专利摘要

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种通过强化甾药生产菌株胞内NADH脱氢实现增强甾药前体生产的方法。本发明引入在甾药生产菌株属微生物体内存在的不具有质子泵功能的NADH脱氢酶‑NDH2，构建NDH2加强的甾药前体生产菌株，以加强甾药前体生产菌株内NADH的脱氢，解决甾药前体微生物转化生产过程中NADH过量积累而导致的发酵周期长、生产效率低的问题，有助于降低甾药前体生产过程中的能耗以节约生产成本。该方法可有效用于其他工业生产菌株胞内NADH脱氢的加强，具有广泛的应用价值，为甾药前体生产成本的降低提供了新方法。

权利要求

1.一种生产9α-羟基雄烯二酮的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌通过在具有甾药前体生产能力的宿主细胞中过表达NADH脱氢酶-NDH2获得；

所述宿主细胞为偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）ARL-91，保藏编号CGMCCNO.16771；

所述NADH脱氢酶-NDH2的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO: 2所示。

2.如权利要求1所述的一种基因工程菌株，其特征在于，所述NADH脱氢酶-NDH2的编码基因为序列表SEQ ID NO: l所示。

3.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌的表达载体为pMV261穿梭表达载体。

4.权利要求1-3任意一项所述基因工程菌株在生产9α-羟基雄烯二酮中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，具体如下：

将基因工程菌种子培养液以2-10%的接种量转接于发酵培养基中，在25-35 ℃，50-200rpm条件下培养24-168 h。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成：K2HPO4 0.1-3 g/L，MgSO40.1-3 g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2 g/L，柠檬酸1-5 g/L，磷酸氢二铵1-10 g/L，葡萄糖5-50g/L，植物甾醇1-50 g/L，羟丙基β-环糊精10-30 mM，其余为水，pH 6.0-7.5。

说明书

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种通过强化甾药生产菌株胞内NADH脱氢实现增强甾药前体生产的方法。

背景技术：

甾体药物是制药工业中主要销售的产品并在临床上被广泛用。其中，4-雄甾烯-3,17-二酮(AD)，1,4-雄甾烯-3,17-二酮(ADD)和9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-羟基雄烯二酮)是合成甾药的重要前体。AD和ADD是合成类固醇药物如孕激素，避孕药和雌激素的主要前体。9α-羟基雄烯二酮是生产9α位上有卤素的甾体药物的重要前体，利用9α-羟基雄烯二酮可以合成氢化可的松、17α-羟基黄体酮、依普利酮、地塞米松、倍他米松、可的松、醋酸氟轻松、氟羟泼尼松龙等多种重要的甾体药物。细菌、放线菌、真菌都能够用来对甾体底物进行9α-羟化，其中以含分枝菌酸的分枝杆菌属为主。

作为化学合成的替代，反应条件温和、环境友好的微生物转化法已成为制药工业中生产甾体药物中间体的主要方法。另一方面，天然甾醇是微生物转化法可用的低成本原料。一般来说，植物甾醇的代谢途径在这些微生物中高度保守，主要涉及植物甾醇吸收，脂肪族侧链的降解和9α位的羟基化三个过程。针对植物甾醇母核氧化或侧链降解代谢途径中关键酶的操作可以增强甾药前体的生产。研究结果显示敲除某基因以后，会在不同程度上降低植物甾醇的摩尔转化率和产率，即造成菌体整体生产强度的下降。因此还需要从菌体整体代谢调控方面深入探索、系统研究，以寻求提高雄烯二酮生产效率的方法。植物甾醇代谢途径中许多关键酶属于辅酶依赖型酶，辅因子依赖的代谢途径不仅受代谢途径中酶的控制，而且还受辅因子浓度及辅因子氧化还原态比例的控制。Su等(Su LQ,Shen YB,Zhang WK,Gao T,Shang ZH,Wang M(2017)Cofactor engineering to regulate NAD⁺/NADH ratio with its application to phytosterols biotransformation.Microb Cell Fact 16(1):182-192)的研究表明植物甾醇在转化过程中会抑制复合体I多亚基的转录表达，导致菌体内部NADH的过量积累。该研究还表明通过过表达NADH氧化酶促进胞内NAD⁺的再生，来促进AD(D)生产效率，但NADH氧化酶过表达后会造成ATP含量降低，导致菌体的生长受到明显的抑制，且NADH氧化酶表达活性越高，菌体受抑制程度越明显，使AD(D)的生产周期延长。

