专利摘要

专利摘要

本发明公开了一种检测人癌细胞的多肽及其应用。该多肽，是如下的1)或2)或3)或4)：1)序列表中的序列1自氨基末端至少5个氨基酸残基组成；2)序列表中的序列2自氨基末端至少5个氨基酸残基组成；3)序列表中的序列3自氨基末端至少5个氨基酸残基组成；4)序列表中的序列4自氨基末端至少5个氨基酸残基组成；所述多肽还含有取代基，所述取代基为烷氧基、烷酰基或酰胺基。组成所述多肽的氨基酸残基为L-型和/或D-型。本发明的多肽弥补了抗体等生物制剂制备繁琐、稳定性较差、费用昂贵、穿透力弱等缺点，可用于制备肝癌及其他恶性肿瘤的诊断试剂及治疗药物。

说明书

技术领域

本发明涉及检测人癌细胞的多肽及其应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一种世界性的常见恶性肿瘤。发病率高、死亡率高、恶性程度高、诊断迟、预后差、复发率高，是肝癌的特点。因此，建立肝癌的早期筛查方法，以及寻找新的有效抗癌药物具有重要意义。

目前，肝癌血清学诊断的首选标志物为甲胎蛋白(AFP)，利用AFP抗体检测血清中的AFP已沿用多年。但据权威统计，部分具有肝硬化或慢性肝炎的患者血清中也可以检测到AFP；同时，大约1/3的HCC患者，其血清AFP却呈阴性(＜20ng/mL)。因此，AFP检测法在特异性和准确性上仍存在缺陷[吴孟超，原发性肝癌的诊断及治疗进展。中国医学科学院学报2008，30：363-365]。此外，抗体虽然以其特异靶向性在临床诊断中广泛应用，但存在着制备繁琐、稳定性较差、费用昂贵、穿透力弱等缺点。因此，为了提高肝癌诊断的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要寻求针对新的肝癌标志物设计小分子探针，以作为检测和治疗肝癌的有效方法。

自然界存在大量具有生物学活性的多肽，在机体的生理与病理过程中发挥着重要作用，如分子识别、信号转导、细胞存活、增殖、分化等。由于多肽具有分子量小、无免疫原性、制备简单等特点，因此针对肝癌标志物合理设计并筛选具有特异靶向性的多肽，继而发展成为肝癌的诊断试剂及治疗药物，是解决上述难题的有效途径。

人肝癌相关基因LAPTM4B(NCBI Genbank No.NM_018407，Gene ID＝55353)是北京大学基础医学院通过荧光差异显示技术发现的一个肝癌相关新基因，并首先克隆了其全长cDNA[G.Z.Shao，R.L.Zhou，Q.Y.Zhang，Y.Zhang，J.J.Liu，J.A.Rui，X.Wei and D.X.Ye，Molecular cloning and characterization of LAPTM4B，a novel gene upregulated in hepatocellular carcinoma.Oncogene，2003，22：5060-5069；中国发明专利：周柔丽等“一个人肝癌相关基因及其编码产物与应用”，专利号ZL 02158110X]。LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B蛋白不仅在85％以上的人肝癌组织中过表达；也在人肺癌、肝外胆管癌、胆囊癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中高表达；而在各种分化的正常上皮细胞则呈低表达。LAPTM4B的过表达具有促进细胞恶性转化作用，而且还可促进细胞的迁移和侵袭，与肿瘤细胞的转移潜能相关[X.R.Liu，R.L.Zhou，Q.Y.Zhang，Y.Zhang，Y.Y.Jin，M.Lin，J.A.Rui and D.X.Ye，Structure analysis andexpressions of a novel tetratransmembrane protein，lysosome-associatedprotein transmembrane 4βassociated with hepatocel lular carcinoma.WorldJ.Gastroenterol.，2004，10：1555-1559]。LAPTM4B基因在肝癌、肝外胆管癌、胆囊癌、卵巢癌等组织中表达上调的幅度也与肿瘤的分化状态和肿瘤患者的生存期呈负相关，与病理分级(恶性度)呈正相关。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人癌细胞的多肽及其应用。

