专利摘要

专利摘要

本发明提供一种猪血有限酶解提取后分离得到的猪血抑菌剂，同时还提供了该抑菌剂的制备工艺，本发明的猪血抑菌剂是经有限酶解后再通过超滤及纳滤手段得到的分子量为500~3000的小肽混合物，F值为14.5，等电点pI值为4.4~9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很强的抑菌活性；提取的猪血抑菌剂是天然资源中得到的产物，具有良好的杀菌抑菌能力，不同于一般化学成分的杀菌抑菌产品，不会对生物体的组织、皮肤产生副作用，有着安全可靠，价格低廉，制备相对简单的优点。为制备抑菌杀菌药物及日常皮肤清洁用品方面提供了新的选择。

权利要求

1.一种猪血有限酶解提取后分离的猪血抑菌剂，其特征在于；

分子量为500~3000的小肽混合物，F值为14.5，等电点pI值为4.4~9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很强的抑菌活性；

抗菌主要成分的氨基酸序列如：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3所示，比例为1:1:1。

2.根据权利要求书1所述猪血有限酶解提取后分离的猪血抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1）将新鲜猪血与3～4倍体积量水充分混合，100～150转每分钟条件下搅拌30～60分钟，静置30到60分钟，上清液利用膜分离技术经过中空纤维滤膜滤器超滤，截留分子量30KDa以下的部分；

2）步骤1）中所得组分用氢氧化钠调节pH至8.0～8.5，按照质量体积比为1：1000～10000的比例加入胰蛋白酶，在37℃条件下酶解8～12小时；

3）用醋酸将酶解液调节pH至3.5～4.0，使酶失活终止酶解反应，加热煮沸5分钟，静置至室温，过滤，留上清液；

4）上清液经中空纤维滤膜滤器超滤，截留分子量3KDa以下部分，再通过纳滤装置截留分子量0.5KDa以上部分，既得；

5）猪血抑菌剂的F值为14.5，氨基酸组成见（表1），其中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，pI分布范围为4.4到9.7，卟啉及卟啉水解物含量小于千分之一。

说明书

技术领域：

    本发明提供一种猪血有限酶解提取后分离得到的猪血抑菌剂，同时还提供了该抑菌剂的制备工艺，属于生物化学技术领域。

背景技术：

我国每年屠宰生猪近6亿头，占世界生猪屠宰量得45%，猪血资源十分丰富，但目前除少量用于制作食用食品外，基本未得到开发利用，不仅浪费资源，而且污染环境。新鲜猪血中含有丰富的蛋白资源，从猪血中提取的抑菌剂具有良好的生物抑菌活性，能杀灭如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等多种病原菌。同时，目前采用酶法生产生物蛋白制剂是当前的研究热点，因其安全性极高、价廉、易于推广而引起人们的极大兴趣。从猪血中所提取的抑菌制剂性质稳定，是不可多得的稳定的生物抑菌制剂，可广泛的应用于生物制药领域中。

传统的从猪血中通过酶解法获取抑菌剂方法，首先需要向猪血中添加抗凝剂，如：肝素、柠檬酸钠，随着科学技术的发展和人们对自身安全的重视度的增加，外源添加物的使用目前已经成为天然产品加工和生产领域中越来越需要谨慎对待的事件。

另外，从猪血中通过酶解法获取抑菌剂，在酶解前需要通过加酸、加碱或者加热的办法诱使血中蛋白质变性，变性的蛋白质结构松散舒展可以被蛋白酶切割成更多的、分子量更小的肽片段。但是，这种变性使得蛋白质的结构展开不具有重复性，这大大的降低了酶解产物的质量稳定性，提高了质量控制的难度；在酶解法获取抑菌剂工艺中，主要是采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶等最适温度范围较宽、酶切位点较多的蛋白水解酶，目的是获得分子量尽可能小的肽组分，缺点是上述酶的酶切位点较为广泛重现性差，酶解制备活性肽的工艺难于稳定和具体掌握。同时，采用控制酶解时间来结束酶解反应，往往不另外终止酶解反应，酶的自切割产物往往混杂在产品中，从而影响酶解产品的品质。而在从酶解液中分离抑菌剂的主要方法是离子交换层析、分子筛层析和膜分离，仅从样品处理速度和量来说，膜分离>离子交换层析>分子筛层析。离子交换层析和分子筛层析两种技术分别是按照酶解液中各肽类组分的表面电荷性质和分子量大小性质对样品进行分类和初步分离，其优点在于该类技术在理论和实际应用中都非常成熟，缺点样品处理量小，柱子复生慢，难于进行扩大化生产和应用；膜分离技术是按照样品的分子大小进行分离，其优点在于快速、样品处理量大、几乎不需要膜的复生与额外处理，易于进行扩大化生产和应用。

