专利摘要
本发明公开了一种胆固醇分子探针及其制备方法，以石胆酸为原料，经酯化反应、氧化反应、脱氢反应、羰基保护反应、还原反应、羟基保护反应、还原反应、碘代反应、取代反应、脱保护反应后，得到如式(1)所示的胆固醇分子探针。本发明还公开了所述式(1)胆固醇分子探针在用于鉴定胆固醇修饰蛋白中的应用。本发明所述的胆固醇探针可以模拟正常胆固醇促进细胞生长，促进胆固醇修饰蛋白hedgehog的剪切成熟，并且可以用来研究蛋白质的胆固醇修饰。
权利要求
1.一种胆固醇分子探针，其特征在于，其结构如式(1)所示：
2.一种胆固醇分子探针的制备方法，其特征在于，以石胆酸为原料，依次经过酯化、氧化反应、脱氢反应、羰基保护反应、还原反应、羟基保护反应、还原反应、碘代反应、取代反应、脱保护反应后，得到如式(1)所示的胆固醇分子探针；所述制备方法的反应过程如路线(a)所示：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酯化反应所用试剂为对甲苯磺酸；所述氧化反应所用试剂为2-碘酰基苯甲酸；所述脱氢反应所用试剂包括IBX和对甲苯磺酸；所述羰基保护反应所用的试剂包括乙酸酐和乙酰氯；所述还原反应所用试剂包括硼氢化钠或硼氢化钾；所述羟基保护所用试剂包括叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑；所述碘代反应所用的试剂为碘、咪唑、三苯基膦；所述取代反应所用试剂为叠氮化钠；所述脱保护反应所用试剂包括盐酸四氢呋喃溶液、盐酸乙酸乙酯溶液。
4.一种如权利要求2或3所述的制备方法制备得到的式(1)所示的胆固醇分子探针。
5.如权利要求1所述的胆固醇分子探针在促进细胞生长、促进胆固醇修饰蛋白的剪切成熟中以及在鉴定胆固醇修饰蛋白中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述式(1)所示的胆固醇修饰蛋白为hedgehog蛋白。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)式(1)胆固醇分子探针修饰蛋白
将转染蛋白的细胞和式(1)胆固醇分子探针共培养，使胆固醇分子探针修饰蛋白，形成式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白；
(2)叠氮基-炔基环加成反应
将所述式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白与式(2)炔基生物素(炔基biotin)，在还原剂维生素C钠盐和铜离子稳定剂TBTA的存在下，进行铜离子催化的叠氮基-炔基环加成反应，在式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白上共价连接一个生物素(biotin)分子；
(3)用Avidin Beads蛋白进行富集
用Avidin Beads对共价连接一个biotin分子的式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白进行富集，最后用Western Blot检测。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，胆固醇探针终浓度为2.5μg/ml。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述叠氮基-炔基环加成反应的温度为20℃～30℃；所述叠氮基-炔基环加成反应的时间为1小时～2小时。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述式(2)炔基生物素(炔基biotin)、铜离子、维生素C钠盐、TBTA的摩尔比为：100μM：1mM：2.5mM：1mM。
说明书
技术领域
本发明属于生物、医药及其制备和应用的技术领域，具体涉及一种胆固醇分子探针及其制备、以及其在鉴定和分析胆固醇修饰蛋白过程中的应用。
背景技术
