专利摘要

专利摘要

本发明申请涉及一种蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物及其制备方法，包括如下步骤：将蓝鳍金枪鱼骨清洗干净并置于酸性溶液中浸泡去除无机钙盐；再经氯化钠溶液浸泡除去非胶原的杂蛋白；将处理后的鱼骨经过复合酶脱脂脱腥酶解、高温灭酶、水热提取得蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物溶液；干燥即得到胶原水解物粉末。本发明制备工艺科学合理，充分利用水产品加工中未利用的鱼骨为原料，开发具有潜在市场价值的胶原水解物，并采用复合酶脱脂脱腥酶解的方法，调节复合酶酶解条件，大大缩短胶原水解物的提取时间，制备出分子量不同，分别具有凝冻强度高、抗氧化活性强且安全无毒副作用等优点的金枪鱼骨胶原蛋白水解物，提高生产效率，降低能耗。

权利要求

1.一种蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）脱钙处理：将蓝鳍金枪鱼的鱼骨清洗干净并置于酸性溶液中浸泡；

（2）复合酶脱脂脱腥酶解提取：将处理后的鱼骨用脂肪酶、酵母及蛋白酶酶解，灭酶，热水提取，得到蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物溶液；

（3）纯化干燥步骤：将水解物溶液过滤，经过冷冻干燥得到蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物粉末成品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）和（2）之间还包括去除杂蛋白步骤：将脱钙鱼骨置于氯化钠溶液中浸泡后，用去离子水反复清洗。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，脱钙处理中的酸性溶液为0.1~0.2wt% 盐酸溶液或者硫酸溶液，浸泡时间为7.5~15h，而且每1.5h更换一次酸溶液。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的复合酶脱脂脱腥酶解提取是指：将鱼骨与去离子水按重量比例1:9~20混合，调节pH为2~10，按照浓度（脂肪酶的质量/鱼骨的质量）0.3~0.5wt%加入脂肪酶，按照浓度（酵母的质量/鱼骨的质量）2.0~3.0wt%加入酵母，按照浓度（蛋白酶的质量/鱼骨的质量）0.5~2.0wt%加入蛋白酶，酶解温度40~55℃，酶解6~10小时；酶解液加热到90~95℃灭酶10~15min，热水提取骨胶原水解物。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钠溶液的浓度为3~5wt%，浸泡鱼骨时间为10~12h。

6.一种蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物，其特征在于采用权利要求1或2所述的制备方法制备。

7.如权利要求6所述的蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物，其特征在于，当骨胶原水解物重均分子量为10~30KDa，分子量分布系数D (M_w/M_n)范围为2.33~3.61时，其凝冻强度为200~270Bloom g。

8.如权利要求6所述的蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物，其特征在于，当骨胶原水解物重均分子量为1~3KDa，分子量分布系数 D (M_w/M_n)范围为1.12-1.31时，胶原水解物羟自由基清除率为60~80%，氧自由基清除率为50~65%。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鱼类骨胶原水解物及其制备方法和用途，尤其涉及一种蓝鳍金枪鱼鱼骨胶原水解物及其制备方法和用途。

背景技术

胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白质，其主要存在于动物的结缔组织中。胶原蛋白因其具有良好的生物相容性、生物活性及生物可降解性被广泛地应用在食品、医药、组织工程、化妆品等领域中。胶原水解物是胶原蛋白在一定条件下水解而得到的水解物。与胶原蛋白相比，胶原水解物的分子量低、水溶解性较好，易被人体吸收。与此同时，胶原蛋白的水解物也具有了更多的生物活性，如：抗氧化性，延缓衰老，补钙促进骨骼发育提高免疫力，促进皮肤细胞再生等。

目前的胶原水解物主要来源于猪、牛等动物。但是，这些胶原水解物可能存在免疫原性、宗教信仰等问题。随着国内水产加工业的发展，水产加工企业产生的下脚料如鱼头、鱼皮、鱼鳞、鱼骨、鱼鳍等逐年增长。但是，水产加工下脚料的利用并不充分，造成资源浪费。来源于鱼类的胶原水解物无疾病危害且没有宗教限制。

胶原水解物提取的传统工艺可分为三类，即酸法、碱法以及酶法。其基本原理都是根据胶原蛋白的特性，改变蛋白质的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。酸法和碱法是将胶原蛋白在酸性和碱性环境下提取出来，酸法比较广泛，而碱法报道较少。生物酶法是利用酶反应的温和高效益在一定的环境条件下将胶原蛋白从不同的原料中提取出来。随着酶制剂工业的不断发展与应用领域的不断拓宽，酶制剂产量迅速增长，市场竞争优势不断增加。