因此，无论是甾药前体生产的原始菌株还是工程菌株均存在胞内NADH过量积累的问题。同时转化周期长(≥120小时)，且在转化中后期(72小时后)菌株的生产力明显下降，并伴随转化效率的急剧降低也是甾药前体生产菌株的共性问题。这也是造成甾药前体生产成本高昂的主要原因之一。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明引入在甾药生产菌株属微生物体内存在的另外一种不具有质子泵功能的NADH脱氢酶-NDH2，NDH2是50-60KD的单亚基酶，其具有NADH脱氢的功能。本发明将获取并利用NDH2，构建NDH2加强的甾药前体生产菌株，以加强甾药前体生产菌株内NADH的脱氢，解决甾药前体微生物转化生产过程中NADH过量积累而导致的发酵周期长、生产效率低、菌体活性低的问题，有助于降低甾药前体生产过程中的能耗以节约生产成本。该方法可有效用于其他工业生产菌株胞内NADH脱氢的加强，具有广泛的应用价值，为甾药前体生产成本的降低提供了新方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一，是一株过表达NADH脱氢酶-NDH2的基因工程菌，所述基因工程菌的宿主为具有甾药前体生产能力的细菌或真菌；

所述的甾药前体，包括但并不限于雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，AD)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，9α-OH-AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(Androst-1,4-diene-3,17-dione，ADD)、A环降解物等；

所述的NDH2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其无义突变序列；

所述的NDH2的编码基因与SEQ ID NO:l所示序列的核苷酸序列具有60％以上的一致性；

进一步地，所述的NDH2的编码基因为SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:l所示NDH2基因，来源于快速生长型偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ARL-91,该菌株已于2018年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.16771；

较佳的，所述的基因工程菌是利用基因工程表达载体，进行甾药前体生产菌株自身NDH2的过表达或在非自身菌株中的异源表达而构建的甾药前体生产基因工程菌，所述的基因工程表达载体整合有NDH2基因；

较佳的，所述的基因工程表达载体是细菌表达载体、酵母表达载体或哺乳动物表达载体；

优选的，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体或分枝杆菌表达载体；

更优选地，所述的大肠杆菌表达载体是PET表达载体，所述的枯草芽孢杆菌表达载体是质粒pWB980，所述分枝杆菌表达载体是pMV306或PFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2或pMV261分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体；

优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21菌株、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),分枝杆菌(Mycobacterium sp.)NRRLB-3683、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatism)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、微黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、草分枝杆菌(Mycobacterium Phlei)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)等；

更优选地，所述宿主细胞为偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ARL-91。

本发明还提供上述基因工程菌在生产甾药前体中的应用，特别是在生产9α-羟基雄烯二酮中的应用；

在生产9α-羟基雄烯二酮中的应用具体如下：

将基因工程菌种子培养液以2-10％的接种量转接于发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养24-168h；9α-羟基雄烯二酮产量可以达到0.3-30g/L，摩尔转化率可以达到50％-99％；

发酵培养基组成：K₂HPO₄ 0.1-3g/L，MgSO₄ 0.1-3g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L，柠檬酸1-5g/L，磷酸氢二铵1-10g/L，葡萄糖5-50g/L，植物甾醇1-50g/L，羟丙基β-环糊精10-30mM，其余为水，pH 6.0-7.5。

有益效果：

本发明通过过表达Ⅱ型NADH脱氢酶-NDH2,使分枝杆菌胞内NADH的含量最高减少了29.5％，促进了胞内NAD⁺的再生，使胞内NAD⁺/NADH比例提高了68.8％。该酶的过表达增加了胞内NADH和NAD⁺(辅酶Ⅰ)的总量，在72小时有最大的提高值66.6％。同时，电子传递链的活力提升了2.24倍，胞内ATP的含量提高了2.52倍。在提高9α-羟基雄烯二酮方面，24-96小时的各取样点摩尔转化率均提高1.2倍以上，最高1.69倍。9α-羟基雄烯二酮最高化率为93.42％，比原始菌株提高了12％。

