专利摘要

专利摘要

本发明属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明提供了Cas效应蛋白、包含此类蛋白的融合蛋白以及编码它们的核酸分子，还提供了包含上述蛋白或核酸分子的用于核酸编辑(例如，基因或基因组编辑)的复合物和组合物，以及包含上述蛋白的用于核酸编辑(例如，基因或基因组编辑)的方法。

权利要求

1.一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的蛋白，其是CRISPR/Cas系统中的效应蛋白。

3.一种缀合物，其包含权利要求1或2所述的蛋白以及修饰部分。

4.权利要求3所述的缀合物，其中，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽、可检测的标记，或其任意组合。

5.权利要求3所述的缀合物，其中，所述修饰部分任选地通过接头连接至所述蛋白的N端或C端。

6.权利要求4所述的缀合物，其中，所述另外的蛋白或多肽选自表位标签、报告基因序列、核定位信号(NLS)序列、转录激活结构域、转录抑制结构域、核酸酶结构域，具有选自下列的活性的结构域：核苷酸脱氨酶活性、甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、单链RNA切割活性、双链RNA切割活性、单链DNA切割活性、双链DNA切割活性和核酸结合活性；或其任意组合。

7.权利要求6所述的缀合物，其中：(i)所述转录激活结构域是VP64；(ii)所述转录抑制结构域是KRAB结构域或SID结构域；(iii)所述核酸酶结构域是Fok1。

8.权利要求3所述的缀合物，其中，所述缀合物包含表位标签。

9.权利要求3所述的缀合物，其中，所述缀合物包含NLS序列。

10.权利要求9所述的缀合物，其中，所述NLS序列如SEQ ID NO:19所示。

11.权利要求9所述的缀合物，其中，所述NLS序列位于所述蛋白的N端或C端。

12.权利要求3-11任一项所述的缀合物，其是融合蛋白。

13.权利要求12所述的缀合物，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

14.一种复合物，其包含：

(i)蛋白组分，其选自：权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3-13任一项所述的缀合物，或其任意组合；和

(ii)核酸组分，其从5’至3’方向包含SEQ ID NO：7或13所示的核酸序列和能够与靶序列杂交的导向序列，

其中，所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。

15.权利要求14所述的复合物，其中，所述核酸组分是CRISPR/Cas系统中的导向RNA。

16.权利要求14所述的复合物，其中，所述复合物不包含反式作用crRNA(tracrRNA)。

17.权利要求14所述的复合物，其中，所述导向序列连接于所述核酸序列的3’端。

18.权利要求14所述的复合物，其中，所述导向序列包含所述靶序列的互补序列。

19.一种分离的核酸分子，其包含：

(i)编码权利要求1或2所述的蛋白，或权利要求12或13所述的缀合物的核苷酸序列；和

(ii)SEQ ID NO：7或13所示序列的编码序列。

20.权利要求19所述的分离的核酸分子，其中，(i)或(ii)所述的序列经密码子优化用于在原核细胞或真核细胞中进行表达。

21.一种载体，其包含权利要求19或20所述的分离的核酸分子。

22.一种宿主细胞，其包含权利要求19或20所述的分离的核酸分子或权利要求21所述的载体。

23.一种组合物，其包含：

(i)第一组分，其选自：权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3-13任一项所述的缀合物、编码权利要求1或2所述的蛋白或权利要求12或13所述的缀合物的核苷酸序列，或其任意组合；和