蛋白质的胆固醇修饰是一种特殊的翻译后修饰，自1996年以来，唯一发现的胆固醇修饰蛋白是hedgehog蛋白。胆固醇修饰对于hedgehog蛋白的成熟及发育和癌症的发生有密切关系。有多项研究表明还有新的胆固醇修饰蛋白，但由于胆固醇分子的双极性分子特征，一直没有好的鉴定胆固醇修饰蛋白的方法报道。铜离子催化的叠氮基-炔基环加成反应具有条件温和、产率高等优点，弥补了生物化学反应条件要求温和和含量低的特点。因此结合叠氮基-炔基环加成反应，开发一种胆固醇探针用来鉴定胆固醇修饰蛋白将是一条可行路线，并且具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以模拟正常胆固醇活性、促进细胞生长、促进胆固醇修饰蛋白剪切成熟、可用于鉴定胆固醇修饰蛋白的胆固醇分子探针。
本发明提出的胆固醇分子探针，其结构式如(1)所示，
胆固醇的结构如式(2)所示：
式(1)胆固醇分子探针与胆固醇的结构相比，母体结构相同，但侧链不同。式(1)胆固醇分子探针侧链的叠氮基可以与炔基发生环加成反应。
本发明还提出了所述式(1)胆固醇分子探针的制备方法，以石胆酸为原料，依次经酯化反应、氧化反应、脱氢反应、羰基保护反应、还原反应、羟基保护反应、还原反应、碘代反应、取代反应以及脱保护反应后，得到如式(1)所示的胆固醇分子探针，反应方法的反应过程如路线(a)所示：
具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)酯化反应：
所述酯化反应所用试剂为对甲苯磺酸，溶剂为甲醇，反应温度为室温25℃。
在无水甲醇中，25℃条件下，石胆酸与甲苯磺酸发生酯化反应生成L1化合物。
(2)氧化反应：
所述氧化反应所用试剂为2-碘酰基苯甲酸(IBX)，溶剂为二甲亚砜(DMSO)和/或甲苯，反应温度为室温25℃。
在二甲亚砜和/或甲苯中，25℃条件下，L1化合物与IBX发生氧化反应生成L2化合物。
(3)脱氢反应：
所述脱氢反应所用试剂包括IBX，对甲苯磺酸或三氟乙酸，所用溶剂为二甲亚砜，反应温度为室温25℃～40℃；
在二甲亚砜中，25℃～40℃条件下，L2化合物与IBX、对甲苯磺酸发生脱氢反应生成L3化合物。
(4)羰基保护反应
所述羰基保护反应所用的试剂包括乙酸酐和乙酰氯，加热至145～160℃回流。
25℃条件下，L3化合物与乙酸酐和乙酰氯发生羰基保护反应生成L4化合物。
(5)还原反应
所述还原反应所用试剂包括硼氢化钠或硼氢化钾，溶剂为甲醇和/或二氯甲烷，反应温度为室温25℃。
在甲醇和/或二氯甲烷中，0℃条件下，L4化合物与硼氢化钠或硼氢化钾，发生还原反应生成L5化合物。
(6)羟基保护反应
所述羟基保护所用试剂包括叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、咪唑，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，反应温度为室温25℃。
在N,N-二甲基甲酰胺中，25℃条件下，L5化合物与叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑发生羟基保护反应生成L6化合物。
(7)还原反应
所述还原反应所用试剂包括LiAlH4，溶剂为无水THF，反应温度为室温25℃。
将L6化合物溶于无水THF，室温下与LiAlH4反应，生成L7化合物。
(8)碘代反应
所述碘代反应所用的试剂为碘、咪唑、三苯基膦(PPh3)，反应溶剂为甲苯，反应温度为室温25℃。
在甲苯中，25℃条件下，L7化合物与碘、咪唑、三苯基膦发生碘代反应生成L8化合物。
(9)取代反应
所述取代反应所用试剂为叠氮化钠，溶剂为丙酮，反应温度为60‐70℃回流。
在丙酮中，L8化合物与叠氮化钠发生取代反应生成L9化合物。
(10)脱保护反应
所述脱保护反应所用试剂包括盐酸四氢呋喃溶液、盐酸乙酸乙酯溶液，反应温度为室温25℃。所用溶剂为四氢呋喃或二氯甲烷。
25℃条件下，L9化合物在盐酸四氢呋喃溶液、或盐酸乙酸乙酯溶液中发生脱保护反应，生成式(1)胆固醇分子探针。
在一个具体的实施方案中，本发明式(1)胆固醇分子探针的制备过程为：
以下反应步骤中，当量是指以每步骤的原料为基准，如步骤(1)中，以石胆酸为基准的值，步骤(2)中，为以L1化合物为基准的值，以此类推。
(1)酯化反应：
将石胆酸溶于无水甲醇中，加入对甲苯磺酸(0.1eq)，在室温下25℃反应4小时，生成L1化合物。
(2)氧化反应：
将L1化合物溶于无水DMSO和甲苯中，加入IBX(1.3eq)，室温下反应3小时，生成L2化合物；
(3)脱氢反应：
将L2化合物溶于无水DMSO中，加入IBX(1.3eq)和催化量的三氟乙酸，40℃搅拌12小时，生成L3化合物。.