在酶的选择中，主要选择有木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶。木瓜蛋白酶应用范围广主要由于其作用位点、切割位点多，如赖氨酸、精氨酸的羧基端；碱性蛋白酶的作用位点则主要以羧基侧为疏水性芳香族氨基酸的肽键；中性蛋白酶的作用位点为羧基侧的亮氨酸、苯丙氨酸的肽键。有研究者认为末端含有组氨酸和亮氨酸的氨基酸序列可以显著提高蛋白多肽的抗氧化性；肽链中的疏水性氨基酸、芳香环氨基酸含量高时，其抗氧化性具有显著性。故本专利中一个实施例中采用碱性蛋白酶制备了具有高抗氧化性能的金枪鱼骨胶原水解物。

虽然来源于鱼的胶原水解物性能好，应用广泛，但是人们的目光并没有瞄准通过控制酶解条件制备出不同分子量的金枪鱼骨胶原蛋白水解物，并探究不同分子量的骨胶原水解物的凝冻强度及抗氧化活性。金枪鱼骨作为金枪鱼加工过程的下脚料，经济价值未得到充分地利用，而金枪鱼作为一种优质海洋经济鱼类，市场需求量巨大，产生的金枪鱼骨数量大。CN 103421871 A公开了一种金枪鱼胶原水解物的制备工艺，包括以下步骤：A:将原料金枪鱼骨进行浸泡清洗后，首先使用粉碎机粉碎处理后，与4~8倍体积水混合均匀后进入离心机连续离心30分钟去除上清，食醋脱钙处理30~50分钟，再次离心；B：提取：利用生物酶解罐进行酶解处理，反应条件为37~65℃，pH6.5~8.0，反应时间4~8小时；C:成型及烘干：酶解产物用30KD超滤膜处理，透过部分经纳滤膜浓缩，喷雾干燥即为金枪鱼骨胶原水解物成品。

其金枪鱼骨胶原水解物的制备方法中，没有介绍通过调控复合酶脱脂除腥酶解提取条件得到不同分子量的骨胶原水解产物的方法，且对金枪鱼骨胶原水解物的凝冻强度及抗氧化性的没有报道。本专利介绍的金枪鱼骨胶原水解物的制备方法，充分利用水产品加工中未利用的鱼骨为原料，开发具有潜在市场价值的胶原水解物，并采用复合酶脱脂除腥酶解的方法，大大缩短胶原水解物的提取时间，得到高性能的胶原水解物，提高生产效率，降低能耗。

蓝鳍金枪鱼是金枪鱼中的名贵品种。蓝鳍金枪鱼低脂高强蛋白，泳速最快达到每小时72公里，一般情况下才2~3公里，其能承受如此巨大差异的活动量，且能自身消耗由高速运动而产生的大量自由基，说明鱼骨具有很高的强度和很强的清除自由基的能力。由于蓝鳍金枪鱼有以上特性，因此我们把目光投向蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物的凝冻强度及抗氧化性能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物的制备方法，该制备方法能够调控水解物的分子量，工艺科学合理、易于操作。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物的制备方法，包括如下步骤：

（1）脱钙处理：将蓝鳍金枪鱼的鱼骨清洗干净并置于酸性溶液中浸泡；

（2）复合酶脱脂脱腥酶解提取：将处理后的鱼骨用脂肪酶、酵母及蛋白酶酶解，灭酶，热水提取，得到蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物溶液；

（3）纯化干燥步骤：将水解物溶液过滤，经过冷冻干燥得到蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物粉末成品。

进一步的，步骤（1）和（2）之间还包括去除杂蛋白步骤：将脱钙鱼骨置于氯化钠溶液中浸泡后，用去离子水反复清洗。

其中，脱钙处理中的酸性溶液为0.1~0.2wt% 盐酸溶液或者硫酸溶液，浸泡时间为7.5~15h，而且每1.5h更换一次酸溶液。

所述的复合酶脱脂脱腥酶解提取是指：将鱼骨与去离子水的按重量比例1:9~20混合，调节pH为2~10，按照浓度（脂肪酶的质量/鱼骨的质量）0.3~0.5wt%加入脂肪酶，按照浓度（酵母的质量/鱼骨的质量）2.0~3.0wt%加入酵母，按照浓度（蛋白酶的质量/鱼骨的质量）0.5~2.0wt%加入蛋白酶，酶解温度40~55℃，酶解6~10小时；酶解液加热到90~95℃灭酶10~15min，热水提取骨胶原水解物。

