专利摘要
专利摘要
本发明提供一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，包括下述步骤：A、将新鲜的木樨果清洗、将果肉部分研磨至匀浆状，用无菌水稀释后涂布于培养，并用对峙法筛选出对稻瘟病菌有抑制活性的菌，并选取一株抑菌效果好的备用；B、将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株或是其种子液接种于PDB液体发酵培养基中摇床恒温培养，得到发酵液，C、将步骤B得到的发酵液减压浓缩至膏状，然后加入无水硫酸钠去除水，最后用无水甲醇对膏状物进行洗脱得到洗脱液，收集洗脱液得到稻瘟病菌抑制剂。该方法得到稻瘟病菌抑制剂，具有活性强、纯度高的优点，为稻瘟病的防治提供绿色、环保的手段，且本发明得到的稻瘟病菌抑制剂可直接用于实验研究。
权利要求
1.一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
A、抑稻瘟病菌的菌株的筛选：将新鲜的木樨果清洗、消毒后剔除种子，将果肉部分研磨至匀浆状，果实匀浆用无菌水稀释后涂布于PDA培养基上， 28℃恒温培养箱培养1～2天，挑选单菌落用对峙法筛选出对稻瘟病菌有抑制活性的菌，并选取一株抑菌效果好的备用；
B、抑稻瘟病菌的菌株发酵液制备：将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种于PDB液体发酵培养基中在28～30℃，120～160rpm摇床恒温培养36～48h，得到发酵液；或是将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种到PDB种子液培养基培养得到种子液，种子液接种到PDB液体发酵培养基，在28～30℃，120～160rpm摇床恒温培养36～48h，得到发酵液；
C、发酵液制备抑制剂：将步骤B得到的发酵液减压浓缩至膏状，然后加入无水硫酸钠去除水，最后用无水甲醇对膏状物进行洗脱得到洗脱液，收集洗脱液得到稻瘟病菌抑制剂；在步骤C中，所述用无水甲醇对膏状物进行洗脱是加入发酵液体积的 1/50～1/40 的无水甲醇震荡洗脱；所述发酵液减压浓缩条件为42～45℃，25～35mbar；所述无水硫酸钠的加入量为每升发酵液1.5～2.5g无水硫酸钠；每次所述震荡洗脱的时间为8～10min。
2.根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，其特征在于：在步骤A中，所述的清洗、消毒是将木樨果实依次用60％～85％乙醇、无菌水、0.5％～1.5％的次氯酸钠溶液、无菌水处理。
3.根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，其特征在于：在步骤B中，所述种子液接种于PDB液体培养基的接种量为2％～4％。
说明书
技术领域
本发明涉及微生物发酵液活性成分的提取领域，具体涉及一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法。
背景技术
稻瘟病又称稻热病是水稻三大病害之一，水稻植株的地上部分均会感染稻瘟病，根据其感染部位的不同，可将其分为苗瘟、节瘟、叶瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等。
稻瘟病病菌以分生孢子或菌丝体形态在稻草或稻谷上越冬。当气温条件在20℃左右时，开始解除休眠，如果遇到适宜的湿度就可以产生大量的分生孢子。分生孢子主要借由空气、水、昆虫进行传播。当条件适宜时，孢子便于水稻上萌发并侵入水稻细胞，形成病株。借此机会稻瘟病便可快速繁殖，产生病斑，形成新的分生孢子，由病株向周围进行侵染扩散，将稻瘟病蔓延开来。
