专利摘要
本发明公开了一种自生固氮菌(Massiliadura)MBC2，其保藏号为CGMCCNo.10818，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株在干旱、大温差、盐碱灾害和强烈的紫外线辐射下依然能够生存繁殖并具有固氮活性。其制成的菌剂能够施用于干旱、大温差、盐碱灾害和高紫外线辐射的生态系统，并且能够增加这些生态系统的氮素积累，可以起到改良土壤环境的作用，提高微生物和植物的生理活性，增加净初级生产力。
权利要求
1.一种自生固氮菌(Massilia dura)MBC2，其保藏号为CGMCC No.10818，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.含有权利要求1所述自生固氮菌MBC2的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还含有菌体吸附材料，所述菌体吸附材料选自草炭、珍珠岩、蛭石粉和微粉碳酸钙中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌体吸附材料为草炭。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC2的含量为2.1×10
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC2的含量为2.9×10
7.根据权利要求2-6中任意一项所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的pH值为6.8-7.2。
8.权利要求2-7中任意一项所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述自生固氮菌MBC2接种于一级斜面培养基中，在28-30℃培养3-5天，获得一级菌株；将所述一级菌株接种于二级液体培养基中，在28-30℃条件下震荡培养2-3天，获得二级菌株；将所述二级菌株接种于三级固体培养基中，在28-30℃条件下培养在1-2天后获得三级菌株；将所述三级菌株与菌体吸附材料按照菌剂中自生固氮菌MBC2的含量为2.1×10
其中，所述一级斜面培养基的配方为：KH
二级液体培养基的配方为：KH
三级固体培养基的配方为：甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgSO
9.权利要求1所述的自生固氮菌MBC2或权利要求2-7中任意一项所述的菌剂在土壤改良中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括将所述菌剂和砂土按质量比1：9-11混合均匀后施用于土壤表面。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述菌剂的用量为420-560g菌剂/亩。
说明书
技术领域
本发明属于生物固氮领域，具体涉及一种自生固氮菌MBC2及其应用。
背景技术
荒漠生态系统占全球面积的41％(Delgado-Baquerizo，et al.，2013)，其净初级生产力约占陆地生态系统生产力的20％(Whittaker，1975)。在荒漠生态系统当中，土壤氮素养分的匮乏严重地限制了系统净初级生产力(Asner，et al.，2003，Crutsinger，et al.，2013，Reich，et al.，2006)。而且荒漠化还在进一步发展，导致了土地退化，氮素养分流失严重。
自然环境中的氮素输入方式主要为生物固氮。固氮作用增加土壤可利用氮含量，为微生物和植物补充氮素促进其生长和代谢，以增加生态系统的初级生产力，并且对于生态系统的氮素循环也有着至关重要的作用。生物固氮主要有共生固氮和自生固氮。由于荒漠地区环境条件恶劣，植被稀少，因此可以进行共生固氮的豆科植物也十分稀少，自生固氮是荒漠生态系统主要的氮素输入方式。因此，自生固氮对于荒漠化防治工作和荒漠生态系统的恢复有重大意义。
为了帮助荒漠化防治工作，对于荒漠土壤自生固氮菌的研究和应用迫在眉睫。目前对于固氮细菌的报道仍以共生固氮菌为主，对于自生固氮菌的报道非常少。
因此有必要提供一种抗逆性强、适用于荒漠生态系统的具有自生固氮能力的固氮菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于干旱、温差大、盐碱灾害和高紫外线强度并且可以自生固氮的菌株，以增加土壤固氮活性和有效氮含量。
为达到以上目的，本发明提供了一种自生固氮菌(Massilia dura)MBC2，其保藏号为CGMCC No.10818，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
