDMTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：7)；

Nm17:GSDDTVEDLTKKFGTLTIHDDD(SEQ ID NO：8)。

实施例3检测NES突变体与CRM1的亲和力

Pull-down(PD)检测法：首先本发明在体外构建表达了GST-MVM，GST-NES突变体，并通过分子筛S200i纯化。为了测试这些突变体与CRM1的相互作用，将一定量的GST标签的MVM及突变体与GSH beads孵育，同时加入定量的CRM1可溶性蛋白，用PD buffer定容到1ml后共同在4℃环境下孵育结合1.5个小时，然后用PD buffer(20mM Tris pH 7.5,200mMNaCl,10％glycerol,2mM MgCl2,0.005％Triton-X100和2mM DTT)清洗3次，洗掉没有结合到beads上的蛋白，最后将结合到beads上的蛋白通过SDS/PAGE跑胶和考马斯亮蓝观察。每个实验至少重复2遍。通过PD检测，筛选出Nm15与CRM1的亲和力最高(如图4所示)。

Isothermal Titration Calorimetry(ITC)检测法：在20℃温度下，用ITC200(Microcal)仪器，在20mM Tris pH 8.0,200mM NaCl and 2mM MgCl2 buffer条件下。用125μM GST-NES突变体分别滴定相同的复合物(包括12μM yRanBP1,8μM hCRM1,和10μMRanGTP)。每个实验重复至少两次，同时用NITPIC和SEDPHAT分析ITC数据定量分析NES亲和力的变化。通过ITC定量分析，筛选出的Nm15与CRM1的亲和力相比MVM提升了近10倍，亲和力在nM级别(如图5所示)。

实施例4解析几个亲和力较高的NES突变体与CRM1复合物的晶体结构

采用解析NS2 NES与CRM1/Ran/RanBP1的晶体结构方法来获得并解析Nm2(如图6所示)，Nm12(如图7所示)，Nm13(如图8所示)和Nm15(如图9所示)的晶体结构。

图6中将MVM和Nm2与CRM1的相互作用进行了对比分析，绿色的NES是MVM，银色的是Nm2。可以看到将MVM的D80/E81突变成Nm2的E80/D81后，Nm2的这两个氨基酸分别与CRM1上面的K533/N571存在相互作用。

图7中紫色标记的Nm12的末端一个D(天冬氨酸)与CRM1的R542存在电荷相互作用。

图8中黄色标记的Nm13的末端一个D(天冬氨酸)与CRM1的K525存在电荷相互作用。

图9中蓝色表示的Nm15中其优化的三处氨基酸突变82L(异亮氨酸)，和两端均突变加上的D(天冬氨酸)同时与CRM1相互作用。

所获的上述结构分辨率在 具有较好的电子云密度，数据可信度较高。可以看到在NM15上，M82L的突变及两端额外的相互作用在结构上似乎与CRM1契合得更好，它们在提高NES与CRM1的亲和力上可能提供着重要的贡献。总之，这些突变体在结构上的分析进一步验证了本发明的猜想，也进一步符合了本发明在PD和ITC上的数据结果。

实施例5细胞上观察最优多肽Nm15与CRM1的亲和力

基于体外NES的设计优化，接下来构建了pEGFP-Nm15和pEGFP-WT哺乳动物细胞表达质粒。接着在体内比较了GFP-Nm15与GFP-WT的细胞定位和与CRM1的胞内结合情况。

细胞共定位实验：在293T和Hela细胞中分别转染一定量的GFP-Nm15、GFP-WT和GFP，培养一段时候后，将细胞进行固定，染色处理，在confocal显微镜下观察，成像，统计发现GFP-Nm15与CRM1有一个特别强的共定位(如图10所示)。由图10可知，GFP-Nm15在细胞内的共定位比GFP-WT和GFP强很多。

Immunoprecipitate(IP)实验：将上诉转染有GFP-Nm15、GFP-WT和GFP的细胞进行裂解，并用GFP或IgG抗体beads进行免疫共沉淀，之后通过SDS/PAGE，转膜，CRM1和GFP抗体孵育，接着相应物种二抗孵育后，最后用显色液曝光观察，结果如图11所示。由图11可知，在Input同样量的情况下，GFP-Nm15 IP下细胞裂解液中CRM1的量最多，由此可知，在细胞内，Nm15与CRM1的亲和力最高。