附图说明：

图1为NDH2基因的扩增产物核酸电泳图

其中泳道M是DNA标准marker，泳道1-2是NDH2基因扩增条带；

图2为pMV261-ndh载体构建过程的酶切验证图谱

其中泳道M是DNA标准marker，泳道1是pMV261-ndh经BamHⅠ单酶切结果，泳道2是pMV261-ndh经BamHⅠ、HindⅢ双酶切结果；

图3为原始菌株ARL-91及重组菌株NdhF转化过程中电子传递链活力的变过程；

图4为原始菌株ARL-91及重组菌株NdhF转化过程中NADH(图a)，NAD⁺含量(图b)以及NADH/NAD⁺比率(图c)随时间的变过程；

图5为原始菌株ARL-91及重组菌株NdhF转化过程中胞内ATP随时间的变过程；

图6为原始菌株ARL-91及重组菌株NdhF生成9α-羟基雄烯二酮过程生物量的变化；

图7为原始菌株ARL-91及重组菌株NdhF生成9α-羟基雄烯二酮过程图。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1 NDH2基因(ndh)的获得

将保藏编号是CGMCC NO.16771的偶发分枝杆菌株ARL-91接种于含有植物甾醇的基础培养基中(葡萄糖10g/L,MgSO₄ 0.5g/L,K₂HPO₄ 0.5g/L,(NH₄)₂HPO₄ 3.5g/L,柠檬酸2g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L，植物甾醇5g/L)培养60小时以获得样品用于转录组测序。将获得的基因的转录本序列比对到蛋白数据库：nr和KEGG(evalue<0.00001)，得到跟给定基因的转录本具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该基因的转录本对应的蛋白的功能注释信息。从注释信息中搜索NADH dehydrogenase获得注释为NADH脱氢酶的多条基因，确定与Mycobacterium neoaurum VKM Ac-1815D同源性最高，将其确定为NDH2编码基因。设计引物ndh-F和ndh-R，其序列分别如下：

ndh-F：5’-CGCGGATCCAATGAGCCATCCCGGAGCT-3’(SEQ ID NO:3)

ndh-R：5'-CCCAAGCTTTCAGCTGGCGGCTTTCTC-3'(SEQ ID NO:4)

以ARL-91菌株总DAN为模板，以引物ndh-F和ndh-R为引物对，进行PCR扩增以获得ARL-91的NDH2基因(SEQ ID NO.1所示)。扩增产物经核酸电泳检测(图1)。

实施例2构建用于NDH2编码基因自身过表达基因工程表达载体

构建用于NDH2基因自身过表达基因工程表达载体，其过程包括：

将实施例1中获得的NDH2基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后胶回收，与经同样酶切的pMV261质粒在T4DNA连接酶的作用下16℃连接过夜，连接产物经化学转化的方法转入Escherichia coli DH5α，经卡那霉素筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒经酶切验证(图2)和测序后得到构建成功的用于NDH2基因自身过表达基因工程表达载体pMV261-ndh。

实施例3构建NDH2基因加强菌株NdhF

分枝杆菌ARL-91感受态细胞制备：将ARL-91菌株接种到LB培养基中，30℃培养至0D₆₀₀为1.0左右，按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分别用1倍、3/4倍、1/2倍和1/4倍发酵液体积的10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1/25倍的10％甘油悬浮菌体，并分装保存；

电转化：取10μL实施例2获得的pMV261-ndh基因工程表达载体，加入到100μL感受态菌体中放置30分钟后转入电转杯进行点击。电击条件2kV/cm，25μF,720Ω条件下电转3-6ms后冰上放置5min后转入新灭菌1.5mL离心并加入500μL新鲜灭菌LB培养基，30℃200rpm进行复苏。

重组子筛选与验证：将复苏后的培养物，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)LB培养基平板上，30℃静置培养4-7d，挑取单菌落至LB培养基培养2-3d后，提取质粒进行双酶切及测序验证。验证正确的阳性转化子命名为重组菌NdhF。

