专利摘要

本发明公开了一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法。首先在液体培养阶段，配制碳源、氮源等营养成分，供白僵菌生长至芽孢子浓度达108～109个/mL转接固体培养基。固体培养阶段，采用米为培养基，接种液体菌后，将食用菌栽培袋与出菇圈、无菌透气封口膜用橡皮筋组合，形成一个圆柱状的微型“发酵罐”。通过菌袋培养隔绝环境微生物污染，又能良好通气，且利用菌袋内壁吸附白僵菌代谢的水分，促进白僵菌快速产孢。该方法产孢周期为8天～10天，无需大型发酵罐设备，操作简便，原料、设备、人工、时间成本低，适合农业合作社作坊式生产。制得的孢子粉可用于中药材僵蚕生产接种，也可作为原料加工成微生物杀虫剂用于农业害虫的生物防治。

权利要求

1.一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)液体培养基配制

按配方秤取原料，混合后文火煮沸，装入玻璃三角瓶中密封，进行灭菌处理；所述的液体培养基为SDY培养基：白糖为40g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，水1000mL；或所述的液体培养基为CMA培养基：玉米粉20g，麦麸10g，蛋白胨5g，KH2PO4 3g，NH4NO3 1g，MgSO4·7H2O 1g，水为1000mL；

2)接种液体培养基

在无菌条件下，从球孢白僵菌母种表面刮取孢子粉，接种至配制好的液体培养基；培养条件为：液体种在温度26±1℃，转速120～200rpm的旋转式摇床上振荡培养3天～5天，芽孢子浓度达到108个/mL～109个/mL悬浮液转入固体培养；

3)固体培养基配制

将水注入备用的大米中，按照体积质量比10～15mL/100g注水，菌袋装量占菌袋体积的20％，搅拌至大米的表面润湿，装入两头开口的食用菌栽培袋并用橡皮筋封口，进行灭菌处理；

4)接种固体培养基

将液体种接种至菌袋固体培养基，将食用菌栽培袋两头开口分别套上出菇圈并反折，再用无菌透气封口膜和橡皮筋组合封口，整理菌袋成圆柱状，晃动菌袋使菌液在大米表面分布均匀，移入培养箱或培养室内培养；

5)筛分孢子粉

待菌体在大米表面产生孢子粉，将大米培养基倒出烘干，分离米基质，获得孢子粉。

2.根据权利要求1所述的一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法，其特征在于，所述的灭菌处理条件为121℃高压蒸汽灭菌30min。

3.根据权利要求1所述的一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法，其特征在于，步骤(4)中固体培养基接种液体菌液量按照体积质量比10～12mL/100g。

4.根据权利要求1所述的一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法，其特征在于，步骤(4)中培养条件为26±1℃，培养5天～6天。

说明书

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法。

背景技术

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)属于子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属，是广谱性昆虫病原真菌，主要进行无性繁殖，产生分生孢子；可进行有性生殖并产生子实体，被鉴定为球孢虫草。球孢白僵菌在世界范围被用于害虫生物防治，我国使用球孢白僵菌防治马尾松毛虫和玉米螟取得良好的害虫持续控制效果。球孢白僵菌也能感染家蚕等经济昆虫，感染家蚕幼虫干燥后的尸体可作为中药材，称为僵蚕，入药能祛风、镇惊等。

球孢白僵菌有三种形式的侵染体，即分生孢子、芽生孢子和菌丝。由于分生孢子更耐储存，杀虫毒力优于液生芽孢子，通常采用液固双相发酵工艺生产球孢白僵菌分生孢子粉。液固两相发酵(liquid-solid biphasic fermentation)是指首先通过液体发酵快速生产大量菌丝或芽生孢子，再接种到固体营养或惰性基质上进行固体发酵，使其产生最接近自然接种体形态的气生分生孢子。该方法克服了单纯液体发酵生产的芽生孢子环境稳定性差等缺点，最大限度地利用了固体表面上产生气生分生孢子的优点，同时缩短了菌丝生长周期，生产方法简便，原料易得，能耗成本低。