(4)羰基保护反应
将L3化合物溶于乙酸酐和乙酰氯(体积比1:1)中，加热回流5小时，生成L4化合物。
(5)还原反应
将L4化合物溶于甲醇中和二氯甲烷中，0℃下加入硼氢化钠(5eq)，室温反应8小时，生成L5化合物。
(6)羟基保护反应
将L5化合物溶于无水DMF，0℃加入咪唑(6eq)和TBSCl(3eq)。室温下反应8小时，TLC检测反应完全后，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，大量水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到白色固体L6化合物。
(7)还原反应
将L6化合物溶于无水THF，0℃下缓慢滴加到LiAlH4(10eq)的THF溶液中，室温下反应3小时，生成L7化合物。
(8)碘代反应
室温下，将PPh3(5eq)和咪唑(10eq)加入I2(5eq)的无水甲苯中，搅拌三个小时后逐滴加入化合物L7化合物甲苯溶液，继续搅拌2小时，生成L8化合物。
(9)取代反应
将L8化合物溶于丙酮中，加入叠氮化钠(2-10eq)，回流12小时，生成L9化合物。
(10)脱保护反应
将L9化合物溶于四氢呋喃中，0℃下滴加盐酸四氢呋喃溶液或盐酸乙酸乙酯溶液，反应温度为室温25℃。
本发明制备方法中，采用薄板层析法来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后采用的后处理方法包括浓缩、萃取、柱层析分离等，最终产物通过核磁共振谱来验证。
本发明还提出了如上所述的制备方法制备得到的式(1)胆固醇分子探针。
本发明还提供了式(1)胆固醇分子探针在促进细胞生长中的应用。25-羟基胆固醇(25-OHC)可以抑制细胞内胆固醇内源合成途径SREBP通路。在胆固醇饥饿的条件下，25-OHC处理会造成细胞死亡；外加的胆固醇可以恢复25-OHC造成的细胞毒性。将式(1)胆固醇分子探针加入胆固醇饥饿(细胞饥饿的时间为6天，每48小时换一次培养基即为胆固醇饥饿的时间)的细胞培养基中，37℃培养，6天后，用结晶紫染色后观察。胆固醇探针可以模拟正常胆固醇恢复由25-OHC造成的细胞毒性，并且能够促进细胞生长。所述细胞为CHO-7；所述胆固醇分子探针的浓度为1μg/mL～10μg/mL。
其中，所述细胞包括但不限于进行脂质代谢研究常用的仓鼠卵巢细胞系。
选择6天对细胞进行染色，可以给予细胞充分的生长时间，用未加式(1)胆固醇分子探针培养的细胞已全部死亡，而加不同浓度的式(1)胆固醇分子探针或正常胆固醇培养的细胞能恢复细胞的正常生长。说明本发明所述的式(1)胆固醇分子探针可以完全模拟正常胆固醇的效果，但是式(1)胆固醇分子探针没有其他的副作用。
在一个具体的实施方式中，分别将浓度为1μg/mL、3μg/mL和10μg/mL的式(1)胆固醇分子探针加入胆固醇饥饿(细胞饥饿的时间为6天，每48小时换一次培养基，即为胆固醇饥饿的时间)的经25-OHC处理过的CHO-7细胞培养基中，37℃培养，每48小时更换一次对应的培养基，6天后用结晶紫染色。胆固醇探针可以模拟正常胆固醇恢复由25-OHC造成的细胞毒性，并且能够促进细胞生长。
本发明还提出了式(1)胆固醇分子探针在促进胆固醇修饰蛋白的剪切成熟中的应用；本发明所述的胆固醇修饰蛋白可以是任意的胆固醇修饰蛋白，如hedgehog蛋白。
在一个具体的实施方式中，式(1)胆固醇分子探针能够促进胆固醇修饰蛋白Hedgehog的剪切成熟。Hedgehog蛋白在其成熟过程中会发生自剪切，其C端具有催化功能，可以在其N端的末端共价修饰一个胆固醇分子。胆固醇修饰对hedgehog的成熟和功能必不可少。在293T细胞中转染hedgehog蛋白后，将细胞用加入了胆固醇探针的培养基在37℃条件下培养48小时，收集细胞，检测hedgehog蛋白的剪切成熟。结果如图2所示，胆固醇探针可以模拟正常胆固醇促进hedgehog蛋白的剪切成熟，说明式(1)胆固醇分子探针可以完全模拟正常胆固醇的效果，式(1)胆固醇分子探针没有其他的副作用。pCMV-3xFlag-Shh代表：CMV promoter介导的N端3xFlag tag Snoic hedgehog表达质粒。1、2、3分别代表WesternBlot的不同泳道。
本发明还提供了式(1)胆固醇分子探针在鉴定胆固醇修饰蛋白中的应用；所述应用包括以下步骤：
(1)式(1)胆固醇分子探针修饰蛋白
将转染蛋白的细胞和式(1)胆固醇分子探针共培养，使胆固醇分子探针修饰蛋白，形成式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白；
(2)叠氮基-炔基环加成反应