所述氯化钠溶液的浓度为3~5wt%，浸泡鱼骨时间为10~12h。

本发明的另一个目的是提供一种蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物，该胶原水解物安全无毒副作用，并具有较强的凝冻强度及抗氧化作用。

这种蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物有上述制备方法制得，该胶原水解物的重均分子量范围在1~30KDa。当重均分子量为10~30KDa，分子量分布系数D (M_w/M_n)范围为2.33~3.61时，该胶原水解物的及凝冻强度较好，其凝冻强度为200~270Bloom g。当重均分子量为1~3KDa，分子量分布系数D (M_w/M_n)范围为1.12-1.31时，该胶原水解物抗氧化性较好，羟自由基清除率为60~80%，氧自由基清除率为50~65%。

相比现有技术，本发明具有如下有益的技术效果：

本发明选用脂肪酶、酵母、蛋白酶和作为复合酶酶解，通过调控复合酶解条件使不同分子量的胶原水解物很大程度地释放出来且大大缩短胶原水解物的提取时间，得到高性能的胶原水解物，提高生产效率，降低能耗；蓝鳍金枪鱼鱼骨酶解得到的不同分子量的胶原水解物，凝冻强度高，安全、无毒副作用，抗氧化作用显著。充分利用水产品加工中未利用的鱼骨为原料，开发具有潜在市场价值的胶原水解物。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明提供一种胶原水解物的制备方法，其包括步骤如下：脱钙除杂蛋白处理步骤，复合酶脱脂脱腥酶解提取步骤，纯化干燥步骤。

本发明的脱钙除杂蛋白步骤中，将鱼骨充分沥干后用加入0.1~0.2wt%酸液浸泡5~24h，优选为7.5~15h，每1.5h更换一次酸溶液，脱除鱼骨中的钙盐；使用浓度为2~8wt%，优选3~5wt%的氯化钠溶液浸泡鱼骨来去除杂蛋白，浸泡时间为8~14小时，优选10~12小时，然后使用去离子水清洗鱼骨，去除氯化钠。

本发明的脱脂脱腥提取复合酶解步骤中，将脱钙鱼骨沥干，鱼骨与去离子水的重量比例1:5~20，优选1:9~20，调节pH为2~10，按照浓度（脂肪酶的质量/鱼骨的质量）为0.1~0.6wt%，优选为0.3~0.5wt%加入脂肪酶，按照浓度（酵母的质量/鱼骨的质量同上）1.0~5.0wt%，优选为2.0~3.0wt%加入酵母，按照浓度（碱性蛋白酶的质量/鱼骨的质量）为0.25~3.0wt%，优选为0.5~2.0wt%加入一种蛋白酶，酶解温度调至30~60℃，优选为40~55℃，酶解5~12小时，优选为6~10小时；酶解液加热到90~95℃灭酶10~15min。热水提取骨胶原水解物并过滤。

本发明调节pH的碱性物质并没有特别限制，置于其水溶液显示碱性即可。优选为无机碱性。无机碱的例子包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂或氢氧化钙。

本发明调节pH的酸性物质并没有特别限制，置于其水溶液显示酸性即可。优选为有机酸或无机酸。有机酸例如醋酸、柠檬酸。本发明的酸性物质更优选为无机酸。无机酸的例子包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸或硝酸。

本发明中去除脂肪所用的酶没有特别限制。脂肪酶例如碱性脂肪酶、中性脂肪酶和酸性脂肪酶。

本发明中酶解所用的蛋白酶并没有特别限制。蛋白酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。本发明的一个具体实施中，蛋白酶为碱性蛋白酶。

本发明从蓝鳍金枪鱼鱼骨中提取的胶原水解物，所得的一种金枪鱼鱼骨胶原水解物，其特征在于该胶原水解物的重均分子量范围在1~30KDa。当重均分子量为10~30KDa，分子量分布系数D (M_w/M_n)范围为2.33~3.61时,该胶原水解物的成膜性及凝冻强度较好，其凝冻强度为200~270Bloom g。重均分子量范围为1~3KDa，分子量分布系数D (M_w/M_n)范围为1.12-1.31时,其具有很好的抗氧化性，羟自由基清除率为60~80%，氧自由基清除率为50~60%，较其他鱼骨中提取的胶原水解物的抗氧化性要高（羟自由基清除率9.42%，氧自由基清除率为42.5%；自制蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物与其他鱼骨胶原水解物的抗氧化性测定均用同一标准，即：羟自由基清除率是根据Fenton反应产生的羟基自由基及其清除的分光光度法测定，氧自由基清除率是采用邻苯三酚自氧化法测定）。