实施例6细胞内观察Nm15对CRM1核输出和细胞生长的抑制作用

核输出抑制作用：在293T和Hela细胞中，首先转染mCherry-NES-MBP-NLS出核蛋白(图中标记为NES)，接着再分别用H2O、KPT-330或者转染GFP-N1,GFP-WT、GFP-Nm15质粒进行处理。培养24小时后，细胞被处理，固定，并用Hoechst染色。最后用Olympus FV-1000confocal显微镜进行观察，成像，并用NIH ImageJ软件进行分析统计，结果见图12。图12-1是HeLa和A549细胞经不同处理后的细胞Confocal成像分析图，可以看到相比与WT，在加入GFP-Nm15后，NES货物基本被抑制到核内无法出核。图12-2是对细胞核内NES量的统计数据，结果一致。因此，Nm15与WT相比，在细胞内对CRM1的核输出抑制作用更强。

细胞生长抑制作用：直接对293T和Hela细胞分别进行DMSO、KPT-330或者GFP-N1,GFP-WT、GFP-Nm15处理。培养一定时间后，分析它们对细胞的抑制生长作用。本发明发现相比于GFP-WT，GFP-Nm15具有更显著的抑制细胞生长作用，该作用虽然没有KPT-330强，但是GFP-Nm15的核输出抑制作用却是非常的显著。同时将CRM1的核输出作用与细胞的生长抑制作用一起分析，分析结果图如图13所示，图13中X轴表示细胞存活率，Y轴表示CRM1介导的NES出核率，数据均来自上图HeLa和A549细胞实验分析所得。由图13可知细胞的存活越高，其CRM1的出核运输效率越低，即细胞存活率与NES的出核率呈现负相关作用。也就是说，当抑制剂对CRM1核输出抑制作用越强的时候，其对细胞的生长抑制作用越明显。

实施例7 Nm15的进一步优化，获得最优Nm42

为了得到亲和力更高的NES，基于Nm15的CRM1的结构又优化设计了Nm42：DGYIEELIRMFGKLSIHDD(SEQ ID NO：10)，通过ITC和PD的亲和力验证Nm42与CRM1亲和力，结果见图14。图14左图中GST-Nm15与GST-Nm42均在MBP-MVM的竞争下分别PD相同量CRM1，之后通过SDS/PAGE和考马斯亮蓝分析PD下的CRM1条带亮度。图14右图为ITC滴定实验分析Nm42与CRM1的亲和力，其Kd值约22nM。由图14可知，在与CRM1的亲和力上，Nm42比Nm15稍高。

同时在结构上也观察到，Nm42与CRM1的相互作用更偏疏水性，结果见图15。

实施例8 iDPP/DNA纳米复合物的获得及活性实验

考虑到现优化的NES肽在细胞穿模能力以及进入细胞后的稳定性上较差，通过常规分子克隆方法构建pEGFP-Nm15和pEGFP-Nm42质粒，将构建好的pEGFP-Nm15和pEGFP-Nm42质粒分别与iDPP纳米粒以1：25的摩尔比轻柔混合，室温30分钟孵育，得到iDPP/DNA纳米复合物，如图16所示。图16中mPEG-PLA为嵌段共聚物单甲氧基聚乙二醇-聚左旋丙交酯，C18-PEG-iRGD为肿瘤靶向肽，DOTAP为阳性2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(MSDS)。

用动态光散色检测iDPP/DNA纳米颗粒复合物直径约193nm，电位约2.12mV。

iDPP/DNA纳米复合物的细胞存活实验：将B16-F10细胞接种在96孔板中(5000个细胞/孔)，并孵育24h，加入不同的iDPP/pEGFP-NES纳米复合物和转染试剂Turbo-2000，,在无血清培养基中孵育6个小时，之后换成完全培养基再在37℃条件下培养48个小时。然后在每个孔里加入20μL的MTT，并在黑暗环境下处理4个小时。最后直接在570nm波长下检测各孔的吸收值，以计算细胞存活率。通过MTT实验检测到对照组细胞存活率为96％，经iDPP/pEGFP-Nm15处理后的细胞存活率为66％，经iDPP/pEGFP-Nm42处理后的细胞存活率为61％，由此可知，经iDPP/pEGFP-Nm42处理后的细胞，其存活能力最低，结果见图17。也就是说在体内，iDPP/pEGFP-Nm42纳米复合物可有效抑制B16-F10细胞的生长。