本发明所提供的多肽，是如下的1)或2)或3)或4)：

1)序列表中的序列1自氨基末端至少5个氨基酸残基组成；

2)序列表中的序列2自氨基末端至少5个氨基酸残基组成；

3)序列表中的序列3自氨基末端至少5个氨基酸残基组成；

4)序列表中的序列4自氨基末端至少5个氨基酸残基组成；

其中，所述多肽具体可是如下的5)或6)或7)或8)：

5)序列表中的序列1所示的氨基酸残基组成；

6)序列表中的序列2所示的氨基酸残基组成；

7)序列表中的序列3所示的氨基酸残基组成；

8)序列表中的序列4所示的氨基酸残基组成；

所述多肽还含有取代基，所述取代基为烷氧基、烷酰基或酰胺基。

所述多肽的氨基酸残基可以是L-型，也可以是D-型，或L-、D-型混合型。

本发明的另一个目的是提供一种多肽偶联物。

本发明所提供的多肽偶联物是由所述多肽与载体偶联获得的偶联物；所述载体为药物、毒素、细胞因子、放射性元素、载体蛋白、酶、凝集素、荧光基团、量子点或高吸光系数发色团。

所述载体可以根据具体的目的选择，如载体为药物或细胞因子等，可将药物或者细胞因子靶向癌细胞。也可用放射性元素、载体蛋白、酶、凝集素、荧光基团、量子点或高吸光系数发色团作为载体，如用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素为载体获得的偶联物可以作为检测探针，检测癌细胞。

本发明的再一个目的是提供一种试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，其包含所述的多肽偶联物或所述的多肽。

所述试剂盒可用于检测人癌细胞或LAPTM4B蛋白或人肝癌等癌标志物十肽EL2。如含有所述多肽辣根过氧化物酶偶联物的试剂盒可以用酶联免疫吸附法(ELISA)检测LAPTM4B蛋白或十肽EL2。如含有所述多肽异硫氰酸荧光素偶联物的试剂盒可用激光扫描共聚焦显微镜检测人癌细胞。所述人癌细胞可为人肝癌、人肺癌、肝外胆管癌、胆囊癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌或结肠癌等癌细胞。

本发明的多肽与人肝癌等癌标志物十肽EL2结合能力强，并具有良好的特异性。上述多肽及多肽偶联物能特异性地结合于人肝癌等癌细胞表面以及释放到体液，包括血液、胸水、腹水、尿液等之中的LAPTM4B蛋白，进而达到检测人肝癌等癌细胞及其排出物的目的。本发明的多肽及多肽偶联物除了能特异性地结合于人肝癌等癌细胞表面的LAPTM4B蛋白外，还能够进入人肝癌等癌细胞，特异性地结合于细胞内部的LAPTM4B蛋白，可作为人肝癌等癌的诊断试剂，弥补了抗体等生物制剂制备繁琐、稳定性较差、费用昂贵、穿透力弱等缺点。