对于酶解法获取抑菌剂工艺，从酶解液中清除卟啉（血红素）及卟啉水解物的过程，主要是活性碳或者大孔树脂吸附，氯仿等有机溶剂萃取；活性碳、大孔树脂的使用在吸附卟啉及其水解物同时也吸附水解液中的活性肽成分，造成不必要的损失，氯仿等有机溶剂的使用，提高工艺的难度、成本与质控标准，也同样会降低活性组分的含量。

所述的从酶解液中分离抑菌剂的方法主要是采用低温冷冻干燥法或者高温喷雾干燥法获得抑菌剂的干粉，使得肽类组分在干燥状态下保证其生物活性，或者现用现制备，以保证抑菌剂的生物活性。

发明内容:

本发明的目的在于提供一种猪血抑菌剂，具有抑菌活性。

本发明的目的还在于提供一种猪血抑菌剂的制备方法，具有高稳定性、重现性、操作简便性、可以快速分离活性组分，清除产品中的卟啉及其水解物，便于规模放大的，适用于工业化生产的制备方法。

本发明公开的猪血有限酶解提取后分离的猪血抑菌剂，其特征在于：

是经有限酶解后再通过超滤及纳滤手段得到的分子量为500~3000的小肽混合物，F值为14.5，等电点pI值为4.4~9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很强的抑菌活性；

上述小肽混合物经nanoAcquity-UPLC BEH130 C₁₈色谱柱分离，AB Sciex 5800 MALDI TOF/TOF质谱分析，该混合物中氨基酸序列如：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3组分含量占猪血抑菌剂总蛋白含量的86%以上，其中SEQ NO.1：SEQ NO.2：SEQ NO.3的比例为1：1：1。

以大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylocouus aureus ATCC 25923）、铜绿色假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）、白色念珠菌（Monilia albican  ATCC 10231）为活性检测菌，检测SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3三个序列组分的抑菌活性占猪血抑菌剂总抑菌活性的92%以上。

本发明所述的猪血有限酶解提取后分离的猪血抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1）将新鲜猪血与3～4倍体积量水充分混合，100～150转每分钟条件下搅拌30～60分钟，静置30到60分钟，上清液利用膜分离技术经过中空纤维滤膜滤器超滤，截留分子量30KDa以下的部分；

2）分子量30KDa以下的滤液用氢氧化钠调节pH至8.0～8.5，按照质量体积比为1：1000～10000的比例加入胰蛋白酶，在37℃条件下酶解8～12小时；

3）用醋酸将酶解液调节pH至3.5～4.0，使酶失活终止酶解反应，加热煮沸5分钟，静置至室温，过滤，留上清液；

4）上清液利用膜分离技术经中空纤维滤膜滤器超滤，截留分子量3KDa以下部分，再利用膜分离技术通过纳滤装置截留分子量0.5KDa以上部分，既得；

5）猪血抑菌剂的F值为14.5，氨基酸组成见（表1），其中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，等电点pI分布范围为4.4到9.7，卟啉及卟啉水解物含量小于千分之一。

