IPC分类号 : C12P23/00I,C12N1/12I,C12R1/89N
专利摘要
专利摘要
本发明公开一种利用DNA甲基化转移酶抑制剂提高莱茵衣藻生物量和类胡萝卜素含量的方法，属于食品科学技术领域。该方法是将莱茵衣藻细胞在含有DNA甲基化转移酶抑制剂的液体培养基中培养一定时间后，每天监测生物量，收集藻细胞，提取色素。本发明的方法简单易行，效果好，操作方便，加入DNA甲基化转移酶抑制剂后能快速、有效提高莱茵衣藻的生物量和类胡萝卜素含量。本发明中DNA甲基化转移酶抑制剂的用量极少，效果显著，操作方便。
权利要求
1.DNA甲基化转移酶抑制剂在提高莱茵衣藻生物量和类胡萝卜素含量中的应用，其特征在于：
所述的DNA甲基化转移酶抑制剂为5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的DNA甲基化转移酶抑制剂的终浓度为100～800μM。
3.一种利用DNA甲基化转移酶抑制剂提高莱茵衣藻生物量和类胡萝卜素含量的方法，其特征在于包括如下步骤：
将莱茵衣藻细胞在含有DNA甲基化转移酶抑制剂的液体培养基中培养一定时间后，每天监测生物量，收集藻细胞，提取色素；
所述的DNA甲基化转移酶抑制剂为5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述的DNA甲基化转移酶抑制剂的终浓度为100～800μM。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述的培养的时间为4～20天及以上；
所述的培养的条件为在光照度为500～10000Lx，光暗周期为6～18h：6～18h，温度为15～30℃，以10～200r/min的转速震荡培养。
6.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于：
所述的培养的条件为在光照度为8000Lx，光暗周期为14h：10h，温度为25℃，以50r/min的转速震荡培养。
7.根据权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于：
所述的液体培养基为TAP培养基，其成分为：Tris 2.42g/L，TAP-salts25 mL/L，磷酸盐溶液1mL/L，微量元素液1mL/L，乙酸1mL/L，调pH至6.95～7.0；
所述的TAP-salts：NH
所述的磷酸盐溶液：K
所述的微量元素液：Na
8.根据权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于：
所述生物量的测定方法为：采用紫外分光光度计测定藻液在750nm波长下的吸光度值，吸光度值越高，则生物量越高；或者，通过测定藻细胞干重来确定生物量的积累情况，离心收集藻细胞后，干燥至恒重后，直接称重。
9.根据权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于：
所述提取色素的方法为：将培养完成的藻液进行离心，弃上清液，将藻泥与有机溶剂混合，浸提，离心，将上层液进行滤膜过滤；
所述有机溶剂为丙酮、乙醇、甲醇或乙腈；所述浸提的时间为15～30min，所述滤膜为0.45μm滤膜；
测定色素含量的方法为：用分光光度计或酶标仪分别测定665.2nm、652.4nm和470nm波长处的吸光度值，再用下列公式进行计算：
叶绿素a(μg/mL)＝16.72·A
叶绿素b(μg/mL)＝34.09·A
总类胡萝卜素(μg/mL)＝(1000·A
其中，Chla表示叶绿素a，Chlb表示叶绿素b。
说明书
技术领域
本发明属于食品科学技术领域，具体涉及一种利用DNA甲基化转移酶抑制剂提高莱茵衣藻生物量和类胡萝卜素含量的方法。
背景技术
莱茵衣藻培养条件简单，生长周期较短，并已完成全基因组测序，遗传背景清晰，易于遗传转化，可以对真核蛋白进行准确翻译后加工修饰和折叠；属于安全级(generallyrecognized as safe，GRAS)微生物，表达产物不含毒素物质，便于纯化，以降低蛋白生产成本；此外，培养莱茵衣藻不需要占用宝贵的耕地资源，不用消耗大量的肥料及淡水资源，已被认为是极具发展潜力的生物反应器，目前，利用莱茵衣藻作为生物反应器已成功表达了多种重组蛋白，如重组蛋白疫苗、单克隆抗体、蛋白药物和工业蛋白酶等，部分产品已经实现了商品化。莱茵衣藻能利用太阳能和水制氢，大大降低生产成本，被认为是非常有开发潜力的生物制氢的物种；还能开发利用莱茵衣藻生产类胡萝卜素、油脂和长链不饱和脂肪酸等高附加值产品。