附图说明

图1为键合人肝癌等癌标志物十肽EL2的PGMA微球表面结构示意图。

图2为不同条件下，反义肽在亲和筛选系统中的保留因子k。

图3为反义肽AP2H与人肝癌等癌标志物十肽EL2解离常数的测定。

图4为酶联免疫吸附法鉴定反义肽AP2H与人肝癌等癌标志物十肽EL2的特异性结合。

图5为AP2H与人肝癌细胞系BEL-7402的特异性结合。

图6为AP2H在人肝癌细胞系BEL-7402亚细胞结构的分布。

图7为AP2H与人肝癌细胞系HepG2的特异性结合。

具体实施方式

LAPTM4B全长ORF编码一个35kD的4次跨膜的蛋白质，其具有两个胞外区，可以与生长因子受体和整合素受体相结合，接受细胞外的信号并启动相关的信号转导。LAPTM4B蛋白第3、第4穿膜区之间的第二胞外区含有与人类其他蛋白质无同源性的十肽序列EL2(N端232-241aa)。EL2十肽亲水性好，无糖基化和磷酸化位点。将EL2与钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)载体偶联作为免疫原制备的高效价的多克隆抗体对细胞和组织中的LAPTM4B蛋白进行鉴定，证明其既可与细胞、组织中原位的LAPTM4B蛋白相结合，也可与经SDS电泳变性的LAPTM4B蛋白相结合。因此，上述LAPTM4B蛋白第二胞外区中的十肽EL2可作为检测人肝癌等癌的标志物。

在生物学上，遗传密码具有简并性，也就是说，在大多数情况下一个氨基酸可以具有两个或者更多的密码子，这就意味着正义肽链上的某一个氨基酸残基有可能与一组不同的反义氨基酸残基相配对。因此，一条给定的正义肽可能对应多条反义肽，并具有不同的相互作用，这一现象称之为反义肽的简并性[R.Zhao，X.Yu，H.Liu，L.L.Zhai，S.X.Xiong，T.S.Su，G.Q.Liu，Study on the Degeneracy ofAntisense Peptides using Affinity Chromatography，J Chromatogr.A，2001，913：421-428]。

基于此，本发明的发明人针对人肝癌等癌细胞LAPTM4B蛋白第二胞外区中十肽EL2，特别是其中的缬氨酸残基，设计了该十肽的四条简并反义肽，分别命名为AP2D，AP2Y，AP2H和AP2N，其序列如表1所示。

表1.人肝癌等癌标志物十肽EL2序列和反义肽序列

采用化学合成的方法制备本发明涉及的多肽，即固相肽合成方法(Boc方法或Fmoc方法)[E.Atherton，R.C.Sheppard，“Solid Phase Peptide Synthesis：APractical Approach”，IRL Press，Oxford，England，1989]。具体方法为将被保护的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解，同时去除侧链保护基团。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、与人癌细胞特异性结合的多肽

1)亲和筛选系统的构建

用甲基丙烯酸环氧丙脂和甲基丙烯酸乙二醇双酯共聚制备无孔、粒径单分散的聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球(10微米)，方法参考如下文献：R.Zhao，C.L.Fang，X.Yu，Y.Liu，J.Luo，D.H.Shangguan，S.X.Xiong，G.Q.Liu，Screeningof inhibitors for influenza A virus using high performance affinitychromatography and combinatorial peptide libraries，J.Chromatogr.A，2005，1064：59-66。

以上述PGMA微球作为固相基质制备高效亲和色谱填料。

用0.2mol/L H₂SO₄处理上述PGMA微球6小时，使其表面的环氧基开环；然后将开环后的PGMA微球与2.4mol/L NaOH水溶液混合，并加入环氧氯丙烷，在50℃条件下，使其与环氧氯丙烷反应4小时；反应结束后，G4漏斗抽滤，并用大量三蒸水洗涤PGMA微球至中性，再用乙醇洗涤三次，真空干燥4.5小时，制得表面富含环氧基的PGMA微球。用Keen’s法测定[R.T.Keen，Determination of oxetanes.Anal.Chem.1957，29：1041-1044]PGMA微球表面环氧基含量，测定结果表明上述PGMA微球表面环氧基含量为0.43mmol/g干燥PGMA微球。

