专利摘要

本发明公开了一种最适反应pH提高的β‑葡萄糖醛酸苷酶突变体及其转化甘草酸工艺，属于生物工程领域。将来源于米曲霉AspergillusoryzaeLi‑3的β‑葡萄糖醛酸苷酶进行定点突变，将其编码的第79位谷氨酸、124位谷氨酸、135位谷氨酸及150位谷氨酸和200位天冬氨酸均突变为精氨酸，将突变基因的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到最适反应pH提高的β‑葡萄糖醛酸苷酶突变体。本发明所述的β‑葡萄糖醛酸苷酶突变体的最适反应pH从4.5提高到6.5，调高2个pH单位，使得底物甘草酸的溶解度提高3倍。本发明所得到的β‑葡萄糖醛酸苷酶突变体具有广阔的工业化应用前景。

权利要求

1.一种最适反应pH提高的β-葡萄糖醛酸苷酶突变体，其特征在于，是对基因序列如GenBank登录号为EU095019.1所编码的β-葡萄糖醛酸苷酶进行基因突变，将β-葡萄糖醛酸苷酶的第79位谷氨酸、124位谷氨酸、135位谷氨酸及150位谷氨酸和200位天冬氨酸均突变为精氨酸。

2.权利要求1所述的突变体催化的甘草酸转化工艺，其特征在于，其催化的最适反应pH从4.5提高到6.5，底物甘草酸的溶解度由2.0调高到8.0g/L。

3.权利要求1所述的突变体在甘草酸改性中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种最适反应pH提高的β-葡萄糖醛酸苷酶突变体及其转化甘草酸的工艺，属于生物工程技术领域。

背景技术

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，EC：3.2.1.31)能够识别并催化各种类型β-葡萄糖醛酸糖苷键，同时释放出β-葡萄糖醛酸和相应的配基或苷元。该酶多属于糖苷酶家族1(GH1)和糖苷酶家族2(GH2)，近年来研究发现在糖苷酶家族79(GH79)也有该酶的分布。目前发现哺乳动物、真菌和细菌均能分泌β-葡萄糖醛酸苷酶。β-葡萄糖醛酸苷酶在很多领域具有广泛引用，如人体药物分析、前体药酶导向治疗、肿瘤病理研究等。除此之外，由于β-葡萄糖醛酸苷酶与底物反应后能发生显色反应，因此多作为标记基因，以定位其他目基因的表达。最近，β-葡萄糖醛酸苷酶被广泛应用于天然糖苷类化合物的改性用来生产高附加值衍生物，市场对该酶的需求快速增长。

然而，目前市场上的大部分β-葡萄糖醛酸苷酶为嗜酸酶，酶的最适反应pH也是偏酸性，在实际应用中，使得这些酶在一些碱性条件下容易失活从而导致反应效率下降，已经成为其工业化应用的瓶颈之一。因此，工业应用迫切需要解决这个问题。

发明人所在的研究小组前期从新疆土壤中筛选出一株米曲霉Aspergillusoryzae Li-3，从其基因组上克隆得到一个β-葡萄糖醛酸苷酶能将商品甘草酸单铵盐水解生成附加值高的中间产物单葡萄糖基-甘草次酸和终产物甘草次酸。Aspergillus oryzaeLi-3产生的β-葡萄糖醛酸苷酶的编码基因gus长1812bp，(GenBank登录号：EU095019.1)，该基因全编码604个氨基酸，理论单亚基分子量为67.68KDa。前期将gus基因成功在大肠杆菌中进行异源表达得到重组β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS，并成功解析其晶体结构为一个同源四聚体，分子量为287KDa。每个亚基由N端的糖基结合域、C端的TIM桶状结构域和中间的免疫球蛋白状β-三明治结构域构成，其催化活性位点为Glu414和Glu505。酶的最适pH是4.5，但是在此条件下底物甘草酸的溶解度不到2.0g/L，如果pH提高到8.0，此时底物甘草酸的溶解度可达到8.0g/L，因此，酶的最适反应pH与底物甘草酸的溶解度的不匹配限制了其工业应用。本发明通过理性设计改造基因从而提高PGUS的最适反应pH，进而有效地提高PGUS在工业上的应用价值。