上述菌株为Massilia dura。菌株Massilia dura(菌种名)-MBC2(菌株名)，是将荒漠地区的表层土壤用无菌装置采集低温条件在带回实验室，经过分离、纯培养，革兰氏染色、固氮活性检测和16srDNA测序所得。
形态特性：该菌株在格兰仕染色切片上观察看到细胞呈单个，直杆菌，不是螺旋状。无鞭毛，不产生鞘或凸起物，没有休止阶段，不形成芽胞，无荚膜，格兰仕阴性。
培养特性：该菌株在阿须贝培养基上于28℃-30℃培养48h后，生长良好，专性需氧。菌落形态各异，多数直径1cm，圆形、凸起、边缘不整齐。
生理特性：NaCl(50g/L,30℃)生长实验样性，吡咯烷基方胺酶实验样性、半定量触酶实验样性，氧化酶阴性，吲哚阴性，拉丝试验阴性，硝酸盐还原阴性，脲酶阴性。
功能特性：通过斜面阿须贝培养基培养，用乙炔还原法测定，该菌株表现出了固氮活性。
本发明还提供了含有所述自生固氮菌MBC2的菌剂。所述菌剂可以为液体菌剂，也可以为固体菌剂。
可选的，所述菌剂中还含有菌体吸附材料，所述菌体吸附材料选自草炭、珍珠岩、蛭石粉和微粉碳酸钙中的至少一种。
可选的，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC2的含量为2.1×10
优选的，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC2的含量为2.9×10
可选的，所述菌剂的pH值为6.8-7.2。
本发明还提供了所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述自生固氮菌MBC2接种于一级斜面培养基中，在28-30℃培养3-5天，获得一级菌株；将所述一级菌株接种于二级液体培养基中，在28-30℃条件下震荡培养2-3天，获得二级菌株；将所述二级菌株接种于三级固体培养基中，在28-30℃条件下培养在1-2天后获得三级菌株；将所述三级菌株与草炭按照(2.1×10
其中，所述一级斜面培养基的配方为：KH2PO4 0.2g/L，MgSO4 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO3 5.0g，甘露醇10.0g，CaSO4 0.1g，pH 7.0，琼脂20g，蒸馏水1000mL；
二级液体培养基的配方为：KH2PO4 0.2g/L，MgSO4 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO35.0g，甘露醇10.0g，CaSO4 0.1g，pH 7.0，蒸馏水1000mL；
三级固体培养基的配方为：甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.5g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.05g，Rh微量元素液4.0mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 6.8-7.0。
本发明还提供了所述自生固氮菌MBC2或所述的自生固氮菌剂在土壤改良中的应用。
可选的，所述应用包括将所述菌剂和砂土按质量比1:9-11混合均匀后施用于土壤表面。
可选的，所述菌剂的用量为420-560g菌剂/亩。
发明提供了一种自生固氮细菌，通过乙炔还原法直接测得其固氮活性为60.91nmol/μL·h。该菌株是从宁夏地区的荒漠生态系统环境提取的。该地区气候干旱；全年以及昼夜温差大(冯薇,2014)；土壤盐碱灾害严重紫外线非常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到200-533尤其夏季紫
保藏信息：保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)；保藏日期是2015年05月19日；该保藏中心登记入册编号为CGMCC No.10818；该保藏中心建议的分类命名是Massiliadura；菌株编号为MBC2。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
该菌株是从宁夏地区的荒漠生态系统表层提取的。该地区气候干旱；全年和昼夜温差大；紫外线非常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到200-533常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到200-533μW/cm
称取表层土壤样品10g并放入带有玻璃珠的100mL的无菌水中静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成土壤悬液。用无菌移液管分别吸取5.0mL上述土壤悬液加入45mL无菌水中稀释，用无菌移液管将菌悬液加至固体阿须贝培养基上，于28℃的条件下培养。以平板划线法纯化菌株。本发明所用的阿须贝培养基的配方为：KH2PO4 0.2g/L，MgSO4 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO3 5.0g，甘露醇10.0g，CaSO4 0.1g，pH 7.0，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
