专利摘要

专利摘要

本发明公开了一种利用微生物不对称拆分制备(S)‑苯基乙二醇的方法。该方法包括如下步骤：(1)将有机溶剂与磷酸缓冲液混合均匀，得到有机溶剂与磷酸缓冲液的双相体系；(2)将(R，S)‑苯基乙二醇和吉氏库特菌加入到步骤(1)中得到的双相体系中进行反应，得到(S)‑苯基乙二醇；其中，吉氏库特菌的名称为吉氏库特菌(Kurthiagibsonii)SC0312，保藏号为CCTCCNO：M2017157，该菌株于2017年3月31日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。本发明中有机溶剂/缓冲液双相体系的应用有效抑制了产物毒害作用，提高了反应的底物浓度和产物e.e.值。

权利要求

1.一种利用微生物不对称拆分制备（S）-苯基乙二醇的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将有机溶剂与磷酸缓冲液混合均匀，得到有机溶剂与磷酸缓冲液的双相体系；

(2)将(R，S)-苯基乙二醇和吉氏库特菌加入到步骤(1)中得到的双相体系中进行反应，得到(S)-苯基乙二醇；其中，

吉氏库特菌的名称为吉氏库特菌(Kurthia gibsonii)SC0312，保藏号为CCTCC NO：M2017157，该菌株于2017年3月31日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心；

步骤(1)中所述的有机溶剂为邻苯二甲酸二丁酯或正癸烷；

步骤(2)中所述的吉氏库特菌的添加量为按其在反应体系的终浓度为25～30mg/mL计算；

步骤(2)中所述的(R，S)-苯基乙二醇的用量为按其在反应体系的终浓度为20～160mmol/L计算。

2.根据权利要求1所述的利用微生物不对称拆分制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的磷酸缓冲液为pH 4.5～8.5、100mM的磷酸缓冲液；

步骤(1)中所述的有机溶剂与磷酸缓冲液的体积比为3：7～8：2。

3.根据权利要求2所述的利用微生物不对称拆分制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的磷酸缓冲液为pH 6.5、100mM的磷酸缓冲液；

步骤(1)中所述的有机溶剂与磷酸缓冲液的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的利用微生物不对称拆分制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的吉氏库特菌通过如下方法制备得到：

(I)将吉氏库特菌接种到种子培养基中，180rpm、37℃下振荡培养，得到种子培养液；

(II)将步骤(I)中得到的种子培养液接种到发酵培养基中，180rpm、37℃下振荡培养，得到发酵培养液；

(III)将步骤(II)中得到的发酵培养液离心，收集沉淀，洗涤，得到吉氏库特菌。

5.根据权利要求4所述的利用微生物不对称拆分制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于：

步骤(I)中所述的种子培养基通过如下方法配置得到：将0.15g酵母提取物，0.25gNaCl和0.5g胰蛋白胨加入到蒸馏水中，配成50mL的种子培养基；

步骤(II)中所述的发酵培养基通过如下方法配置得到：将0.3g酵母提取物，0.5g NaCl和1g胰蛋白胨加入到蒸馏水中，配成100mL的发酵培养基。

6.根据权利要求4所述的利用微生物不对称拆分制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于：

步骤(I)中所述的培养的时间为10～12h；

步骤(II)中所述的培养的时间为12～16h；

步骤(III)中所述的离心的条件为：4℃，7900rpm下离心10min；

步骤(III)中所述的洗涤为采用生理盐水进行洗涤。

7.根据权利要求1所述的利用微生物不对称拆分制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的反应的条件为：160～200rpm、20～45℃下反应6～24h。

8.根据权利要求7所述的利用微生物不对称拆分制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的反应的条件为：180rpm、35℃下反应24h。