将20.0mg十肽EL2溶解于2mL Na₂CO₃水溶液(0.2mol/L)，与1.55g表面富含环氧基的PGMA微球混合，37℃振摇反应72小时后，G4漏斗抽滤过滤，三蒸水洗涤PGMA微球三次，抽干，收集上述滤液和洗涤液。采用液相色谱外标定量法，测定键合反应前后反应液中EL2的含量(C₁₈反相色谱柱；流动相为：A：0.1％(体积百分含量)三氟乙酸的水溶液、B：0.1％(体积百分含量)三氟乙酸的乙腈溶液，流速为1.0mL/min；淋洗梯度为：0-30min，95％(体积百分含量)A+5％(体积百分含量)B至50％(体积百分含量)A+50％(体积百分含量)B)。以此，计算EL2在PGMA微球上的键合量。计算结果表明，EL2的键合量为6.0μmol/g干燥PGMA微球。最后，将键合十肽EL2的微球与10mL乙醇胺·HCl水溶液(1.0mol/L，pH 9.0)混合反应8小时，以封闭残余的环氧基，制得以EL2为配基的亲和填料，其结构如图1所示。将上述固定有十肽EL2的PGMA微球装入不锈钢色谱柱中(70mm×4.0mm i.d.)，即得到亲和柱。采用相同的制备方法但不加入十肽EL2进行反应，即可得到空白柱。将亲和柱连接于高效液相色谱仪，构建成亲和筛选系统。

2)与十肽EL2特异性结合的多肽的筛选

利用上述构建的亲和筛选系统，筛选与人肝癌等癌标志物十肽EL2特异性结合的多肽。流动相为10mmol/L磷酸盐缓冲液+100mmol/L NaCl(pH 5.5或pH 7.4)，流速为0.1mL/min，紫外检测器的检测波长为220nm。通过进样阀分别注入AP2D，AP2Y，AP2H和AP2N四种不同反义肽水溶液(多肽浓度均为0.16mg/mL；进样量5μL)，记录亲和色谱图。

色谱图结果表明，AP2D，AP2Y，AP2H和AP2N四种反义肽在亲和柱上具有不同程度的结合，而在空白柱中不存在结合。通过进样阀注入牛血清白蛋白(BSA)，其在亲和筛选系统不保留，上述实验结果表明AP2D，AP2Y，AP2H和AP2N四种反义肽与EL2具有特异性的结合能力。

四种反义肽在亲和柱上的保留因子k的比较结果如图2所示，AP2H在亲和柱上具有最强的保留，即AP2H与EL2的亲和作用力最强；并且，当流动相pH值为5.5时，AP2H与EL2的结合更为显著。因为体内肿瘤组织的微环境也呈现弱酸性，所以AP2H在弱酸性条件下更强地结合EL2的性质使其成为更有效、更具特异性的检测探针。

3)与十肽EL2特异性结合的多肽的特异性检验

设计了与反义肽AP2H具有相同氨基酸组成，但氨基酸排列顺序不同的对照多肽ROP(HOOC-I-G-H-S-I-H-V-I-H-G-NH₂)。用1)构建的亲和筛选系统进行检测。结果表明，虽然ROP和AP2H具有相同的氨基酸组成以及相同的等电点，但是与AP2H相比，ROP在亲和筛选系统保留很弱(图2)，说明AP2H与EL2的相互作用具有序列专一性。

4)反义肽AP2H与十肽EL2结合能力的定量分析

利用1)构建的亲和筛选系统，测定反义肽AP2H与十肽EL2的解离常数。反义肽AP2H用磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 5.5)溶解，配制成浓度分别为5.69×10^-6mol/L，1.14×10^-5mol/L，1.71×10^-5mol/L和2.28×10^-5mol/L的溶液。以上述溶液分别为流动相通过亲和筛选系统，流速为0.5mL/min，紫外检测器的检测波长为220nm。

结果如图3所示，在前沿色谱图中(图3A)，随着反义肽AP2H溶液进样到亲和筛选系统，紫外吸收信号最终达到平台即饱和吸附状态。根据前沿色谱理论[Y.Shai，M.Flashner，I.M.Chaiken，Anti-sense peptide recognition of sensepeptides：direct quantitative characterization with the ribonucleaseS-peptide system using analytical high-performance affinity chromatography.Biochemistry，1987，26：669-675]，从前沿色谱图可以得到 的值(其中 为亲和柱半饱和时所需多肽溶液的体积；V₀为死体积，此处以NaNO₃溶液测定死体积)。以反义肽AP2H溶液的浓度[P]₀对 拟合直线(图3B)，然后根据公式(1)以及所拟合直线的斜率和截距的比例，计算得到反义肽AP2H与EL2的解离常数K_d为5.51×10^-6mol/L，表明反义肽AP2H与十肽EL2具有强结合能力。