发明人通过实验验证现有技术中来源于寄生性原虫顶复门原虫的NDH2编码基因无法像重组菌NdhF一样在分支杆菌中成功表达并产生有益效果，相反额外的蛋白表达还对菌体的正常生长和生产产生了负面影响。

实施例4 ARL-91和NdhF菌株用于9α-羟基雄烯二酮生产

1.菌株活化及种子制备

将重组菌NdhF及原始菌ARL-91分别转接于新鲜LB培养基上，30℃培养2-4d，用20mL0.5％的Tween 80无菌水溶液洗菌，吸取lmL洗脱液加入到50mL种子培养基中，在30℃，200rpm条件下摇床培养36h得种子液；

种子培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 1g/L，其余为水，pH 7.2。

2.9α-羟基雄烯二酮生产过程

将步骤1中获得的种子培养液分别以7％的接种量转接于装有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，150rpm条件下摇床培养144h；

发酵培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇5g/L，其余为水，pH 7.2。

实施例5 ARL-91和NdhF菌株9α-羟基雄烯二酮生产过程中电子传递链活力检测

1.电子传递链活力检测

按照实施例4的方法利用ARL-91和NdhF菌株进行9α-羟基雄烯二酮的生产，在生产过程中每隔24h，无菌条件下取样1mL进行菌株电子传递链活力检测。电子传递链活力的测定，在30℃条件下建立250μL的反应体系，其包括：

①细胞破碎粗酶液50μL；

②100mM pH 7.5Tris-HCl缓冲液60μL；

③1mM NADH工作液体15μL；

④0.24mM NADPH 15μL；

⑤0.133M丁二酸钠50μL；

⑥1％曲拉通30μL；

⑦4mM碘硝基氯化四氮唑蓝(INT)30μL；

测定490nm处吸光度，由如下公式进行计算：

其中 为菌株电子传递链活力(μL·O₂·h^-1·g^-1蛋白)，系数60可将反应时间分钟换算成小时，ΔA ₄₉₀为反应时间内的吸光度变化值，V总为反应体系总体积(μL)，1.42为INT接受O₂电子的比例，Δt为反应时间(min)，V酶为细胞破碎粗酶液加入量(μL)，H液为反应体系的光径。

2.结果比较

对重组菌NdhF及原始菌ARL-91在发酵过程中电子传递链活性的检测结果如图3所示。在发酵24小时后重组菌NdhF的电子传递链活力始终比原始菌ARL-91高，在96小时NdhF的电子传递链活力达到5.66μL·O₂·h^-1·g^-1蛋白是原始菌ARL-91(2.53μL·O₂·h^-1·g^-1)的2.24倍。此结果证实NDH2基因的加强能够有效增强菌株电子传递链活力。

实施例6 ARL-91和NdhF菌株9α-羟基雄烯二酮生产过程中NADH、NAD⁺含量检测1.NADH、NAD⁺含量检测

按照实施例4的方法利用ARL-91和NdhF菌株进行9α-羟基雄烯二酮的生产，在生产过程中从48小时到120小时每隔24h，无菌条件下取样1mL进行菌株NADH、NAD⁺含量检测。NADH、NAD⁺含量检测：经酸或碱处理后，细胞中只剩下一种形式的辅酶I(NADH被酸破坏，NAD⁺被碱破坏)进入循环反应，循环反应中生成的甲肷生成率与辅酶I的含量成正比。甲肷在570nm处有最高吸收峰，因此可用分光光度法测定吸光值，根据标准曲线来定量细胞中NADH及NAD⁺含量。

2.结果比较

对重组菌NdhF及原始菌ARL-91在发酵过程中NADH、NAD⁺含量的检测结果如图4所示。图4a为重组菌NdhF及原始菌ARL-91在发酵过程中NADH含量的变化趋势，结果显示NdhF菌株中NADH含量始终低于ARL-91。在48-120小时每个取样点NADH分别减少了15.1％、29.5％、28.1％和24.3％。此结果证实NDH2基因的加强能够提高NADH的脱氢。图4b为重组菌NdhF及原始菌ARL-91在发酵过程中NAD⁺含量的变化趋势，结果显示NdhF菌株中NAD⁺含量始终高于ARL-91。此结果进一步证实NDH2基因的表达能够加强NADH的脱氢，使其生成NAD⁺。图4c为重组菌NdhF及原始菌ARL-91在发酵过程中NAD⁺/NADH比率的变化趋势，结果显示NdhF菌株中NAD⁺/NADH比率始终高于ARL-91。在48-120小时每个取样点NAD⁺/NADH比率分别提高了18.8％、68.8％、58.3％、68.5％。此结果证实NDH2基因的加强能够提高NAD⁺/NADH比率，从而使菌体处于有利于9α-羟基雄烯二酮生成的状态。