说明书

技术领域

本发明属于生物催化手性化合物不对称拆分的技术领域，特别涉及一种利用微生物不对称拆分制备（S）-苯基乙二醇的方法。

背景技术

手性醇是一类重要的旋光性化合物，具有独特的化学、光及热稳定性，常作为农药、材料及医药等领域重要的手性原料和手性中间体。由于手性化合物的两个对映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有不同，因此，制备光学纯的手性模块化合物在医药、农业、材料以及环保等领域具有广泛的价值。传统的化学合成法在许多药物、精细化学品、功能材料等手性化合物的合成研究中取得了成功，并开发了许多不同的制备工艺。绿色环保的生物催化则为制备具有应用价值的手性化合物提供了另外一种创新手段与发展空间。生物催化的最大特点是高度的底物立体选择性，包括严格的对映异构体选择性(enantiotopicselectivity)、区域选择性(regio selectivity)等，可以减少化学催化中产生的分子异构化、消旋化、重排等问题。但是，生物催化在传统的水相体系中常常存在底物溶解度较小、底物产物对微生物细胞的毒害作用、底物产物对催化反应的抑制作用等问题，这使得反应产率低，催化剂利用率低，生产成本过高。因而找到合适的反应体系，通过解除底物产物的毒害和抑制作用来提高生物催化过程的底物浓度和产率，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用微生物不对称拆分制备(S)-苯基乙二醇的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用微生物不对称拆分制备(S) -苯基乙二醇的方法，包括如下步骤：

(1)将有机溶剂与磷酸缓冲液混合均匀，得到有机溶剂与磷酸缓冲液的双相体系；

(2)将(R，S)-苯基乙二醇和吉氏库特菌加入到步骤(1)中得到的双相体系中进行反应，得到(S)-苯基乙二醇；其中，

吉氏库特菌的名称为吉氏库特菌(Kurthia gibsonii)SC0312，保藏号为 CCTCCNO：M 2017157，该菌株于2017年3月31日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

步骤(1)中所述的有机溶剂为叔戊醇，正己醇，2-甲基四氢呋喃，邻苯二甲酸二丁酯，碳酸二甲酯，乙酸丁酯，异辛烷，正癸烷和双戊烯中的至少一种；优选为邻苯二甲酸二丁酯或正癸烷。

步骤(1)中所述的磷酸缓冲液为pH 4.5～8.5、100mM的磷酸缓冲液；优选为pH6.5、100mM的磷酸缓冲液。

步骤(1)中所述的有机溶剂与磷酸缓冲液的体积比为3：7～8：2；优选为 1:1。

步骤(2)中所述的(R，S)-苯基乙二醇的用量为按其在反应体系的终浓度为20～180mmol/L计算；优选为按其在反应体系的终浓度为20～160mmol/L 计算。