稻瘟病在所有的水稻生产和种植中，为真菌病里危害面积最广，危害性最大的。在稻瘟病流行的年份，重病区一般减产10~20％，严重区域减产40~50％甚至颗粒无收。从全球范围来计算，因为稻瘟病的存在，每年的粮食损失甚至高达1.57亿吨。
水稻抗性品种的选育和化学农药的施用对稻瘟病的防治仍然具有很重要的作用，同时因为抗稻瘟品种效果提升的速度减缓，以及化学试剂的毒性、病原菌抗药性的问题，这两者在对稻瘟病的防治效果上在不断削弱。生物防治及生物农药的研究和开发在这种背景下变的逐渐重要起来，植物源、微生物源的生物农药具有显著地防治特性，对环境的压力和冲击力同化学防治相比，显得更加的平和，对环境的压力较小能有效减弱稻瘟病菌抗药性对试剂的耐受效果，同时延长产品的使用时间。
我国植物资源丰富，从天然植物中寻找新的低毒、高效的稻瘟病菌抑制剂一直是国内外的研究热点。公开号为CN101805715A的发明申请公开了一种用地衣芽孢杆菌提取的活性成分及其应用，活性成分提取步骤：生产菌株为地衣芽孢杆菌(BacilluslicheniformisN27)，保藏号：CGMCCNo：3585；将B.licheniformisN27用液体发酵，培养基为：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000ml；发酵条件为：温度25～32℃、转速为150～250rpm，摇床培养2～5天；所得发酵液减压浓缩得粗浸膏；粗浸膏依次用硅胶H、C18、SephadexLH～20分离得到活性成分Z。该发明的活性成分是具有能使在常规培养基下培养的真菌高效、快速形成厚垣孢子的代谢物，且用量少，应用于生物农药制备中。
发明内容
本发明提供一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，该方法从木樨果中筛选出具有抑制稻瘟病的菌株，并将菌株的发酵液经浓缩、除水、洗脱处理，得到稻瘟病菌抑制剂，具有活性强、纯度高的优点，为稻瘟病的防治提供绿色、环保的手段，且本发明得到的稻瘟病菌抑制剂可直接用于实验研究。
一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，包括下述步骤：
A、抑稻瘟病菌的菌株的筛选：将新鲜的木樨果清洗、消毒后剔除种子，将果肉部分研磨至匀浆状，果实匀浆用无菌水稀释后涂布于PDA培养基上， 28℃恒温培养箱培养1～2天，挑选单菌落用对峙法筛选出对稻瘟病菌有抑制活性的菌，并选取一株抑菌效果好的备用；
B、抑稻瘟病菌的菌株发酵液制备：将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种于PDB液体发酵培养基中在28～30℃，120～160rpm摇床恒温培养36～48h，得到发酵液；或是将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种到PDB种子液培养基培养得到种子液，种子液接种到PDB液体发酵培养基，在28～30℃，120～160rpm摇床恒温培养36～48h，得到发酵液；
C、发酵液制备抑制剂：将步骤B得到的发酵液减压浓缩至膏状，然后加入无水硫酸钠去除水，最后用无水甲醇对膏状物进行洗脱得到洗脱液，收集洗脱液得到稻瘟病菌抑制剂。
在步骤A中，所述的清洗、消毒是将木樨果实依次用60％～85％乙醇、无菌水、0.5％～1.5％的次氯酸钠溶液、无菌水处理。
在步骤B中，所述种子液接种于PDB液体培养基的接种量为2％～4％。
在步骤C中，所述发酵液减压浓缩时，旋转蒸发仪温度控制为42～45℃，25～35mbar。
在步骤C中，所述用无水甲醇对膏状物进行洗脱是加入发酵液体积的 1/50～1/40的无水甲醇震荡洗脱。
在步骤C中，所述无水硫酸钠的加入量为每升发酵液1.5～2.5g无水硫酸钠。
进一步的，每次所述震荡洗脱的时间为8～10min。
本发明具有以下有益效果：