陶淑霞、薛丹和肖悦公开了黄粉虫虫粉对球孢白僵菌孢子粉产量、质量及其毒力的影响(江苏农业科学，2017，45(22):114-117.)，但其从液体培养到固体培养产孢需要17天；李银平、雷仲仁和王海鸿公开了对西花蓟马高效的球孢白僵菌菌株筛选及产孢特性研究(中国生物防治学报，2013，29(2)219-226)，其从液体培养到产孢子粉需要13天，液体培养接种2次，操作繁琐，保鲜袋质地柔软，不能形成固体发酵空间，未形成通气，不利于孢子生长，孢子粉培养时间长；专利一种杀虫白僵菌菌粉的工业化生产方法(201811232111.X)，其液体发酵时间短，固体发酵时间长，从液体培养到产孢子粉需要15天培养，且开放的浅盘发酵容易被环境微生物污染，通风等控温管理人工成本高。以上文献均未明确液体培养转至固体培养时的菌液浓度。

目前球孢白僵菌孢子粉的生产周期长，固体培养过程常遭大量杂菌污染，存在着质量不稳定等问题。人工接种球孢白僵菌生产僵蚕具有较高的经济效益。但在人工僵蚕生产过程中，由于球孢白僵菌孢子粉质量不稳定，杂菌污染严重，存在着细菌性蚕病的发生和僵化不全的风险，造成养殖损失。因而亟需一种操作简便、能控制杂菌污染、保证球孢白僵菌孢子质量和产量、生产周期较短、成本较低的培养方法。由于白僵菌在世界范围广泛地被用于害虫生物防治，培养成孢子粉也能作为原料加工成微生物杀虫剂。

发明内容

本发明提供一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法。具体采用液固双相法生产球孢白僵菌分生孢子粉，从液体培养到固体培养产孢周期为8天～10天。该方法无需大型发酵罐设备，操作简便。在白僵菌液体培养阶段使芽孢子充分生长至浓度10⁸个/mL～10⁹个/mL，达到转至固体培养后菌体快速长满米表面的效果。固体培养阶段，通过菌袋与出菇圈、无菌透气封口膜和橡皮筋组合形成微型的“发酵罐”，达到隔绝污染，调控水分迅速产孢的效果。本方法原料、设备、人工、时间成本低，适合农业合作社小规模作坊式生产。所制得的孢子粉可用于中药材僵蚕生产接种，也可作为原料加工成微生物杀虫剂用于农业害虫的生物防治。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法，包括以下步骤：

1)液体培养基配制

按配方秤取原料，混合后文火煮沸，装入玻璃三角瓶中密封，进行灭菌处理；

2)接种液体培养基

在无菌条件下，从球孢白僵菌母种表面刮取孢子粉，接种至配制好的液体培养基；

3)固体培养基配制

将水注入备用的大米中，搅拌至大米的表面润湿，装入两头开口的食用菌栽培袋并用橡皮筋封口，进行灭菌处理；

4)接种固体培养基

将液体种接种至菌袋固体培养基，将食用菌栽培袋两头开口分别套上出菇圈并反折，再用无菌透气封口膜和橡皮筋组合封口，整理菌袋成圆柱状，晃动菌袋使菌液在大米表面分布均匀，移入培养箱或培养室内培养；

5)筛分孢子粉

将生长良好的过程大米培养基倒出烘干，分离米基质，获得孢子粉。

进一步的，步骤(1)中所述的液体培养基为SDY培养基：白糖为40g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，水1000mL。

进一步的，步骤(1)中所述的液体培养基为CMA培养基：玉米粉20g，麦麸10g，蛋白胨5g，KH₂PO₄ 3g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄.7H₂O 1g，水为1000mL。

进一步的，所述的灭菌处理条件为121℃高压蒸汽灭菌30min。

进一步的，步骤(2)中培养条件为：液体种在温度26±1℃，转速120～200rpm的旋转式摇床上振荡培养约3天～5天，芽孢子浓度达到10⁸个/mL～10⁹个/mL悬浮液转入固体培养。