(ii)第二组分，其为包含导向RNA的核苷酸序列，或者编码所述包含导向RNA的核苷酸序列的核苷酸序列；

其中，所述导向RNA从5’至3’方向包含同向重复序列和导向序列，所述导向序列能够与靶序列杂交；

所述同向重复序列是SEQ ID NO：7或13所示的核酸序列。

24.权利要求23所述的组合物，其中，所述组合物不包含反式作用crRNA(tracrRNA)。

25.权利要求23所述的组合物，其中，(i)中所述的蛋白连接有一个或多个NLS序列，或者，(i)中所述的缀合物包含一个或多个NLS序列。

26.权利要求25所述的组合物，其中，所述NLS序列连接至所述蛋白的N端或C端。

27.一种组合物，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：

(i)第一核酸，其为编码权利要求1或2所述的蛋白或权利要求12或13所述的缀合物的核苷酸序列；任选地所述第一核酸可操作地连接至第一调节元件；以及

(ii)第二核酸，其编码包含导向RNA的核苷酸序列；任选地所述第二核酸可操作地连接至第二调节元件；

其中：

所述第一核酸与第二核酸存在于相同或不同的载体上；

所述导向RNA从5’至3’方向包含同向重复序列和导向序列，所述导向序列能够与靶序列杂交；

所述导向RNA能够与(i)所述的第一核酸的编码蛋白形成复合物；

所述同向重复序列是SEQ ID NO：7或13所示的核酸序列。

28.权利要求27所述的组合物，其中，所述组合物不包含反式作用crRNA(tracrRNA)。

29.权利要求27所述的组合物，其中，所述第一调节元件和/或第二调节元件是启动子。

30.权利要求29所述的组合物，其中，所述启动子是诱导型启动子。

31.权利要求27所述的组合物，其中，(i)中所述的蛋白连接有一个或多个NLS序列，或者，(i)中所述的缀合物包含一个或多个NLS序列。

32.权利要求31所述的组合物，其中，所述NLS序列连接至所述蛋白的N端或C端。

33.权利要求23-32任一项所述的组合物，其中，所述组合物中的至少一个组分是非天然存在的或经修饰的。

34.权利要求23-32任一项所述的组合物，其中，所述导向序列连接至所述同向重复序列的3’端。

35.权利要求23-32任一项所述的组合物，其中，所述导向序列包含所述靶序列的互补序列。

36.权利要求23-32任一项所述的组合物，其中，当所述靶序列为DNA时，所述靶序列位于原间隔序列临近基序(PAM)的3’端，并且所述PAM具有5’-TTN所示的序列，其中，N选自A、G、T、C；当所述靶序列为RNA时，所述靶序列不具有PAM结构域限制。

37.权利要求23-32任一项所述的组合物，其中，所述靶序列是来自原核细胞或真核细胞的DNA或RNA序列；或者，所述靶序列是非天然存在的DNA或RNA序列。

38.权利要求23-32任一项所述的组合物，其中，所述靶序列存在于细胞内。

39.权利要求38所述的组合物，其中，所述靶序列存在于细胞核内或细胞质内。

40.权利要求38所述的组合物，其中，所述细胞是真核细胞或原核细胞。

41.一种试剂盒，其包括一种或多种选自下列的组分：权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3-13任一项所述的缀合物、权利要求14-18任一项所述的复合物、权利要求19或20所述的分离的核酸分子、权利要求21所述的载体、权利要求23-40任一项所述的组合物。

42.一种递送组合物，其包含递送载体，以及选自下列的一种或多种：权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3-13任一项所述的缀合物、权利要求14-18任一项所述的复合物、权利要求19或20所述的分离的核酸分子、权利要求21所述的载体、权利要求23-40任一项所述的组合物。

43.权利要求42所述的递送组合物，其中，所述递送载体是粒子。

44.权利要求42所述的递送组合物，其中，所述递送载体选自脂质颗粒、糖颗粒、金属颗粒或蛋白颗粒。

45.权利要求42所述的递送组合物，其中，所述递送载体选自脂质体、外泌体或病毒载体。

46.权利要求45所述的递送组合物，其中，所述病毒载体选自复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。

47.权利要求45所述的递送组合物，其中，所述病毒载体选自慢病毒。

48.一种用于非治疗目的的修饰靶基因的方法，其包括：将权利要求14-18任一项所述的复合物或权利要求23-40任一项所述的组合物与所述靶基因接触，或者递送至包含所述靶基因的细胞中；所述靶序列存在于所述靶基因中。