发明内容

本发明的目的是以现有已知晶体结构的β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS为基础，通过理性设计和定点突变技术有效地提高其最适反应pH，优化其转化底物甘草酸的工艺，从而增加β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS的产业价值。

为达到上述目的，本发明基于基因序列gus(GenBank登录号：EU095019.1)编码的β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS的晶体结构，使用在线软件Solvent Accessible Surface Area(SASA)对其表面酸性氨基酸进行分析，筛选溶剂可接触表面积大于30％，且距离活性中性大于 的第79位谷氨酸、124位谷氨酸、135位谷氨酸及150位谷氨酸和200位天冬氨酸为目标突变氨基酸，将它们都突变为精氨酸。将突变基因的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到最适反应pH提高的β-葡萄糖醛酸苷酶突变体。

编码所述原始β-葡萄糖醛酸苷酶的核苷酸序列如GenBank登录号为EU095019.1的序列所示。

获得所述突变体的方法为，以含有gus基因的pET-28a(+)-gus质粒为模板，设计引物，通过PCR进行定点突变得到含有突变基因的重组质粒pET-28a(+)-gus5Rs，将质粒pET-28a(+)-gus5Rs在大肠杆菌BL21(DE3)中表达生产β-葡萄糖醛酸苷酶突变体。

附图说明

图1是本发明原始酶以及构建的突变体在不同pH条件下的酶活性。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：β-葡萄糖醛酸苷酶突变位点的理性设计

本发明的设计策略是基于β-葡萄糖醛酸苷酶晶体结构，使用在线软件SolventAccessible Surface Area(SASA)by the GetArea web server(http://curie.utmb.edu/getarea.html)对其表面酸性氨基酸的溶剂可接触表面积进行分析，筛选溶剂可接触表面积大于30％且距离活性中性大于 的谷氨酸和天冬氨酸为突变位点，最后确定这些位点是第79位谷氨酸、124位谷氨酸、135位谷氨酸及150位谷氨酸和200位天冬氨酸，突变氨基酸的溶剂可接触表面积如表1所示。

表1突变氨基酸的溶剂可接触表面积

实施例2：β-葡萄糖醛酸苷酶突变体工程菌的构建

基于PGUS的晶体结构，确定将第79位谷氨酸、124位谷氨酸、135位谷氨酸及150位谷氨酸和200位天冬氨酸均突变为精氨酸。以含有gus基因的pET-28a(+)-gus质粒为模板，设计引物(如表2所示)，通过PCR进行定点突变得到含有突变基因的重组质粒pET-28a(+)-gus5Rs(PCR体系如表3所示)。定点突变用到的引物如下：

表2突变所用引物

表3质粒克隆PCR体系

PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸5min，16℃保存。

用FastDigest Dpn I酶在37℃下，酶解PCR产物以除去甲基化的模板链，酶切时间为3h(酶切体系如表4所示)。

表4模板消除反应体系

将酶切产物直接转化大肠杆菌Top10感受态细胞中；筛选到阳性克隆、测序正确后将质粒pET-28a(+)-gus5Rs在大肠杆菌BL21(DE3)中转化表达，筛选阳性克隆，得到含有β-葡萄糖醛酸苷酶突变体基因的工程菌。

实施例2：β-葡萄糖醛酸苷酶突变体的表达及纯化

挑取阳性单克隆菌落转接到40mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基(0.5％酵母提取物,1％蛋白胨，1％氯化钠)中，37℃，170rpm过夜培养得到种子液，将种子液按1％的接种量转接到400mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基(0.5％酵母提取物,1％蛋白胨，1％氯化钠)中于37℃，170rpm培养，当菌体密度OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)后,转到16℃，170rpm的摇床里继续培养8-10小时，诱导目标蛋白β-葡萄糖醛酸苷酶突变体的表达。

将上述菌液在4℃，7500g条件下离心5min，收集菌体沉淀，利用25-30mL缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM氯化钠)重悬菌体沉淀，用超高压低温破碎仪破碎细胞(4℃，1400-1600bar)后立即于4℃，17420g离心10分钟，收集上清液作为突变体的粗酶液，于4℃保存备用。