进一步的，步骤(3)中按照体积质量比10～15mL/100g注水，菌袋装量占菌袋体积的20％。

进一步的，步骤(4)中固体培养基接种液体菌液量按照体积质量比10～12mL/100g。

进一步的，步骤(4)中培养条件为26±1℃，培养5天～6天。

所制得的孢子粉可用于中药材僵蚕生产接种，也可作为原料加工成微生物杀虫剂用于农业害虫的生物防治。

本发明的有益效果为：

1)本发明确定了白僵菌液体培养转至固体培养的芽孢子适宜浓度为10⁸个/mL～10⁹个/mL，通过菌体的在液体培养阶段充分生长，达到转至固体培养后菌体快速长满米表面的效果；

2)菌袋培养为白僵菌的生长提供了一个洁净空间，隔绝了其它微生物的污染。避免了采用浅盘开放式固体发酵，被环境中杂菌污染，杂菌生长与白僵菌争夺培养基营养，影响白僵菌生长和孢子粉产量；

3)培养时间短，从液体培养到固体培养产孢周期为8～10天；

4)不需要大型的发酵罐等昂贵的设备，适合农业合作社作坊式生产；

5)白僵菌孢子粉产量和质量稳定。用米作为固体培养基计，采用不同来源菌株繁育孢子粉，每克米产孢子15～23mg。筛分后的孢子粉含量均能达到100亿/g。该孢子粉用于僵蚕生产接种，每张蚕种养至5龄接种用量仅需2.0±0.5g。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1)本发明提供了一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法，采用液固双相法生产球孢白僵菌分生孢子粉。首先在液体培养阶段，配制碳源、氮源等营养成分，供白僵菌生长至芽孢子浓度10⁸～10⁹个/mL转接固体培养基，达到转至固体培养后菌体快速长满米表面的效果。在固体培养阶段，采用米为培养基，加入适量水溶解米表面的营养，接种液体菌后，将食用菌栽培袋与出菇圈、无菌透气封口膜用橡皮筋组合，形成一个微型的“发酵罐”。通过菌袋培养能在固体发酵阶段隔绝环境微生物污染，又能良好通气，并且通过菌袋内壁吸附白僵菌生长代谢蒸发的水分，降低培养基发酵湿度，促进白僵菌快速产孢，缩短培养时间。

实施例1

一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法，包括以下步骤：

1)液体培养基配制并灭菌

液体培养基需要碳源和氮源及少量微量元素。碳水化合物作为其生长能源，可采用含淀粉和糖类等物质的农副产品，有机氮源采用蛋白陈、酵母膏、玉米浆、大豆饼粉等有利于白僵菌生长。本实施例选择SDY培养基，成分为：白糖为40g，酵母浸粉10g，蛋白胨10g，水1000mL。

按配方称好各种原料，一起放入锅中，文火煮沸5min，用开水补足至1000mL，搅拌均匀，然后装入玻璃三角瓶中，液体装量200～250mL，瓶口用无菌透气封口膜和橡皮筋封口，121℃高压蒸汽灭菌30min。

2)白僵菌接种至液体培养基培养

用组织分离法或孢子分离法，从僵蚕中分离、纯化得到的具有一致性、稳定性，保存于玻璃试管或培养皿中的球孢白僵菌纯培养物为母种。在无菌操作条件下，用接种环从母种菌体表面刮取孢子粉，放入冷却至室温的液体种培养瓶中，迅速用无菌透气封口膜和橡皮筋封扎瓶口。液体种在温度26±1℃，转速120～200rpm的旋转式摇床上振荡培养约3天～5天，芽孢子浓度达到10⁸个/mL～10⁹个/mL悬浮液可转入固体培养。

3)固体培养基配制并灭菌

取大米1000g，根据不同品种吸水率不同，加入100ML～150mL水(v/w，比例10％～15％)，搅拌至所有米的表面润湿，采用22cm×50cm两头开口的聚丙烯食用菌栽培袋，每袋装入300g湿米(装量占菌袋体积20％左右)，两头用橡皮筋扎紧，置于灭菌锅中，121℃高压蒸汽灭菌30min。