实施例1

以蓝鳍金枪鱼鱼骨为原料制备较小分子量胶原水解物为例，依次进行如下工艺步骤操作：

步骤1：解冻蓝鳍金枪鱼鱼骨，用冷水清洗，室温下，将鱼骨用0.1wt%盐酸溶液中浸泡7.5h，每1.5h更换一次酸液，去除钙盐；再以浓度为4wt%的氯化钠浸泡鱼骨12小时，去除杂蛋白（杂蛋白即为非胶原的蛋白）；

步骤2：将鱼骨清洗干净、沥干，鱼骨与去离子水的重量比例1:10加入去离子水，调节pH为8，按照浓度为0.4wt%加入碱性脂肪酶(三酰基甘油酰基水解酶)，按照浓度2.0wt%放入酵母(将鱼骨中的醛类物质氧化为酸进而除去腥味)，按照浓度为1.5wt%加入一种碱性蛋白酶(Novo型丝氨酸蛋白酶)，酶解温度调至50℃，酶解10小时；酶解液加热到90~95℃灭酶15min。70℃热水提取胶原水解物；

步骤3：将得到的胶原水解物液体冷冻干燥，得到成品。

将上述指标方法得到的胶原水解物粉末进行检测，其中重均分子量为2336Da，分子量分布系数D (M_w/M_n)为1.13时，胶原水解物淡黄色，无腥味。羟自由基清除率为74.9%，氧自由基清除率为56.8%。

注：羟自由基清除率是根据Fenton反应产生的羟基自由基及其清除的分光光度法测定，羟自由基清除率测定，基于水杨酸作为Fenton试剂反应产生的羟基自由基的捕捉剂，在波长510nm处有最大吸收的原理，使FeSO₄、H₂O₂、水杨酸-乙醇成为一个反应体系，考查抗氧化剂对水杨酸捕获羟基自由基的影响；氧自由基清除率是采用邻苯三酚自氧化法-分光光度法测定的氧自由基，清除率的测定，基于邻苯三酚自氧化过程为链式反应 ,可产生氧自由基，其在波长319nm处有最大吸收的原理，其自身氧化产物的含量可用分光光度仪检测。（徐向荣， 王文华，李华斌等.比色法测定Fenton反应产生的羟自由基及其应用[J].生物化学与生物物理进展. 1999, 26(1):67-69.韩少华，朱靖博，王妍妍等.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J].中国酿造分析与检测. 2009, 207:155-157.)。

实施例2

以蓝鳍金枪鱼鱼骨为原料制备较大分子量胶原水解物为例，依次进行如下工艺步骤操作：

步骤1：解冻蓝鳍金枪鱼鱼骨，用冷水清洗，室温下，将用0.2wt%柠檬酸溶液中浸泡15h，每1.5h更换一次酸液，去除钙盐；再以浓度为2wt%的氯化钠浸泡鱼骨6小时，去除杂蛋白；

步骤2：将鱼骨清洗干净、沥干，鱼骨与去离子水的重量比例1:20加入去离子水，调节pH为7，按照浓度为0.2wt%加入中性脂肪酶（三酰基甘油酰基水解酶），按照浓度2.0wt%放入酵母(将鱼骨中的醛类物质氧化为酸进而除去腥味)，按照浓度为1.0wt%加入一种木瓜蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶），酶解温度调至40℃，酶解8小时；酶解液加热到90~95℃灭酶15min；70℃热水提取胶原水解物。

步骤3：将得到的胶原水解物液体冷冻干燥，得到成品。

将上述指标方法得到的胶原水解物粉末进行检测，其中重均分子量为29586Da，分子量分布系数D (M_w/M_n)为3.61时，胶原水解物淡黄色，无腥味。其凝冻强度为265.3Bloom g。

本领域技术人员将会认识到，在不偏离本发明的保护范围的前提下，可以对上述实施方式进行各种修改、变化和组合，并且认为这种修改、变化和组合是在独创性思想的范围之内。

一种蓝鳍金枪鱼骨胶原水解物及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。