将所述式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白与式(2)炔基生物素(炔基biotin)，在还原剂维生素C钠盐和铜离子稳定剂TBTA的存在下，进行铜离子催化的叠氮基-炔基环加成反应，在式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白上共价连接一个生物素(biotin)分子；
(3)用Avidin Beads蛋白进行富集
用Avidin Beads对共价连接一个biotin分子的式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白进行富集，最后用Western Blot检测。
本发明所述的胆固醇修饰蛋白可以是任意的胆固醇修饰蛋白，如hedgehog蛋白。
其中，步骤(1)中，细胞量为2盘60mm的1500K 293T细胞，胆固醇探针终浓度为2.5μg/ml。
所述共培养的温度为37度。
所述共培养的时间为24-72小时；优选地，为48小时。
细胞转染蛋白的过程为：用opti-MEM分别稀释质粒和转染试剂PEI，两者用量比为1:3。将两者混合后，混匀，室温放置15min，再加入细胞培养液中。由于转染试剂PEI对细胞有轻微毒性，所以转染后6小时，更换新鲜培养液。
其中，步骤(2)中，
所述叠氮基-炔基环加成反应的具体过程包括反应物加入后，加入式(3)所示的炔基biotin，然后加入催化剂铜离子，其次加入还原剂维生素C钠盐，混匀反应体系，最后加入铜离子稳定剂TBTA。
所述叠氮基-炔基环加成反应的溶剂选自RIPA、1％NP40；优选地，为RIPA。
所述叠氮基-炔基环加成反应的温度为20℃到30℃；优选地，为27℃。
所述叠氮基-炔基环加成反应的时间为1小时～2小时；优选地，为1.5小时。
所述式(2)炔基生物素(炔基biotin)的摩尔比、铜离子、维生素C钠盐、TBTA的摩尔比为：100μM：1mM：2.5mM：1mM。
采用本发明优化的环加成反应条件，可以使得环加成反应的效率显著提高。
当炔基biotin为100μM，铜离子的浓度为1mM，还原剂维生素C钠盐的浓度为2.5mM，铜离子稳定剂TBTA的浓度为1mM时，环加成反应的效率最高；如图3所示，第10道泳道的效率最高。
所述铜离子为二价铜离子，优选地为，CuSO4。
由于一价铜离子不稳定，不能长时间稳定存在。本发明采用加入还原剂的方式。所述还原剂维生素C钠盐的作用为还原加入的二价铜离子为有催化活性的一价铜离子。
所述铜离子稳定剂TBTA(Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine)的作用为稳定由维生素C钠盐还原的一价铜离子，保持催化剂状态稳定。
其中，步骤(3)中，
用Avidin Beads蛋白进行富集的过程包括，首先，将未发生环加成反应的游离态式(3)所示的炔基biotin透析去掉。然后将透析后的上清和Avidin Beads 4度孵育6小时，1000g离心，去掉上清，充分清洗Avidin Beads，确保洗掉非特性异性结合的蛋白，最后加入loading buffer，95度，5min。再进行13200rpm离心1min。取上清，进行SDS-PAGE凝胶电泳，最后进行Western Blot检测。
本发明所述Avidin Beads蛋白购自Thermo公司的NeutrAvidinTMAgarose，货号：29204。
发生叠氮基-炔基环加成反应连接一个biotin后，有式(1)胆固醇分子探针修饰的蛋白，会发生明显的分子量上浮，并且Avidin Beads能够对分子量上浮的蛋白进行特异性富集，说明胆固醇探针可以用于特异性鉴定发生了胆固醇修饰的蛋白。
在一个具体的实施方式中，式(1)胆固醇分子探针在鉴定胆固醇修饰蛋白中的应用包括：在293T细胞中转染hedgehog蛋白后，将细胞用加入了胆固醇探针的培养基在37℃条件下培养48小时，收集细胞，进行透析，去掉细胞内未和hedgehog蛋白修饰的游离胆固醇探针，结合式(2)所示的炔基biotin，进行铜离子催化的叠氮基-炔基环加成反应。共价连接一个biotin分子在胆固醇修饰的hedgehog蛋白上，再进行两次透析，去掉没有发生环加成反应的游离炔基biotin。再用Avidin Beads对发生胆固醇修饰的hedgehog蛋白进行富集，最后用Western Blot检测。
本发明式(1)胆固醇分子探针的制备方法反应条件温和、合成方法简便。制备的式(1)胆固醇分子探针可以用于鉴定胆固醇修饰蛋白。所述胆固醇分子探针可以模拟正常胆固醇活性，促进细胞生长，促进胆固醇修饰蛋白Hedgehog剪切成熟，并且可以用来鉴定hedgehog的胆固醇修饰。结合叠氮基-炔基环加成反应，开发一种胆固醇探针用来鉴定胆固醇修饰蛋白将是一条可行路线，并且具有重要意义。