4)液体种接种至菌袋固体培养

固体培养基冷却至室温后，每个菌袋中加入液体种35mL，在菌袋两头分别套入5cm的出菇圈，菌袋反折，在出菇圈外包裹无菌透气封口膜，并用橡皮筋固定。双手持菌袋两头摇动，使菌液在米表面分布均匀。将菌袋移入温度保持26±1℃的培养箱或培养室内平面摆放，整理菌袋成圆柱形。固体培养3天左右，米表面长满菌体，圆柱形菌袋形成的空间有利于白僵菌生长的水分蒸发，并在菌袋内表面上方集聚。随着白僵菌水分代谢，固体培养基含水量减少，受水分降低的胁迫白僵菌在培养第5天左右迅速产生大量孢子粉。

5)干燥后筛分孢子粉

将长好孢子粉的米培养基倒入铺有滤纸的烘箱网眼托盘中，放入鼓风干燥箱30℃～40℃干燥48h后，用电动震动机过100目筛，分离米基质，获得孢子粉。

实施例2

一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法，包括以下步骤：

1)液体培养基配制并灭菌

液体培养基需要碳源和氮源及少量微量元素。碳水化合物作为其生长能源，可采用含淀粉和糖类等物质的农副产品，有机氮源采用蛋白陈、酵母膏、玉米浆、大豆饼粉等有利于白僵菌生长。本实施例选择CMA培养基，成分为：玉米粉20g，麦麸10g，蛋白胨5g，KH₂PO₄3g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄.7H₂O 1g，水为1000mL。

按配方称好各种原料，一起放入锅中，文火煮沸5min，用开水补足至1000mL，搅拌均匀，然后装入玻璃三角瓶中，液体装量200～250mL，瓶口用无菌透气封口膜和橡皮筋封口，121℃高压蒸汽灭菌30min。

2)白僵菌接种至液体培养基培养

用组织分离法或孢子分离法，从僵蚕中分离、纯化得到的具有一致性、稳定性，保存于玻璃试管或培养皿中的球孢白僵菌纯培养物为母种。在无菌操作条件下，用接种环从母种菌体表面刮取孢子粉，放入冷却至室温的液体种培养瓶中，迅速用无菌透气封口膜和橡皮筋封扎瓶口。液体种在温度26±1℃，转速120～200rpm的旋转式摇床上振荡培养约3天～5天，芽孢子浓度达到10⁸个/mL～10⁹个/mL悬浮液可转入固体培养。

3)固体培养基配制并灭菌

取大米1000g，根据不同品种吸水率不同，加入100ML～150mL水(v/w，比例10％～15％)，搅拌至所有米的表面润湿，采用26cm×55cm厘米两头开口聚丙烯食用菌栽培袋，每袋装入400g湿米(装量占菌袋体积20％左右)，两头用橡皮筋扎紧，置于灭菌锅中，121℃高压蒸汽灭菌30min。

4)液体种接种至菌袋固体培养

固体培养基冷却至室温后，每个菌袋中加入液体种45mL，在菌袋两头分别套入5cm的出菇圈，菌袋反折，在出菇圈外包裹无菌透气封口膜，并用橡皮筋固定。双手持菌袋两头摇动，使菌液在米表面分布均匀。将菌袋移入温度保持26±1℃的培养箱或培养室内平面摆放，整理菌袋成圆柱形。固体培养3天左右，米表面长满菌体，圆柱形菌袋形成的空间有利于白僵菌生长的水分蒸发，并在菌袋内表面上方集聚。随着白僵菌水分代谢，固体培养基含水量减少，受水分降低的胁迫白僵菌在培养第5天左右迅速产生大量孢子粉。

5)干燥后筛分孢子粉

将长好孢子粉的米培养基倒入铺有滤纸的烘箱网眼托盘中，放入鼓风干燥箱30℃～40℃干燥48h后，用电动震动机过100目筛，分离米基质，获得孢子粉。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。