采用AKTA Purifier 10(GE Healthcare)层析系统纯化目标蛋白。蛋白纯化过程中将用到的A液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM氯化钠)、B液(1.0M咪唑)、超纯水和20％乙醇，四种溶液使用前先用0.45μm滤膜真空抽滤，然后超声脱气10分钟。

首先用A液平衡His Trap FF 1mL镍亲和层析柱，然后将突变体粗酶液装载上柱，用100％A液洗脱杂蛋白，待OD280降至最低，用95％A液和5％B液洗脱部分非特异性吸附的杂蛋白，待OD280降至最低，用75％A液和25％B液洗脱，得到纯度较高的目标蛋白，并用甘草酸测定其酶活性。

获得电泳级纯的目标蛋白后，用BCA试剂盒测定其浓度。用牛血清白蛋白作为标准品绘制标准曲线，将50mM Tris-HCl，pH 7.4，15mM氯化钠的蛋白纯化A液作为空白对照进行调零，在酶标仪562nm处测定目标蛋白样品的吸光值，代入标准曲线计算目标蛋白的浓度。

实施例3：β-葡萄糖醛酸苷酶的活性测定

β-葡萄糖醛酸苷酶可以催化甘草酸的糖苷键水解，生成中间产物3-O-单葡萄糖醛酸基甘草次酸和终产物甘草次酸，该反应具有简单、快速、易检测的特点。本研究中通过该反应测定β-葡萄糖醛酸苷酶及其突变体的酶活性。取20μL 0.5g·L-1酶液加入到80μL含有甘草酸浓度为2.0g·L-1、pH为4.5的50mM乙酸－乙酸钠缓冲溶液中，40℃条件下反应10分钟后，加入900μL甲醇终止反应，经0.22μm的有机滤膜过滤到液相小瓶中，用高效液相色谱仪检测254nm波长下底物甘草酸和产物的含量。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定义：上述条件下，每分钟转化1nmol甘草酸所需要的β-葡萄糖醛酸苷酶的量即为一个酶活力单位。

取20μL浓度为0.5g·L-1的纯酶液，分别在50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 3.5,4.5,5.5,150mM氯化钠),50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 6.5,150mM氯化钠)),50mMTris-HCl(pH 7.5,8.5,150mM氯化钠))条件下40℃的水浴中反应10分钟，测定酶活性，结果如图1。原始酶在pH 4.5条件下活性最高，而突变体在pH 6.5下的活性最高，可见突变体的最适反应pH从4.5提高到6.5，调高2个pH单位，这使得甘草酸的溶解度提高3倍，从而优化了β-葡萄糖醛酸苷酶转化甘草酸的反应工艺，提高其工业化应用的价值。