虽然莱茵衣藻作为生物反应器已经得到了重视，并有一定的应用，但有些方面还有待于进一步开发改进，其中一个方面是单纯光合作用自养的莱茵衣藻生物量较低，从而影响重组蛋白达产量，或降低最终目的产物(包括类胡萝卜素在内的高附加值产品)的产量。高密度异养发酵或混养是提高生物量的一个手段，此外还可以通过化学物质的诱导作用来提高生物量。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用DNA甲基化转移酶抑制剂提高莱茵衣藻生物量和类胡萝卜素含量的方法。该方法能够提高莱茵衣藻中类胡萝卜素、油脂、重组蛋白、氢气等高附加值物质的产量，是提高莱茵衣藻的生物量是一个有效的途径。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种DNA甲基化转移酶抑制剂在提高莱茵衣藻生物量和类胡萝卜素含量中的应用。
一种利用DNA甲基化转移酶抑制剂提高莱茵衣藻生物量和类胡萝卜素含量的方法，包括如下步骤：将莱茵衣藻细胞在含有DNA甲基化转移酶抑制剂的液体培养基中培养一定时间后，每天监测生物量，收集藻细胞，提取色素。
所述的DNA甲基化转移酶抑制剂包括5-氮杂胞苷(5-azacytidine，简称 5AzaC)和5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycitydine，简称5AzadC)中的至少一种。
所述的DNA甲基化转移酶抑制剂的终浓度为10～1000μM。
所述的培养的时间为4～20天及以上。
所述的培养的条件为在光照度为500～10000Lx，光暗周期为6～18h：6～ 18h，温度为15～30℃，以10～200r/min的转速震荡培养，优选为在光照度为 8000Lx，光暗周期为14h：10h，温度为25℃，以50r/min的转速震荡培养。
所述的莱茵衣藻液体培养基优选为TAP培养基，其成分为：Tris 2.42g/L， TAP-salts(含NH4Cl 15g/L，MgSO4·7H2O 4g/L，CaCl2·2H2O 2g/L)25mL/L，磷酸盐溶液(含K2HPO4 28.2g/100mL，KH2PO4 14.4g/100mL)1mL/L，微量元素液(含Na2EDTA·2H2O 5g/100mL，ZnSO4·7H2O 2.2g/100mL，H3BO3 1.14g/100mL， MnCl2·4H2O 0.5g/100mL，FeSO4·7H2O 0.5g/100mL，CoCl2·6H2O 0.16g/100mL， CuSO4·5H2O 0.16g/100mL，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.11g/100mL)1mL/L，乙酸1mL/L，调pH至6.95～7.0。
所述方法，具体包括如下步骤：
将莱茵衣藻细胞接种于液体培养基中，加入适量的DNA甲基化转移酶抑制剂，培养4～20天及以上，每天监测生物量，收集藻细胞，提取色素。
所述的培养的条件为在光照度为500～10000Lx，光暗周期为6～18h：6～ 18h，温度为15～30℃，以10～200r/min的转速震荡培养，优选为在光照度为 8000Lx，光暗周期为14h：10h，温度为25℃，以50r/min的转速震荡培养。
所述生物量的测定方法为：采用紫外分光光度计测定藻液在750nm波长下的吸光度值，吸光度值越高，则生物量越高。此外，还可以通过测定藻细胞干重来确定生物量的积累情况，离心收集藻细胞后，于55℃烘箱干燥48小时至恒重后，直接称重。
所述提取色素的方法为：将培养完成的藻液进行离心，弃上清液，将藻泥与有机溶剂混合，浸提，离心，将上层液进行滤膜过滤。
所述有机溶剂为丙酮、乙醇、甲醇或乙腈等，优选为丙酮；所述浸提的时间为15～30min，所述滤膜为0.45μm滤膜。