附图说明
图1为实施例10中胆固醇探针促进CHO-7细胞生长的结晶紫染色图。
图2为实施例10中胆固醇探针促进hedgehog剪切成熟的Western Blot图。
图3为实施例10中胆固醇探针进行click反应效率优化的Western Blot图。
图4实施例10中胆固醇探针结合炔基biotin，进行叠氮基-炔基环加成反应后，胆固醇探针修饰的hedgehog成熟形式分子量上浮和特异性富集修饰条带的Western Blot图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
下述实施例中，化合物结构由核磁共振仪测定；试剂主要由上海国药化学试剂公司提供；产品纯化主要通过柱色谱，硅胶(200-300)由青岛海洋化工厂生产。
实施例1:化合物L1的制备
将石胆酸(1.88g,5.0mmol)溶于无水甲醇中，加入对甲苯磺酸(100mg,0.5mmol)。在室温下反应4小时。TLC检测反应完全后，反应液浓缩，加入乙酸乙酯150mL，分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝1:1)得到白色固体(1.9g,97％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.66(s,3H),3.65–3.58(m,1H),0.92(s,3H),0.90(s,3H),0.64(s,3H)。
实施例2：化合物L2的制备
将L1(1.8g,4.6mmol)溶于无水DMSO(30mL)和无水甲苯(30mL)中，加入IBX(1.7g,6.0mmoL)。室温下反应3小时，TLC检测反应完全后，加入水和乙酸乙酯，抽滤除去不溶物，滤液乙酸乙酯萃取，合并有机相，大量水洗，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝2:1)得到白色固体(1.63g,90％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.66(s,3H),1.01(s,3H),0.92(d,J＝6.3Hz,3H),0.68(s,3H)。
实施例3：化合物L3的制备
将L2(1.9g,4.9mmol)溶于无水DMSO中，加入IBX(1.7g,6.0mmoL)和催化量的三氟乙酸，40℃搅拌12小时，TLC检测反应完全后，加入水和乙酸乙酯，抽滤除去不溶物，滤液乙酸乙酯萃取，合并有机相，大量水洗，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝2:1)得到白色固体(855mg,45％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.72(s,1H),3.66(s,3H),1.17(s,3H),0.91(d,J＝6.3Hz,3H),0.70(s,3H)。
实施例4：化合物L4的制备
将L3(800mg,2.1mmol)溶于乙酸酐(30mL)和乙酰氯(30mL)中，加热回流5小时，TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和碳酸氢钠溶液(30mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝5:1)得到白色固体(727mg,82％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.69(s,1H),5.44–5.34(m,1H),3.66(s,3H),2.13(s,3H),0.99(s,3H),0.92(d,J＝6.3Hz,3H),0.70(s,3H)。
实施例5：化合物L5的制备
将L4(700mg,1.63mmol)溶于甲醇中和二氯甲烷中，0℃下加入硼氢化钠。室温反应8小时后，TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝5:1)得到白色固体(552mg,87％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.43–5.25(m,1H),3.66(s,3H),3.59–3.43(m,1H),1.00(s,3H),0.92(d,J＝6.3Hz,3H),0.67(s,3H)。
实施例6：化合物L6～L7的制备