本发明制备方法的特点在于：血液中不添加抗凝剂，直接利用大体积的水使红细胞进行溶血，然后利用膜分离技术经中空纤维素滤膜滤器直接分离分子量小于30KDa的组分，移除未溶血的细胞和细胞膜结构；未采用加酸、加碱或者加热的办法诱发血液中的蛋白质变性；本发明中蛋白酶是在血中蛋白质的稳定结构下进行切割的，蛋白质在近稳定结构时结构重现度高，蛋白结构的稳定性，提高了酶解产物的重现性与稳定性，酶解产物在各个批次间差异达到最小，不同批次产品中三种主要抑菌成分SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3的含量在89±3%之间。

本发明中采用pH在8.0到8.5间的条件进行血中蛋白质的酶解操作，此时血中蛋白质处于近稳定结构状态下，一般蛋白质在pH4～9范围内结构处于可逆变化状态，其结构具有高度的规则性和可重现性即称为稳定结构；本发明中采用胰蛋白酶，与现有技术采用的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶相比，胰蛋白酶具有较为专一的酶解位点，酶解位点的专一性提高了酶解产物的稳定性和重复性。

本发明采用醋酸酸化和加热双重技术确保胰蛋白酶酶解反应的终止，抑制酶自切割产物的产生与混入产品中，提高产品的稳定性和重复性。

现有技术中猪血中的抑菌活性组分集中在分子量3KDa以上，大分子量抗菌组分在保存和使用时活性易于因为分子本身的折叠、聚集和分解而损失，所以背景技术中抗菌活性组分需要冻干或者现用现制备；本发明小分子量抑菌活性组分不存在自身的折叠、聚集和分解问题，液体状态产品在室温下保存半年以上未见活性有损失。

表格                                                  猪血抑菌剂的氨基酸组成

本发明中的抑菌剂氨基酸组成等电点（pI）分布较宽，OD₂₂₀/OD₂₈₀(F)值较高，卟啉及卟啉水解物含量低，且产品品质稳定；卟啉去除过程中未添加活性炭、大孔树脂及氯仿等有机溶剂，可以极大的避免活性组分的丢失，提高产品的品质和稳定性。

上述猪血抑菌剂的抑菌活性采用杯碟法试验测试，试验结果表明：本发明的猪血抑菌剂具有显著的杀灭如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等常见病原菌，可用于制备杀菌、抑菌药物及清洁皮肤的日用品。

本发明的积极效果在于：猪血抑菌剂是天然资源中得到的产物，具有良好的杀菌抑菌能力，不同于一般化学成分的杀菌抑菌产品，不会对生物体的组织、皮肤产生副作用，有着安全可靠，价格低廉，制备相对简单的优点。为制备抑菌杀菌药物及日常皮肤清洁用品方面提供了新的选择。

具体实施方式：

    下面实施例用来进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例 1

一、猪血抑菌剂的制备：

1）取新鲜猪血1升与3升蒸馏水充分混合30分钟，100～150转每分钟条件下搅拌30～60分钟，静置30到60分钟，上清液利用膜分离方法经过中空纤维素滤膜滤器超滤，截留分子量30KDa以下的部分；

2）将步骤1）中获得的溶液，用氢氧化钠调节pH至8.0，加入质量体积比为1：1000的胰蛋白酶在37℃条件下酶解8小时；

3）用醋酸将酶解液调节pH至4.0，使酶失活终止酶解反应，加热煮沸5分钟，静置至室温，留上清液；

4）上清液经超滤器超滤，截留分子量3KDa以下部分，再通过纳滤装置截留分子量500以上部分，既得。

5）在步骤4）所得产品中，三种主要抑菌有效成分SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3的含量为91%，其中SEQ NO.1：SEQ NO.2：SEQ NO.3比例为1：！：1；猪血抑菌剂的F值为14.5，氨基酸组成见（表1），其中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，等电点pI分布范围为4.4到9.7，卟啉及卟啉水解物含量小于千分之一。

抑菌效价试验

二、抑菌试验

1）菌种

大肠杆菌 Escherichia coli ATCC 25922

金黄色葡萄球菌 Staphylocouus aureus ATCC 25923

铜绿色假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

白色念珠菌Monilia albican  ATCC 10231

临床多重耐药性金黄色葡萄球菌(主要耐药名称哌拉西林、氧氟沙星、头孢噻肟、新诺明。三代头孢、哌酮)