1、整个工艺过程简单方便，先对木樨果实处理涂板，得到具有抑制稻瘟病菌的菌株，然后将菌株的发酵液浓缩至膏状并加无水硫酸钠除水，再用有机溶剂无水甲醇进行洗脱得到稻瘟病菌抑制剂。按本发明特定的操作步骤及特定的工艺参数从木樨果实中提取的稻瘟病抑制剂，其抑菌活性强、纯度高。实验证明，在浓度为0.00625～0.1 mL/mL时，对稻瘟病菌的抑菌率为37.79％～89.89％。
2、现有技术在制备病菌抑制剂时，是直接发酵液作为抑制剂使用，但是本发明人在长期的研究中发现，如果将木樨果实中筛选出的抑制稻瘟病菌的菌株发酵液直接用于实验研究和稻瘟病的防治，在用于实验研究中，会出现实验结果不准确、的问题，因此本发明将发酵液先浓缩成膏状，然后再加无水硫酸钠、最后再用无水甲醇洗脱得到稻瘟病抑制剂，其抑菌活性强、纯度高，能同时用于实际防治稻瘟病，也能用于实验室研究用，相比常用的活性物质分离纯化方法（色谱柱、高效液相等），本发明的方法操作简单且成本低廉，适合在产业化生产中应用。
附图说明
图1为实施例3稻瘟病菌抑制剂的抑制效果图。
具体实施方式
实施例1
一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，包括下述步骤：
A、抑稻瘟病菌的菌株的筛选：将新鲜的木樨果清洗、消毒后剔除种子，将果肉部分研磨至匀浆状，果实匀浆用无菌水稀释后涂布于PDA培养基上， 28℃恒温培养箱培养1～2天，挑选单菌落用对峙法筛选出对稻瘟病菌有抑制活性的菌，并选取一株抑菌效果好的备用；
B、抑稻瘟病菌的菌株发酵液制备：将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种于PDB液体发酵培养基中在28～30℃，120rpm摇床恒温培养36h，得到发酵液；或是将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种到PDB种子液培养基培养得到种子液，种子液接种到PDB液体发酵培养基，在28～30℃，120rpm摇床恒温培养36h，得到发酵液；
C、发酵液制备抑制剂：将步骤B得到的发酵液减压浓缩至膏状，然后加入无水硫酸钠去除水，最后用无水甲醇对膏状物进行洗脱得到洗脱液，收集洗脱液得到稻瘟病菌抑制剂。
在步骤A中，所述的清洗、消毒是将木樨果实依次用60％乙醇、无菌水、0.5％的次氯酸钠溶液、无菌水处理。
在步骤B中，所述种子液接种于PDB液体培养基的接种量为2％。
在步骤C中，所述发酵液减压浓缩时，旋转蒸发仪温度控制为42℃，25mbar。
在步骤C中，所述用无水甲醇对膏状物进行洗脱是加入发酵液体积的 1/50的无水甲醇震荡洗脱。
在步骤C中，所述无水硫酸钠的加入量为每升发酵液1.5g无水硫酸钠。
进一步的，每次所述震荡洗脱的时间为8min。
实施例2
一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，包括下述步骤：
A、抑稻瘟病菌的菌株的筛选：将新鲜的木樨果清洗、消毒后剔除种子，将果肉部分研磨至匀浆状，果实匀浆用无菌水稀释后涂布于PDA培养基上， 28℃恒温培养箱培养1～2天，挑选单菌落用对峙法筛选出对稻瘟病菌有抑制活性的菌，并选取一株抑菌效果好的备用；
B、抑稻瘟病菌的菌株发酵液制备：将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种于PDB液体发酵培养基中在28～30℃，140rpm摇床恒温培养42h，得到发酵液；或是将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种到PDB种子液培养基培养得到种子液，种子液接种到PDB液体发酵培养基，在28～30℃，140rpm摇床恒温培养48h，得到发酵液；
C、发酵液制备抑制剂：将步骤B得到的发酵液减压浓缩至膏状，然后加入无水硫酸钠去除水，最后用无水甲醇对膏状物进行洗脱得到洗脱液，收集洗脱液得到稻瘟病菌抑制剂。