步骤(2)中所述的吉氏库特菌优选为通过如下方法制备得到：

(I)将吉氏库特菌接种到种子培养基中，180rpm、37℃下振荡培养，得到种子培养液；

(II)将步骤(I)中得到的种子培养液接种到发酵培养基中，180rpm、37℃下振荡培养，得到发酵培养液；

(III)将步骤(II)中得到的发酵培养液离心，收集沉淀，洗涤，得到吉氏库特菌。

步骤(I)中所述的吉氏库特菌的接种量优选为1‰(v/v)。

步骤(I)中所述的种子培养基为121℃高温灭菌20min后的种子培养基。

步骤(I)中所述的种子培养基通过如下方法配置得到：将0.15g酵母提取物，0.25gNaCl和0.5g胰蛋白胨加入到蒸馏水中，配成50mL的种子培养基。

步骤(I)中所述的培养的时间优选为10～12h。

步骤(II)中所述的种子培养液的接种量优选为1‰(v/v)。

步骤(I)中所述的发酵培养基为121℃高温灭菌20min后的发酵培养基。

步骤(II)中所述的发酵培养基通过如下方法配置得到：将0.3g酵母提取物，0.5gNaCl和1g胰蛋白胨加入到蒸馏水中，配成100mL的发酵培养基。

步骤(II)中所述的培养的时间优选为12～16h。

步骤(III)中所述的离心的条件优选为：4℃，7900rpm下离心10min。

步骤(III)中所述的洗涤为采用生理盐水进行洗涤；优选为用生理盐水洗涤菌体两次。

步骤(2)中所述的吉氏库特菌的添加量为按其在反应体系的终浓度为25～ 30mg/mL计算。

步骤(2)中所述的反应的条件为：160～200rpm、20～45℃下反应6～24 h；优选为：180rpm、35℃下反应24h。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明主要利用吉氏库特菌Kurthia gibsonii SC0312选择性氧化外消旋苯基乙二醇中的(R)-苯基乙二醇，从而获得对映体纯的(S)-苯基乙二醇，步骤如下：(1)配制有机溶剂与磷酸缓冲液的双相体系，磷酸缓冲液的pH为4.5～8.5；在双相体系中加入反应底物外消旋的苯基乙二醇；(2)在上述体系中加入吉氏库特菌，在温度为20～45℃，振荡速度为160～200rpm条件下，进行全细胞催化的选择性氧化反应。

2、本发明中反应的底物浓度高达160mM，得到产物(S)-苯基乙二醇的对映体纯度为85.0％e.e.(对映体过量率)，其产物的对映体纯度和收率均得到提高。现有技术中用微生物细胞不对称氧化拆分外消旋苯基乙二醇能获得较好的产物e.e.值，但是底物浓度不高，产率很低，其主要原因可能是水相中存在严重的产物和底物抑制，游离的微生物细胞容易受到底物和产物的毒害作用，导致细胞活性降低。本发明利用吉氏库特菌在双相体系中不对称拆分制备(S)- 苯基乙二醇，有效地抑制了产物毒害，提高了反应体系中的底物浓度，进而提高了产率。在最优反应条件下，底物浓度高达160mmol/L，获得的(S)-苯基乙二醇对映体纯度达到85.0％。

3、本发明的制备方法具有反应条件温和、环境污染小、反应过程简单易控等优点，有机溶剂/缓冲液双相体系的应用有效抑制了产物毒害作用，提高了反应的底物浓度和产物e.e.值。

附图说明

图1是为实施例2制得的产物正相液相色谱图。

图2是为实施例2制得的产物反相液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，下列实施例中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。

在本发明的下述实施例中，应用的吉氏库特菌(Kurthia gibsonii SC0312) 于2017年3月31日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017157。

在本发明的下述实施例中，使用的外消旋(R，S)-苯基乙二醇、(R)-苯基乙二醇，(S)-苯基乙二醇标准品均购于Aladdin公司。

在本发明的下述实施例中，有机相和缓冲液相中的(R)-苯基乙二醇，(S) -苯基乙二醇，(R，S)-苯基乙二醇标准品均采用高效液相色法(HPLC)检测，有机相中样品的检测条件如下(正相液相)：

色谱柱为Chiralcel OB-H(4.6×250mm，5μm)，流动相为正己烷：异丙醇＝90：10(v/v)，流速0.7mL/min；柱温35℃；柱压，常压；紫外检测波长220nm；进样体积20μL。

该检测条件下，(R)-苯基乙二醇的保留时间为7.1min，(S)-苯基乙二醇的保留时间为8.1min。

缓冲液相中样品的检测条件如下(反相液相)：

色谱柱为XBridgeTM C18Column(5μm，4.6×250mm)，流动相为水：乙腈＝3：2(v/v)，其中水中添加1‰(v/v)的三氟乙酸，流速0.5mL/min；柱温 35℃；柱压，常压；紫外检测波长215nm；进样体积20μL。

该检测条件下，(R，S)-苯基乙二醇的保留时间为6.3min。

取样方法：从反应开始到反应结束每间隔1小时分别从有机相和缓冲液相中取样。其中有机相中取样25μL，用100μL的乙酸乙酯稀释，检测有机相中 (R)-苯基乙二醇，(S)-苯基乙二醇的浓度；缓冲液相中取样25μL，用975μL 的蒸馏水稀释，检测缓冲液相中的(R，S)-苯基乙二醇，从而计算(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率。设计该转化的途径如下：