测定色素含量的方法为：采用丙酮为溶剂，用分光光度计或酶标仪分别测定665.2nm、652.4nm和470nm波长处的吸光度值，再用下列公式进行计算：
叶绿素a(μg/mL)＝16.72·A665.2-9.16·A652.4
叶绿素b(μg/mL)＝34.09·A652.4-15.28·A665.2
总类胡萝卜素(μg/mL)＝(1000·A470-1.63·Chl a-104.96·Chl b)/221
其中，Chl a表示叶绿素a，Chl b表示叶绿素b。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的方法简单易行，效果好，操作方便，加入DNA甲基化转移酶抑制剂后能快速、有效提高莱茵衣藻的生物量和类胡萝卜素含量，可能是因为DNA 甲基化转移酶抑制剂能降低DNA的甲基化程度，相当于去甲基化作用，可能使本来沉默或者表达量不高的基因重新激活，并且这些基因的表达有利于莱茵衣藻细胞的生长，有利于色素积累。本发明中DNA甲基化转移酶抑制剂的用量极少，效果显著，操作方便。而且许多外源基因导入衣藻基因组后会出现基因沉默问题，其中一个原因是可能发生了甲基化修饰，而DNA甲基化转移酶抑制剂能在一定程度上去甲基化，可能会激活外源基因的表达。
附图说明
图1是5AzaC处理莱茵衣藻后的生长情况。
图2是5AzaC处理莱茵衣藻的生物量和类胡萝卜素积累情况；其中，A，生物量(OD750作为衡量标准)；B，类胡萝卜素。
图3是5AzadC处理莱茵衣藻的生物量和类胡萝卜素积累情况；其中，A，生物量(OD750作为衡量标准)；B，类胡萝卜素。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
所述生物量的测定方法为：采用紫外分光光度计测定藻液在750nm波长下的吸光度值，吸光度值越高，则生物量越高。此外，还可以通过测定藻细胞干重来确定生物量的积累情况，离心收集100mL藻细胞后，于55℃烘箱干燥48 小时至恒重后，直接称重。
所述提取色素的方法为：将培养完成的藻液进行离心，弃上清液，将藻泥与有机溶剂混合，浸提，离心，将上层液进行滤膜过滤。
所述有机溶剂为丙酮、乙醇、甲醇或乙腈等，优选为丙酮；所述浸提的时间为15～30min，所述滤膜为0.45μm滤膜。
测定色素含量的方法为：采用丙酮为溶剂，用分光光度计或酶标仪分别测定665.2nm、652.4nm和470nm波长处的吸光度值，再用下列公式进行计算：
叶绿素a(μg/mL)＝16.72·A665.2-9.16·A652.4
叶绿素b(μg/mL)＝34.09·A652.4-15.28·A665.2
总类胡萝卜素(μg/mL)＝(1000·A470-1.63·Chl a-104.96·Chl b)/221
其中，Chl a表示叶绿素a，Chl b表示叶绿素b。
实施例中所用的莱茵衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti) FACHB-2220，购自中国科学院淡水藻种库。
实施例1
(1)培养莱茵衣藻
首先配制莱茵衣藻TAP液体培养基，其成分为：Tris 2.42g/L，TAP-salts(含NH4Cl 15g/L，MgSO4·7H2O 4g/L，CaCl2·2H2O 2g/L)25mL/L，磷酸盐溶液(含 K2HPO428.2g/100mL，KH2PO4 14.4g/100mL)1mL/L，微量元素液(含 Na2EDTA·2H2O 5g/100mL，ZnSO4·7H2O 2.2g/100mL，H3BO3 1.14g/100mL， MnCl2·4H2O 0.5g/100mL，FeSO4·7H2O0.5g/100mL，CoCl2·6H2O 0.16g/100mL， CuSO4·5H2O 0.16g/100mL，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.11g/100mL)1mL/L，乙酸1mL/L，调pH至6.95～7.0。
配制40mM的5-氮杂胞苷(5AzaC)母液：称取0.09768g 5AzaC粉末，于 10mL去离子水溶解即可。