表1显示了重组菌NdhF的及原始菌ARL-91胞内NADH和NAD⁺(辅酶Ⅰ)总量变化。重组菌NdhF胞内辅酶Ⅰ含量比原始菌ARL-91胞内辅酶Ⅰ含量有了大幅度提高，在72小时有最大的提高值66.6％。

表1重组菌NdhF的及原始菌ARL-91胞内NADH和NAD⁺(辅酶Ⅰ)总量

实施例7 ARL-91和NdhF菌株9α-羟基雄烯二酮生产过程中ATP含量检测

1.胞内ATP含量检测

按照实施例4的方法利用ARL-91和NdhF菌株进行9α-羟基雄烯二酮的生成，在生产过程中每隔24h，无菌条件下取样1mL进行菌株胞内ATP检测。胞内ATP浓度测定：采用荧光法测定胞内ATP浓度。取100μL发酵液，加入黑色96孔板中，再向每孔中加入100μL BacTiter GloTM试剂(Promega，shanghai)，25℃，100r/min震荡2min，用Infinite M200Pro(Tecan，Switzerland)在Luminescence模式下检测荧光值。利用标准曲线计算荧光值所对应的ATP浓度。

2.结果比较

对重组菌NdhF及原始菌ARL-91在发酵过程中胞内ATP含量的检测结果如图5所示。结果表明，重组菌NdhF的胞内ATP含量始终比原始菌ARL-91高，在48小时NdhF的胞内ATP含量达到2.34μmol·g^-1·DCW，是原始菌ARL-91(0.93μmol·g^-1·DCW)的2.52倍。此结果证实NDH2基因的加强能够有效增强菌株ATP的合成效率，解决ATP供应不足的问题。

实施例8 ARL-91和NdhF菌株9α-羟基雄烯二酮生产性能比较

按照实施例4的方法利用ARL-91和NdhF菌株进行9α-羟基雄烯二酮的生成，在生产过程中每隔24h，无菌条件下取样1mL进行9α-羟基雄烯二酮生成率的检测。9α-羟基雄烯二酮生成率的检测检测方法如下：用等体积的乙酸乙酯超声萃取样液，10000×g离心10min，取乙酸乙酯相0.1mL于1.5mL管中，自然风干后加l mL的流动相溶解，过0.22μm膜后进行高效液相色谱分析。色谱条件：C18柱，流动相为甲醇：水(4：1)，流速为l mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。

使用相同方法取样1mL利用分光光度计检测600nm波长下的吸光值以测定生物的变化。

2结果比较

(1)如图6所示，在利用ARL-91和NdhF菌株进行9α-羟基雄烯二酮的生产的过程中，两株菌的生物量无明显差别。表明，含有pMV261-ndh重组载体的表达不会影响工程分枝杆菌的生长。

(2)如图7所示，NDH2基因的加强菌株NdhF的9α-羟基雄烯二酮摩尔转化率始终高于原始菌株ARL-91。在24h，菌株NdhF 9α-羟基雄烯二酮摩尔转化率为12.69％，是原始菌株的1.69倍；在48h，菌株NdhF 9α-羟基雄烯二酮摩尔转化率为38.64％，是原始菌株的1.46倍；在72h，菌株NdhF 9α-羟基雄烯二酮摩尔转化率为64％，是原始菌株的1.22倍；在96h，菌株NdhF 9α-羟基雄烯二酮摩尔转化率为85.57％，是原始菌株的1.2倍；在120h，菌株NdhF 9α-羟基雄烯二酮摩尔转化率为93.42％，是原始菌株的1.12倍。