实施例9 iDPP/Nm42纳米复合物的抗黑色素瘤活性分析和安全评估

(1)iDPP/DNA纳米复合物具有很高的肿瘤靶向效应-小鼠活体成像法

先对雌性C57BL/6小鼠进行静脉注射5×105 B16-F10细胞，建立B16-F10的黑色素瘤小鼠模型。为了检测iDPP/DNA纳米复合物在体内是否具有肿瘤靶向效应，当小鼠的肿瘤直径达到1cm时，通过皮下注射将纳米复合物注射进小鼠体内，72小时后，接着再尾静脉注射150mg/Kg的D-luciferin。经过20分钟之后，用2％异氟烷将该小鼠麻醉，然后用IVISLumia仪器观测luciferase在小鼠体内的发光位置，并进行活体成像，结果如图18所示。由图18可知，荧光只富集在小鼠肿瘤位置，具有特别高的肿瘤靶向效应。

(2)iDPP/Nm42在体内的抗肿瘤活性分析

用以上方法建立的黑色素瘤小鼠模型，培育6天后，将它们平均分成4组。然后分别用iDPP/WT、iDPP/Nm42纳米复合物进行静脉注射处理，每两天注射一次，每次注射5ug，共注射4次。并每天记录小鼠的肿瘤体积和体重。15天后，将所有小鼠进行颈椎错位处死，并将小鼠肿瘤组织进行拍照，称重，同时将小鼠重要的器官(心，肝，肺，脾，肾等)保存到4％的多聚甲醛里。之后通过分析不同处理后，小鼠实体瘤的重量和体积的变化，来分析iDPP/Nm42在小鼠体内的抗肿瘤活性，结果见图19。图19左图表示相比对照组，经iDPP/Nm42纳米复合物处理后，小鼠肿瘤在重量上明显减轻。图19右图表示，经iDPP/Nm42纳米复合物处理后，小鼠肿瘤在体积上增长速率明显得到了抑制。

(3)iDPP/Nm42的安全评估

对小鼠进行以上不同处理后，对其血清的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酐(CREA)的水平进行生化分析。同时也通过H&E染色对小鼠的重要器官进行了分析，最终判断iDPP/Nm42纳米复合物的安全性，结果见图20。由图20可知，iDPP/Nm42没有对小鼠的重要器官产生生理病变。同时观察小鼠的体重也没有大的波动(结果见图21)，ALT、AST和CREA的水平也没有受影响(结果见图22，22-1、22-2和22-3分别为iDPP/Nm42对小鼠ALT、AST和CREA水平的影响结果图)。也就是说iDPP/Nm42纳米复合物在有效抗肿瘤的同时也对小鼠本身无毒性。

实施例10 CRM1的C528S突变细胞不会对多肽抑制剂产生耐药性

将不同浓度梯度(1nM-1uM)的KPT-330或Nm42加入到HeLa稳转细胞系中(CRM1 WT或C528S)，每个浓度做至少6个重复。然后处理细胞，分析细胞存活能力，结果见图23。图23-1为KPT-330对CRM1的C528S突变细胞的耐药性分析结果，图23-2为Nm42对CRM1的C528S突变细胞的耐药性分析结果。由图23可知，KPT-330对CRM1-C528S的HeLa细胞的药效减弱，而经肽Nm42处理后，其抗肿瘤能力并没有因发生了C528S的突变而产生耐药性。

上述研究多肽对动物活性影响的实验中，本发明使用了基因治疗，但多肽的使用不限于基因疗法，也可以进一步优化多肽后，直接注射，或采用纳米包装多肽后注射，或者与其他制剂/药物联合使用。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种非共价靶向CRM1的多肽及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ser Thr Val Glu Asp Met Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu Thr Ile

1 5 1015

His Asp Thr

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ser Thr Val Asp Glu Leu Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu Thr Ile

1 5 1015

His Asp Thr

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ser Thr Val Glu Asp Leu Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu Thr Ile

1 5 1015

His Asp Thr

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Ser Thr Val Asp Glu Met Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu Thr Ile

1 5 1015

His Asp Asp Asp

20

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Ser Asp Asp Thr Val Asp Glu Met Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu

1 5 1015

Thr Ile His Asp Thr

20

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Ser Asp Asp Thr Val Asp Glu Leu Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu

1 5 1015

Thr Ile His Asp Asp Asp

20

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Ser Asp Asp Thr Val Glu Asp Met Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu

1 5 1015

Thr Ile His Asp Asp Asp

20

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Ser Asp Asp Thr Val Glu Asp Leu Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu

1 5 1015

Thr Ile His Asp Asp Asp

20

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Ser Thr Val Asp Glu Met Thr Lys Lys Phe Gly Thr Leu Thr Ile

1 5 1015

His Asp Thr

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Gly Tyr Ile Glu Glu Leu Ile Arg Met Phe Gly Lys Leu Ser Ile

1 5 1015

His Asp Asp

一种非共价靶向CRM1的多肽及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。