将筛选出来细菌进行格兰氏染色，然后在显微镜(OLYMPUS BX51)下观测细菌形态并拍照。
然后用移液枪将培养基中的纯化菌落50μL接种到斜面阿须贝固体培养基上，放在培养箱里(30℃)培养三天，然后用乙炔还原法测定固氮酶活性。预实验结果表明加入20％的C2H2时，样品所表现的固氮活性最高，所以本实验中C2H2量占培养容器体积的20％。为了使实验能够和今后同类实验比较，将样品在光照培养箱中培养以保证精确的环境条件。为了使结果更加接近真实值，培养条件模拟研究区夏季的环境条件。培养时间为24h，前16h有光照，同时温度为25℃，后8小时无光照，同时温度为15℃。培养完毕后从锥形瓶中抽取50μL样气，注人已走稳基线的气相色谱仪(日立163型气象色谱仪)中测定乙烯生成量。用乙烯生成量(nmol C2H4/m
将表现出然后用16S rDNA序列识别的方法对分离出的具有固氮活性的细菌进行鉴定，过程如下：用苯酚和氯仿提取细菌DNA，用异丙醇溶解，于4℃保存。然后以1.0μl(10pmol/μl)27f和1.0μl(10pmol/μl)1496r作为引物，1.5μl细菌DNA为模板，加入0.3μL(2.5mmol/L each)dNTPs和18.7μl ddH2O，配成25μl反应体系。将此进行PCR反应，30个循环，变性、退火和延伸温度分别是94℃、52℃和72℃，该反应在ABI－2720仪器上完成。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，样品于-20℃保存。将PCR产物送至华大基因公司测序，将所测序列与NCBI数据库中已报导的模式细菌序列进行相似性比较，本文认为序列相似度大于98％的菌株与模式细菌同种。
实施例2
将自生固氮菌MBC2接种于一级斜面培养基中，在30℃培养4天，获得一级菌株；将一级菌株接种于二级液体培养基中，在30℃条件下震荡培养3天，获得二级菌株；将二级菌株接种于三级固体培养基中，在30℃条件下培养在2天后获得三级菌株；将三级菌株与草炭接触混匀后获得菌剂；使得菌剂中自生固氮菌MBC2的含量为2.9×10
其中，所述一级斜面培养基的配方为：KH2PO4 0.2g/L，MgSO4 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO3 5.0g，甘露醇10.0g，CaSO4 0.1g，pH 7.0，琼脂20g，蒸馏水1000mL；
二级液体培养基的配方为：KH2PO4 0.2g/L，MgSO4 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaCO35.0g，甘露醇10.0g，CaSO4 0.1g，pH 7.0，蒸馏水1000mL；
三级固体培养基的配方为：甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.5g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.05g，Rh微量元素液4.0mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 6.8-7.0。
所述Rh微量元素液：H3BO3 5.0g，Na3MoO4 5.0g，H2O 1000mL。
实施例3
将实施例2中制备的菌剂与砂土按照质量比1:10混匀后获得混合物，再将该混合物洒在毛乌素沙地南缘土壤表层，菌剂的用量为用量约为500g菌剂/亩。
将该菌剂接种在毛乌素沙地南缘无固氮活性的裸沙表面一年之后，其表层可以检测到固氮活性，为541.78n mol C2H2m
毛乌素沙地自然环境条件十分恶劣，主要灾害天气有干旱、紫外线过强、大风、沙暴、干热风、霜冻、冰雹等，不利于动植物和微生物的生存和繁育。毛乌素沙地属于典型中温带大陆性气候，其气候控制因子主要为西北环流，尤其是长时间控制的北方大陆气团，因此昼夜温差较大，且平均气温较低，约为6-7℃；该地区气候干旱，平均降水量大约为280mm，年潜在蒸发量为2100-2500mm，无霜期为128d，绝对无霜期为100d；风沙灾害严重，主风向为西北风，年平均风速约为2.8m s
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
一种自生固氮菌MBC2及其应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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