结合实施例5、6、7、8分析，NDH2基因的加强能够有效增强电子传递链的活力，提高NADH的脱氢以提高NAD⁺/NADH比率，使菌株处于有利于9α-羟基雄烯二酮生成的状态，同时NDH2基因的表达能够使电子传递链产生更多的ATP，对提高分枝杆菌生产9α-羟基雄烯二酮的能力具有明显的增强作用。

实施例9 NdhF菌株在生产9α-羟基雄烯二酮中的应用

菌株活化及种子制备同实施例4；

将基因工程菌NdhF种子液以2％的接种量转接于发酵培养基中，在25℃，180rpm条件下摇床培养70h；9α-羟基雄烯二酮产量可以达到0.72g/L，摩尔转化率可以达到98.9％；

发酵培养基组成：K₂HPO₄ 0.1g/L，MgSO₄ 0.1g/L，柠檬酸铁铵0.01g/L，柠檬酸1g/L，磷酸氢二铵1g/L，葡萄糖5g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇1g/L，其余为水，pH 6.0。

实施例10 NdhF菌株在生产9α-羟基雄烯二酮中的应用

菌株活化及种子制备同实施例4；

将基因工程菌NdhF种子液以10％的接种量转接于发酵培养基中，在35℃，200rpm条件下摇床培养168h；9α-羟基雄烯二酮产量可以达到22.8g/L，摩尔转化率可以达到62.6％；

发酵培养基组成：K₂HPO₄ 3g/L，MgSO₄ 3g/L，柠檬酸铁铵0.2g/L，柠檬酸5g/L，磷酸氢二铵10g/L，葡萄糖50g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇50g/L，其余为水，pH7.5。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种通过强化NADH脱氢增强甾药前体生产的方法

<130> 1

<141> 2019-01-29

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> 偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)

<400> 1

atgagccatc ccggagctac ggcatcggat cggcataagg tagtcatcat cggatcgggt 60

ttcggcggtc tgaccgccgc caagaccctc aaacgtgccg acgtcgacgt caagctgatc 120

gcccgtacca cacatcacct gttccagcct ctgctgtacc aggtggccac cggcatcatc 180

tccgaaggcg agatcgcccc tgccacccgc gtgatcctgc gcaagcagaa gaacgcccag 240

gtgctgttgg gcgacgtaac ccacatcgat ctggaaaagc agacggtgga ttcaatcctg 300

ttgggccaca cctattccac tccatacgac agcctgatca tcgccgcagg ggccggacag 360

tcgtacttcg gcaacgacca tttcgccgag ttcgctcccg gcatgaagtc catcgacgat 420

gcgctggagt tgcgcggccg catcctcggt gccttcgagc aggccgagcg ctcgagtgac 480

cccgtgcgcc gggccaaact gctcaccttc acggtggtgg gcgccggtcc gacgggcgtg 540

gagatggccg ggcagatcgc cgaattggcc gaccagaccc tgcgcggtag cttccgtcac 600

atcgatccga ccgaggccag ggtgatcctg ctcgacgccg cacccgcggt gctgccgccg 660

atgggcccga agctgggcaa gcgtgcccag gaacggctcg agaagatggg agtcgaggtt 720

cagctcggcg ccatggtgac cgatgtcgat cgcaacgggc tgacggtcaa ggactccgac 780

ggcacgctgc gccggatcga atcggcctgc aaggtgtggt cggcaggggt gtcggccagc 840

ccgctcggca aggatctggc cgaacagtcc ggggtggagc tggaccgggc cggccgcgtc 900

aaggtgcagc ccgacctcac catccccggt catccgaacg tgttcgtggt cggcgacatg 960

gccgccgtgg aaggcgtgcc gggcgtggcg cagggcgcga ttcagggcgg ccgctacgca 1020

gccaagctga tcaagcgcga ggtggcaggc accagtccga agatccgcag cccgttcgag 1080

tactgggaca agggctcgat ggctacggtg tcgcggttct ccgcggtggc caaggtcggt 1140

ccggtcgagt tctccggttt cttcgcctgg atctgctggt tggtgctgca cctggtgtac 1200

atcgtcgggt tcaagagccg actggtgacg gtgctttcgt ggggtgtgac gttcctgagc 1260

accaaacgcg ggcagctcac catcaccgag cagcaggcct acgcccgcac ccggatcgaa 1320

gaactcgagg agatcgccgc ctcggtgcag gaaaccgaga aggccgcgtc ctag 1374

<210> 2

<211> 457

<212> PRT

<213> 偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)