49.权利要求48所述的方法，其中，所述靶基因存在于细胞内。

50.权利要求49所述的方法，其中，所述细胞是原核细胞或真核细胞。

51.权利要求49所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞或植物细胞。

52.权利要求49所述的方法，其中，所述细胞是人类细胞。

53.权利要求48所述的方法，其中，所述靶基因存在于体外的核酸分子中。

54.权利要求53所述的方法，其中，所述体外的核酸分子是质粒。

55.权利要求48所述的方法，其中，所述修饰是指所述靶序列的断裂。

56.权利要求55所述的方法，其中，所述断裂包括DNA的双链断裂或RNA的单链断裂。

57.权利要求55所述的方法，其中，所述修饰还包括将外源核酸插入所述断裂中。

58.一种用于非治疗目的的改变基因产物的表达的方法，其包括：将权利要求14-18任一项所述的复合物或权利要求23-40任一项所述的组合物与编码所述基因产物的核酸分子接触，或者递送至包含所述核酸分子的细胞中，所述靶序列存在于所述核酸分子中。

59.权利要求58所述的方法，其中，所述核酸分子存在于细胞内。

60.权利要求59所述的方法，其中，所述细胞是原核细胞或真核细胞。

61.权利要求59所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞或植物细胞。

62.权利要求59所述的方法，其中，所述细胞是人类细胞。

63.权利要求58所述的方法，其中，所述核酸分子存在于体外的核酸分子中。

64.权利要求63所述的方法，其中，所述体外的核酸分子是质粒。

65.权利要求58所述的方法，其中，所述基因产物的表达被增强或降低。

66.权利要求58所述的方法，其中，所述基因产物是蛋白。

67.权利要求48-66任一项所述的方法，其中所述复合物或组合物包含于递送载体中。

68.权利要求67所述的方法，其中，所述递送载体选自脂质颗粒、糖颗粒、金属颗粒或蛋白颗粒。

69.权利要求67所述的方法，其中，所述递送载体选自脂质体、外泌体或病毒载体。

70.权利要求69所述的方法，其中，所述病毒载体选自复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。

71.权利要求69所述的方法，其中，所述病毒载体选自慢病毒。

72.权利要求48-66任一项所述的方法，其用于改变靶基因或编码靶基因产物的核酸分子中的一个或多个靶序列来修饰细胞。

73.一种由权利要求48-72任一项所述的方法获得的细胞，其中所述细胞包含在其野生型中不存在的修饰。

74.权利要求73所述的细胞的细胞产物。

75.一种体外的细胞，其包含：权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3-13任一项所述的缀合物、权利要求14-18任一项所述的复合物、权利要求19或20所述的分离的核酸分子、权利要求21所述的载体或权利要求23-40任一项所述的组合物。

76.权利要求75所述的细胞，其中，所述细胞是真核细胞。

77.权利要求75所述的细胞，其中，所述细胞是动物细胞或植物细胞。

78.权利要求75所述的细胞，其中，所述细胞是人类细胞。

79.权利要求75-78任一项所述的细胞，其是细胞系。

80.权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3-13任一项所述的缀合物、权利要求14-18任一项所述的复合物、权利要求19或20所述的分离的核酸分子、权利要求21所述的载体、权利要求23-40任一项所述的组合物或权利要求41所述的试剂盒用于非治疗目的的核酸编辑的用途。

81.权利要求80所述的用途，其中，所述核酸编辑包括基因或基因组编辑。

82.权利要求81所述的用途，其中，所述基因或基因组编辑包括修饰基因。

83.权利要求81所述的用途，其中，所述基因或基因组编辑包括敲除基因。

84.权利要求81所述的用途，其中，所述基因或基因组编辑包括修复突变。

85.权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3-13任一项所述的缀合物、权利要求14-18任一项所述的复合物、权利要求19或20所述的分离的核酸分子、权利要求21所述的载体、权利要求23-40任一项所述的组合物或权利要求41所述的试剂盒在制备制剂中的用途，所述制剂用于：

(i)离体基因或基因组编辑；

(ii)离体单链DNA的检测；

(iii)编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物；或

(iv)治疗由靶基因座中的靶序列的缺陷引起的病症。

说明书

PCT国内申请，说明书已公开。

新型CRISPR/Cas12f酶和系统专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。