公式(1)：1V‾-V0=KdMT+1MT[P]0]]>

5)酶联免疫吸附法鉴定反义肽AP2H与十肽EL2的特异性结合

以人肝癌等癌标志物十肽EL2与钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)(购自Sigma-Aldrich公司，产品编号：H7017)偶联后包被酶标板(包被液中EL2的浓度为1μg/mL)，每孔100μL，4℃过夜。弃去包被液，3％BSA封闭酶标板，每孔300μL；37℃封闭2小时后，弃液，洗涤酶标板3次。用改良的过碘酸钠氧化法[李成文，《现代免疫化学技术》，上海科学技术出版社，1992年，109-120]制备AP2H-HRP(AP2H-辣根过氧化物酶)偶联物。将AP-HRP偶联物溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 5.5或pH 7.4)，配制成不同浓度。将不同浓度的AP2H-HRP溶液分别加入酶标板，每孔100μL，37℃孵育2小时。甩掉AP2H-HRP溶液，洗涤5次，加入底物显色液，每孔100μL，室温避光静置10分钟，加入2mol/L H₂SO₄终止液，每孔50μL。显色结果用酶标仪测定波长492nm处吸光值。以BSA包被酶标板，其余步骤不变作为对照实验。

实验结果表明，反义肽AP2H与人肝癌等癌标志物十肽EL2的结合呈饱和吸附模式(图4)；即使EL2偶联于载体蛋白KLH上，反义肽AP2H仍能特异性对其进行识别，说明反义肽AP2H可以通过识别人肝癌等癌标志物十肽EL2特异性地结合人癌细胞LAPTM4B蛋白，可以发展成为一种新型的人肝癌等癌症的快速诊断试剂。

实施例2、人肝癌快速诊断试剂

1)反义肽AP2H-异硫氰酸荧光素(FITC)偶联物

用碳酸盐缓冲液(0.09mol/L NaHCO₃，0.01mol/L Na₂CO₃，0.126mol/L NaCl；pH 9.0)溶解反义肽AP2H，得到反义肽AP2H溶液，其浓度为2mg/mL；异硫氰酸荧光素(FITC)溶于二甲基亚砜(DMSO)，其浓度为12.5mg/mL。将上述反义肽AP2H溶液与FITC溶液以体积比2∶1混合，室温避光反应；2小时后，反应产物用高效液相色谱进行纯化。

采用C₈反相色谱柱(250mm×10mm i.d.)分离纯化反应产物中的AP2H-FITC偶联物。流动相为；A：0.1％(体积百分含量)三氟乙酸的水溶液、B：0.1％(体积百分含量)三氟乙酸的乙腈溶液，流速为2.8mL/min；淋洗梯度为：0-20-30-35min，10％(体积百分含量)B-40％(体积百分含量)B-80％(体积百分含量)B-80％(体积百分含量)B时，AP2H-FITC色谱峰的保留时间为23.00min。收集该色谱峰进行冷冻干燥，得到黄色固体。基质辅助激光解析质谱对所得黄色固体进行鉴定，质谱图中质荷比(m/z)1459.6的峰即AP2H-FITC分子的加H⁺峰，证明该黄色固体即AP2H-FITC偶联物。多肽ROP按照上述方法与FITC偶联，获得ROP-FITC偶联物作为对照。