<400> 2

Met Ser His Pro Gly Ala Thr Ala Ser Asp Arg His Lys Val Val Ile

1 5 10 15

Ile Gly Ser Gly Phe Gly Gly Leu Thr Ala Ala Lys Thr Leu Lys Arg

20 25 30

Ala Asp Val Asp Val Lys Leu Ile Ala Arg Thr Thr His His Leu Phe

35 40 45

Gln Pro Leu Leu Tyr Gln Val Ala Thr Gly Ile Ile Ser Glu Gly Glu

50 55 60

Ile Ala Pro Ala Thr Arg Val Ile Leu Arg Lys Gln Lys Asn Ala Gln

65 70 75 80

Val Leu Leu Gly Asp Val Thr His Ile Asp Leu Glu Lys Gln Thr Val

85 90 95

Asp Ser Ile Leu Leu Gly His Thr Tyr Ser Thr Pro Tyr Asp Ser Leu

100 105 110

Ile Ile Ala Ala Gly Ala Gly Gln Ser Tyr Phe Gly Asn Asp His Phe

115 120 125

Ala Glu Phe Ala Pro Gly Met Lys Ser Ile Asp Asp Ala Leu Glu Leu

130 135 140

Arg Gly Arg Ile Leu Gly Ala Phe Glu Gln Ala Glu Arg Ser Ser Asp

145 150 155 160

Pro Val Arg Arg Ala Lys Leu Leu Thr Phe Thr Val Val Gly Ala Gly

165 170 175

Pro Thr Gly Val Glu Met Ala Gly Gln Ile Ala Glu Leu Ala Asp Gln

180 185 190

Thr Leu Arg Gly Ser Phe Arg His Ile Asp Pro Thr Glu Ala Arg Val

195 200 205

Ile Leu Leu Asp Ala Ala Pro Ala Val Leu Pro Pro Met Gly Pro Lys

210 215 220

Leu Gly Lys Arg Ala Gln Glu Arg Leu Glu Lys Met Gly Val Glu Val

225 230 235 240

Gln Leu Gly Ala Met Val Thr Asp Val Asp Arg Asn Gly Leu Thr Val

245 250 255

Lys Asp Ser Asp Gly Thr Leu Arg Arg Ile Glu Ser Ala Cys Lys Val

260 265 270

Trp Ser Ala Gly Val Ser Ala Ser Pro Leu Gly Lys Asp Leu Ala Glu

275 280 285

Gln Ser Gly Val Glu Leu Asp Arg Ala Gly Arg Val Lys Val Gln Pro

290 295 300

Asp Leu Thr Ile Pro Gly His Pro Asn Val Phe Val Val Gly Asp Met

305 310 315 320

Ala Ala Val Glu Gly Val Pro Gly Val Ala Gln Gly Ala Ile Gln Gly

325 330 335

Gly Arg Tyr Ala Ala Lys Leu Ile Lys Arg Glu Val Ala Gly Thr Ser

340 345 350

Pro Lys Ile Arg Ser Pro Phe Glu Tyr Trp Asp Lys Gly Ser Met Ala

355 360 365

Thr Val Ser Arg Phe Ser Ala Val Ala Lys Val Gly Pro Val Glu Phe

370 375 380

Ser Gly Phe Phe Ala Trp Ile Cys Trp Leu Val Leu His Leu Val Tyr

385 390 395 400

Ile Val Gly Phe Lys Ser Arg Leu Val Thr Val Leu Ser Trp Gly Val

405 410 415

Thr Phe Leu Ser Thr Lys Arg Gly Gln Leu Thr Ile Thr Glu Gln Gln

420 425 430

Ala Tyr Ala Arg Thr Arg Ile Glu Glu Leu Glu Glu Ile Ala Ala Ser

435 440 445

Val Gln Glu Thr Glu Lys Ala Ala Ser

450 455

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgcggatcca atgagccatc ccggagct 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cccaagcttt cagctggcgg ctttctc 27

一种通过强化NADH脱氢增强甾药前体生产的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。