序列表

<110> 北京理工大学

<120> 一种最适反应pH提高的β-葡萄糖醛酸苷酶突变体及其转化甘草酸工艺

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 604

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 1

Met Leu Lys Pro Gln Gln Thr Thr Thr Arg Asp Leu Ile Ser Leu Asp

1 5 1015

Gly Leu Trp Lys Phe Ala Leu Ala Ser Asp Asp Asn Asn Thr Gln Pro

202530

Trp Thr Ser Gln Leu Lys Thr Ser Leu Glu Cys Pro Val Pro Ala Ser

354045

Tyr Asn Asp Ile Phe Ala Asp Ser Lys Ile His Asp His Val Gly Trp

505560

Val Tyr Tyr Gln Arg Asp Val Ile Val Pro Lys Gly Trp Ser Arg Glu

65707580

Arg Tyr Leu Val Arg Cys Glu Ala Ala Thr His His Gly Arg Ile Tyr

859095

Val Asn Gly Asn Leu Val Ala Asp His Val Gly Gly Tyr Thr Pro Phe

100 105 110

Glu Ala Asp Ile Thr Asp Leu Val Ala Ala Gly Arg Gln Phe Arg Leu

115 120 125

Thr Ile Ala Val Asp Asn Arg Leu Thr Tyr Gln Thr Ile Pro Pro Gly

130 135 140

Lys Val Glu Ile Leu Arg Ala Thr Gly Lys Lys Val Gln Thr Tyr Gln

145 150 155 160

His Asp Phe Tyr Asn Tyr Ala Gly Leu Ala Arg Ser Val Trp Leu Tyr

165 170 175

Ser Val Pro Gln Gln His Ile Gln Asp Ile Thr Val Arg Thr Asp Val

180 185 190

Gln Gly Thr Thr Gly Leu Ile Arg Tyr Asn Val Val Ala Ser Thr Thr

195 200 205

Gln Gly Thr Ile Gln Val Ala Val Ile Asp Glu Asp Gly Thr Thr Val

210 215 220

Ala Thr Ser Ser Gly Ser Asn Gly Thr Ile His Ile Pro Ser Val His

225 230 235 240

Leu Trp Gln Pro Gly Ala Ala Tyr Leu Tyr Gln Leu His Ala Ser Ile

245 250 255

Ile Asp Ser Ser Lys Lys Thr Ile Asp Thr Tyr Lys Leu Ala Thr Gly

260 265 270

Ile Arg Thr Val Lys Val Gln Gly Thr Gln Phe Leu Ile Asn Asp Lys

275 280 285

Pro Phe Tyr Phe Thr Gly Phe Gly Lys His Glu Asp Thr Asn Ile Arg

290 295 300

Gly Lys Gly His Asp Asp Ala Tyr Met Val His Asp Phe Gln Leu Leu

305 310 315 320

His Trp Met Gly Ala Asn Ser Phe Arg Thr Ser His Tyr Pro Tyr Ala

325 330 335

Glu Glu Val Met Glu Tyr Ala Asp Arg Gln Gly Ile Val Val Ile Asp

340 345 350

Glu Thr Pro Ala Val Gly Leu Ala Phe Ser Ile Gly Ala Gly Ala Gln

355 360 365

Thr Ser Asn Pro Pro Ala Thr Phe Ser Pro Asp Arg Ile Asn Asn Lys

370 375 380

Thr Arg Glu Ala His Ala Gln Ala Ile Arg Glu Leu Ile His Arg Asp

385 390 395 400

Lys Asn His Pro Ser Val Val Met Trp Ser Ile Ala Asn Glu Pro Ala

405 410 415

Ser Asn Glu Asp Gly Ala Arg Glu Tyr Phe Ala Pro Leu Pro Lys Leu

420 425 430

Ala Arg Gln Leu Asp Pro Thr Arg Pro Val Thr Phe Ala Asn Val Gly

435 440 445

Leu Ala Thr Tyr Lys Ala Asp Arg Ile Ala Asp Leu Phe Asp Val Leu

450 455 460

Cys Leu Asn Arg Tyr Phe Gly Trp Tyr Thr Gln Thr Ala Glu Leu Asp

465 470 475 480

Glu Ala Glu Ala Ala Leu Glu Glu Glu Leu Arg Gly Trp Thr Glu Lys

485 490 495

Tyr Asp Lys Pro Ile Val Met Thr Glu Tyr Gly Ala Asp Thr Val Ala

500 505 510

Gly Leu His Ser Val Met Val Thr Pro Trp Ser Glu Glu Phe Gln Val

515 520 525

Glu Met Leu Asp Met Tyr His Arg Val Phe Asp Arg Phe Glu Ala Met

530 535 540

Ala Gly Glu Gln Val Trp Asn Phe Ala Asp Phe Gln Thr Ala Val Gly

545 550 555 560

Val Ser Arg Val Asp Gly Asn Lys Lys Gly Val Phe Thr Arg Asp Arg

565 570 575

Lys Pro Lys Ala Ala Ala His Leu Leu Arg Lys Arg Trp Thr Asn Leu

580 585 590

His Asn Gly Thr Ala Glu Gly Gly Lys Thr Phe Gln

595 600

一种最适反应pH提高的β-葡萄糖醛酸苷酶突变体及其转化甘草酸工艺专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。