2)AP2H与人肝癌细胞系BEL-7402的特异性结合

人肝癌细胞系BEL-7402细胞[刘歆荣等，人肝癌相关新基因编码产物LAPTM4B的鉴定及其生物学特性，北京大学学报，2003，35：340-347](中国科学院化学研究所北京大学)培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640(GIBco BRL)培养基中，以1×10⁵/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24小时后，弃去培养液，加入用磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶解的AP2H-FITC(6.85×10^-5mol/L，冰浴预冷)；对照组加入相同摩尔浓度的用磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶解的ROP-FITC(冰浴预冷)；冰浴避光孵育1小时后，分别弃去AP2H-FITC和ROP-FITC溶液，并用PBS洗涤6次。用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000-IX81，日本)检测细胞中的荧光分布。

结果如图5所示，加入AP2H-FITC的BEL-7402细胞观测到绿色荧光，而对照组的BEL-7402细胞则没有观测到绿色荧光信号，说明AP2H-FITC偶联物与肝癌细胞BEL-7402的识别是序列专一性的。

3)AP2H在人肝癌细胞系BEL-7402亚细胞结构的定位

为了观察AP2H在人肝癌细胞的亚细胞结构的定位，用AP2H-FITC与Hoechst33342对BEL-7402细胞进行了双染实验。Hoechst 33342是一种显示细胞核的蓝色荧光染料。1×10⁵/mL浓度的BEL-7402细胞植入圆形玻底培养皿中并在细胞培养箱中培养24小时；弃去培养液后，加入含有1μmol/L Hoechst 33342的AP2H-FITC溶液(AP2H-FITC浓度为6.85×10^-5mol/L，冰浴预冷)，冰浴避光孵育1小时后，弃去含Hoechst 33342的AP2H-FITC溶液；用PBS洗涤细胞6次后检测细胞中的荧光分布。

结果表明，AP2H-FITC结合在BEL-7402细胞的细胞膜和细胞质，在细胞质中呈团块状分布；AP2H-FITC不与BEL-7402细胞的细胞核结合，但在细胞核周围呈局部聚集状态(图6)。这个结果与免疫组化法对LAPTM4B蛋白的定位结果一致[G.Z.Shao，R.L.Zhou，Q.Y.Zhang，Y.Zhang，J.J.Liu，J.A.Rui，X.Weiand D.X.Ye，Molecular cloning and characterization of LAPTM4B，a novel geneupregulated in hepatocellular carcinoma.Oncogene，2003，22：5060-5069]，说明AP2H-FITC与肝癌细胞的结合位点即LAPTM4B蛋白。

4)AP2H与人肝癌细胞系HepG2的特异性结合

人肝癌细胞系HepG2(购自American Type Culture Collection，ATCC)经过RNAi(shRNA)质粒及其空载质粒转染，筛选出稳定的低LAPTM4B蛋白表达的HepG2-RNAi细胞和高表达LAPTM4B蛋白的HepG2-mock细胞[魏渲辉，一个肿瘤相关新基因LAPTM4B编码蛋白质的结构与功能的进一步研究，博士学位论文，北京大学，2005；熊富霞，LAPTM4B-35蛋白在肝癌生长与转移中的作用及其分子机制的研究，博士学位论文，北京大学，2008](中国科学院化学研究所北京大学)。

上述两种细胞分别培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中。以1×10⁵/mL的细胞浓度分别植入圆形玻底培养皿，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24小时后，弃去培养液，分别加入用PBS溶解的AP2H-FITC(6.85×10^-5mol/L，冰浴预冷)，冰浴避光孵育1小时后，分别弃去AP2H-FITC溶液，并用PBS洗涤6次。用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞中的荧光分布。

结果如图7所示，加入AP2H-FITC的HepG2-mock细胞观测到明显的绿色荧光；加入AP2H-FITC的HepG2-RNAi细胞观测到的绿色荧光强度显著减弱，证明AP2H是通过特异性结合LAPTM4B蛋白而检测肝癌细胞的，AP2H可用于组织化学和细胞化学鉴定组织或细胞中LAPTM4B蛋白的表达水平，具有诊断肿瘤和评价其恶性度的应用价值。

检测人癌细胞的多肽及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。