实施例1菌株培养

分别按以下配方，配制种子培养基和发酵培养基：

SC0312种子培养基：取0.15g酵母提取物，0.25g NaCl和0.5g胰蛋白胨，加入蒸馏水中，配成50mL的种子培养基，121℃高温灭菌20min。

SC0312发酵培养基：取0.3g酵母提取物，0.5g NaCl和1g胰蛋白胨，加入蒸馏水中，配成100mL的发酵培养基，121℃高温灭菌20min。

取1‰(v/v)(50μL)的吉氏库特菌加入到50mL的种子培养基中，在37℃， 180rpm振荡培养10～12h，获得种子培养液；然后以1‰(v/v)(100μL)的接种量将种子培养液加入到100mL的发酵培养基中，在37℃，180rpm，培养 12～16h，收获发酵液。

将发酵液在4℃，7900rpm条件下离心10min，收集菌体沉淀，并用生理盐水洗涤菌体两次，弃去上清，获得菌体沉淀。

实施例2有机溶剂对生物催化反应的影响

在25mL血清瓶中分别加入2mL 100mM，pH 6.5的磷酸缓冲液和2mL的有机溶剂(叔戊醇，正己醇，2-甲基四氢呋喃，邻苯二甲酸二丁酯，碳酸二甲酯，乙酸丁酯，异辛烷，正癸烷，双戊烯)配成体积比为1：1的双相体系，再加入 11.05mg的外消旋(R，S)-苯基乙二醇(即终浓度为20mM)和0.10g的吉特库特菌(即终浓度为25mg/mL)，在35℃和180rpm条件下反应6h，待反应结束后，用HPLC检测得到的产物(S)-苯基乙二醇的对映体过量率，分别为0.05％、 0.03％、0.04％、99.99％、0.02％、0.54％、0.71％、99.99％、0.03％(产物液相色谱图如图1和2所示)。

实施例3反应初始pH对生物催化反应的影响

在25mL血清瓶中加入2mL 100mM，然后分别加入不同pH的磷酸缓冲液 (pH分别为4.5、5、5.5、6.5、7.5、8.5)和2mL的邻苯二甲酸二丁酯配成体积比为1：1的双相体系，再加入11.05mg的外消旋(R，S)-苯基乙二醇(终浓度为20mM)和0.12g的吉特库特菌(终浓度为30mg/mL)，在35℃和180rpm 条件下反应6h，待反应结束后，用HPLC检测得到的产物(S)-苯基乙二醇的对映体过量率分别为98.67％、98.38％、99.99％、99.99％、99.99％、99.99％。

实施例4反应温度对对生物催化反应的影响

在25mL血清瓶中加入2mL 100mM，pH 6.5的磷酸缓冲液和2mL的邻苯二甲酸二丁酯配成体积比为1：1的双相体系，再加入11.05mg的外消旋(R， S)-苯基乙二醇(终浓度为20mM)和0.11g的吉特库特菌(终浓度为27.5 mg/mL)，在180rpm和不同的温度(温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、 45℃)条件下反应6h，待反应结束后，用HPLC检测得到的产物(S)-苯基乙二醇的对映体过量率高达99.99％。

实施例5底物浓度对生物催化反应的影响

在25mL血清瓶中加入2mL 100mM，pH 6.5的磷酸缓冲液和2mL的邻苯二甲酸二丁酯配成体积比为1：1的双相体系，再加入0.12g的吉特库特菌(终浓度为30mg/mL)和不同终浓度的外消旋(R，S)-苯基乙二醇(终浓度分别为20mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120 mM、140mM、160mM、180mM)，在35℃和180rpm条件下反应24h，待反应结束后，用HPLC检测得到的产物(S)-苯基乙二醇的对映体过量率分别为 99.99％、99.99％、99.99％、99.99％、99.99％、99.99％、99.04％、97.57％、98.44％、 94.41％、84.57％、64.89％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

一种利用微生物不对称拆分制备（S）-苯基乙二醇的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。