然后将莱茵衣藻细胞接种于100mL上述液体培养基中，加入5AzaC至终浓度分别为0(对照)、100μM和800μM(即分别加入250μL和2000μL的40 mM5AzaC母液)，在光照度为8000Lx，光暗周期为14h：10h(光照14h，无光10h)(光暗交替培养)，温度为25℃，转速为50r/min，培养5～9天。
(2)测定生物量
直接观察培养5～9天的藻液，发现5AzaC处理5天和9天后藻液颜色都比对照组深，说明5AzaC处理后能提高藻细胞密度(图1)。
分别取3～4mL培养5至7天的藻液，用紫外分光光度计测定藻液在750nm 波长下的吸光度值，发现处理组的生物量(图2A)均高于未处理的对照组。
(3)提取和测定色素
分别取2mL藻液在8000r/min转速下离心5min，弃上清液，向藻泥中加入2mL丙酮，涡旋分散，浸提20min后，10000r/min转速下离心15min，取上层丙酮相转移到新的离心管中，用0.45μm滤膜过滤。
用酶标仪分别测定上述丙酮相溶液在665.2nm、652.4nm和470nm波长处的吸光度值，再用下列公式进行计算：
叶绿素a(μg/mL)＝16.72·A665.2-9.16·A652.4
叶绿素b(μg/mL)＝34.09·A652.4-15.28·A665.2
总类胡萝卜素(μg/mL)＝(1000·A470-1.63·Chl a-104.96·Chl b)/221
按上述公式计算总类胡萝卜素，发现添加100μM和800μM5AzaC处理莱茵衣藻培养5、6、7天后，类胡萝卜素含量(图2B)均明显高于未处理的对照组，其中100μM 5AzaC处理组的类胡萝卜素含量比对照组高15.3％～25.2％； 800μM 5AzaC处理组的类胡萝卜素含量比对照组高41.9％～53.3％，800μM 5AzaC的处理效果最好。
实施例2
(1)培养莱茵衣藻
首先配制莱茵衣藻TAP液体培养基，同实施例1。
配制40mM的5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5AzadC)母液：称取0.09128g 5AzadC 粉末，于10mL去离子水溶解即可。
然后将莱茵衣藻细胞接种于100mL上述液体培养基中，加入5AzadC至终浓度分别为0(对照)、100μM和800μM(即分别加入250μL和2000μL的40mM 5AzadC母液)，在光照度为8000Lx，光暗周期为14h：10h(光照14h，无光 10h)(光暗交替培养)，温度为25℃，转速为50r/min，培养5～7天。
(2)测定生物量
分别取3～4mL培养5至7天的藻液，用紫外分光光度计测定藻液在750nm 波长下的吸光度值(OD7s0)，发现处理组的生物量(图3A)均高于未处理的对照组。
(3)提取和测定色素
从莱茵衣藻中提取和测定色素的方法同实施例1，经计算，发现添加100μM 和800μM 5AzadC处理莱茵衣藻培养5、6、7天后，类胡萝卜素含量(图3B) 均高于未处理的对照组，其中100μM 5AzadC处理组的类胡萝卜素含量比对照组高11.2％～18.9％；800μM 5AzadC处理组的类胡萝卜素含量比对照组高 4.4％～10.0％，100μM 5AzadC的处理效果比800μM5AzadC的效果略好。结合实施例1和实施例2来看，5AzaC的处理效果比5AzadC的好。
实施例3
(1)培养莱茵衣藻
同实施例1，但培养时间为14天。
(2)测定生物量
离心收集90mL藻细胞后，于55℃烘箱干燥48小时至恒重后，直接称重，发现100μM和800μM 5AzaC处理组的藻细胞干重分别高于未处理的对照组的 15.2％和17.6％。
(3)提取和测定色素
从莱茵衣藻中提取和测定色素的方法同实施例1，经计算，发现添加100μM 和800μM 5AzaC处理莱茵衣藻培养14天后，类胡萝卜素含量分别高于对照组 11.4％和10.5％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
一种利用DNA甲基化转移酶抑制剂提高莱茵衣藻生物量和类胡萝卜素含量的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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