临床多重耐药性铜绿假单胞菌（主要耐药名称青霉素、红霉素、氧氟沙星、甲氧西林）

2）方法

将上述各菌种进行菌种复苏，培养至对数生长期，用菌种所对应各自种类的液体培养基稀释到10⁵～10⁶CFU/ml，采用涂布器将稀释的菌液均匀涂在对应种类固体培养基上。将牛津杯置于固体培养基上，每份猪血抑菌剂样品设3个对照，并设阴性对照，将固体培养基置于37℃培养16～24小时。后采用游标卡尺测量抑菌圈直径。试验重复3～5次。

（3）结果

注：1）抑菌圈标准-小于8mm无抑菌作用；-大于8mm有抑菌作用；

2）抑菌圈=实际测量抑菌圈-牛津杯外径（7.8mm）

结论：上述试验表明，本发明的猪血抑菌剂在杀灭和抑制如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等常规菌及一些临床多重耐药性细菌方面有着明显的效果，可用于制备杀菌抑菌药物及日常皮肤清洁用品。

实施例 2

一、猪血抑菌剂的制备：

1）取新鲜猪血1升与3升蒸馏水充分混合30分钟，100～150转每分钟条件下搅拌30～60分钟，静置30到60分钟，上清液利用膜分离技术经过中空纤维素滤膜滤器超滤，超滤截留分子量30KDa以下的部分；

2）将步骤1）中所得组分用氢氧化钠缓冲液调节pH至8.5，加入质量体积比为1：5000的胰蛋白酶在37℃条件下酶解12小时；

3）用醋酸将酶解液调节pH至3.5，使酶失活终止酶解反应，加热煮沸5分钟，静置至室温，留上清液；

4）上清液经超滤器超滤，截留分子量3KDa以下部分，再通过纳滤装置截留分子量0.5KDa以上部分，既得。

5) 步骤4）所得产品中，三种主要抑菌有效成分SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3的含量为86%，其中SEQ NO.1：SEQ NO.2：SEQ NO.3比例为1：1：1。猪血抑菌剂的F值为14.5，氨基酸组成见（表1），其中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，等电点pI分布范围为4.4到9.7，卟啉及卟啉水解物含量小于千分之一。

二、抑菌效价试验：

1）菌种

大肠杆菌 Escherichia coli ATCC 25922

金黄色葡萄球菌 Staphylocouus aureus ATCC 25923

铜绿色假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

白色念珠菌Monilia albican  ATCC 10231

临床多重耐药性金黄色葡萄球菌(主要耐药名称哌拉西林、氧氟沙星、头孢噻肟、新诺明。三代头孢、哌酮)

临床多重耐药性铜绿假单胞菌（主要耐药名称青霉素、红霉素、氧氟沙星、甲氧西林）

2）方法：

将上述各菌种进行菌种复苏，培养至对数生长期，用菌种所对应各自种类的液体培养基稀释到10⁵～10⁶CFU/ml，采用涂布器将稀释的菌液均匀涂在对应种类固体培养基上。将牛津杯置于固体培养基上，每份猪血抑菌剂样品设3个对照，并设阴性对照，将固体培养基置于37℃培养16～24小时。后采用游标卡尺测量抑菌圈直径。试验重复3～5次。

3）结果：

注：1）抑菌圈标准-小于8mm无抑菌作用；-大于8mm有抑菌作用；

2）抑菌圈=实际测量抑菌圈-牛津杯外径（7.8mm）

结论：上述试验表明，本发明的猪血抑菌剂在杀灭和抑制如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等常规菌及一些临床多重耐药性细菌方面有着明显的效果，可用于制备杀菌抑菌药物及日常皮肤清洁用品。

<110> 吉林大学

<120> 一种猪血有限酶解提取后分离的猪血抑菌剂及其制备方法

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Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Ala Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys

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一种猪血有限酶解提取后分离的猪血抑菌剂及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。