在步骤A中，所述的清洗、消毒是将木樨果实依次用85％乙醇、无菌水、0.5％～1.5％的次氯酸钠溶液、无菌水处理。
在步骤B中，所述种子液接种于PDB液体培养基的接种量为4％。
在步骤C中，所述发酵液减压浓缩时，旋转蒸发仪温度控制为45℃， 35mbar。
在步骤C中，所述用无水甲醇对膏状物进行洗脱是加入发酵液体积的 1/40 的无水甲醇震荡洗脱。洗脱时，采用多次少量的加无水甲醇洗脱。每次洗脱用胶头滴管将洗脱液吸出，存储。
在步骤C中，所述无水硫酸钠的加入量为每升发酵液2.5g无水硫酸钠。
进一步的，每次所述震荡洗脱的时间为10min。
实施例3
一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法，包括下述步骤：
A、抑稻瘟病菌的菌株的筛选：将新鲜的木樨果清洗、消毒后剔除种子，将果肉部分研磨至匀浆状，果实匀浆用无菌水稀释后涂布于PDA培养基上， 28℃恒温培养箱培养1～2天，挑选单菌落用对峙法筛选出对稻瘟病菌有抑制活性的菌，并选取一株抑菌效果好的备用；
B、抑稻瘟病菌的菌株发酵液制备：将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种于PDB液体发酵培养基中在28～30℃， 160rpm摇床恒温培养48h，得到发酵液；或是将步骤A中选取的抑菌效果好的菌株接种到PDB种子液培养基培养得到种子液，种子液接种到PDB液体发酵培养基，在28～30℃， 160rpm摇床恒温培养48h，得到发酵液；
C、发酵液制备抑制剂：将步骤B得到的发酵液减压浓缩至膏状，然后加入无水硫酸钠去除水，最后用无水甲醇对膏状物进行洗脱得到洗脱液，收集洗脱液得到稻瘟病菌抑制剂。
在步骤A中，所述的清洗、消毒是将木樨果实依次用80％乙醇、无菌水、1.0％的次氯酸钠溶液、无菌水处理。
在步骤B中，所述种子液接种于PDB液体培养基的接种量为3％。
在步骤C中，所述发酵液减压浓缩时，旋转蒸发仪温度控制为40℃，30mbar。
在步骤C中，所述用无水甲醇对膏状物进行洗脱是加入发酵液体积的 1/40 的无水甲醇震荡洗脱。
在步骤C中，所述无水硫酸钠的加入量为每升发酵液2g无水硫酸钠。
进一步的，每次所述震荡洗脱的时间为9min。
抑菌实验：
（1）培养基制备：取去皮马铃薯400g，切成1cm
表1
（2）灭菌结束后将培养基稍微晾凉，分A、B、C三组，每组6份培养基，A组的6份培养基中分别加入实施例1制备得到的稻瘟病菌抑制剂0mL、0.375mL、0.75mL、1.5mL、3mL和6mL，B组的6份培养基中分别加入实施例2制备得到的稻瘟病菌抑制剂0mL、0.375mL、0.75mL、1.5mL、3mL和6mL，C组的6份培养基中分别加入实施例3制备得到的稻瘟病菌抑制剂0mL、0.375mL、0.75mL、1.5mL、3mL和6mL，充分摇匀后倒板，每个培养皿20mL左右，重复倒3个平板。
（3）、待培养基凝固吹干后，在每个培养皿中央接种准备好的长势相同的稻瘟菌饼，于28℃恒温培养5-7天。观察并记录稻瘟菌饼的生长情况。不同浓度的稻瘟病菌抑制剂抑制稻瘟菌饼生长的效果用抑制率表示，计算公式：抑制率（％）＝（1－处理组菌饼生长直径/对照组菌饼生长直径）*100％。并将实施例3稻瘟菌饼的生长情况及抑制率记录在下表2中，并根据得到的数据绘制的抑制效果图。
表2 实施例3稻瘟菌饼的生长情况及抑制率：浓度mL/mL，直径（mm）
由抑制率及抑制效果图可以知，在浓度为0.00625～0.1 mL/mL时，对稻瘟病菌的抑菌率为37.79％～89.89％。
一种稻瘟病菌抑制剂的制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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