将L5(1.80g,4.6mmol)溶于无水DMF(30mL)，0℃加入咪唑(1.88g，27.6mmol)和TBSCl(2.08g，13.8mmol)。室温下反应8小时后，TLC检测反应完全后，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，大量水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到白色固体L6。将L6溶于无水THF，0℃下缓慢滴加到LiAlH4(1.76g,46.2mmol)的THF溶液中。室温下反应3小时，TLC检测反应完全后，依次滴加H2O(1.76mL)，15％氢氧化钠溶液(1.76mL)，H2O(5.28mL)，抽滤除去固体，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝5:1)得到白色固体L7(1.74g,80％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.37–5.27(m,1H),3.61(t,J＝6.0Hz,2H),3.55–3.41(m,1H),0.99(s,3H),0.94(d,J＝6.3Hz,3H),0.88(s,9H),0.67(s,3H),0.05(s,6H)。
实施例7：化合物L8的制备
室温下，将PPh3(2.73g,10.4mmol)和咪唑(1.56g,23mmol)加入I2(2.9g,11.5mmol)的无水甲苯40mL中，搅拌三个小时后逐滴加入化合物L7(1.09g,2.3mmol)甲苯溶液，继续搅拌2小时，TLC检测反应完全后，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，大量水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝5:1)得到白色固体(1.13g,83％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.31(m,1H),3.53–3.41(m,1H),3.23–3.08(m,2H),0.99(s,3H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H),0.88(s,9H),0.67(s,3H),0.05(s,6H)。
实施例8：化合物L9的制备
将化合物L8(1.13g,1.9mmol)溶于丙酮中50mL，加入叠氮化钠(247mg,3.8mmol)，回流12小时。TLC检测反应完全后，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，大量水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝5:1)得到白色固体(0.9g,93％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.31(m,1H),3.54–3.40(m,1H),3.30–3.16(m,2H),0.99(s,3H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H),0.88(s,9H),0.67(s,3H),0.05(s,6H)。
实施例9：式(1)胆固醇分子探针的制备
将化合物L9(200mg,0.4mmol)溶于二氯甲烷20mL中，0℃下滴加2MHCl/THF(30mL)溶液，室温搅拌2小时，TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，硅胶柱层析(DCM:MeOH＝10:1)得到白色固体即式(1)胆固醇分子探针(133mg,86％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.36(d,J＝5.2Hz,1H),3.55–3.49(m,1H),3.28–3.17(m,2H),1.01(s,3H),0.95(d,J＝6.4Hz,4H),0.68(s,3H)
实施例10:实施例9制备的式(1)胆固醇分子探针在促进细胞生长中的应用
促进细胞生长实验。25-羟基胆固醇(25-OHC)可以抑制细胞内胆固醇内源合成途径SREBP通路。在胆固醇饥饿的条件下，25-OHC处理会造成CHO-7细胞死亡。外加的胆固醇可以恢复25-OHC造成的细胞毒性。分别将不同浓度的实施例9制备的胆固醇探针和正常胆固醇加入胆固醇饥饿(细胞饥饿的时间为6天，每48小时换一次培养基即为胆固醇饥饿的时间)的CHO-7细胞培养基中，37℃培养，每48小时更换一次对应的培养基，6天后用结晶紫染色。结果如图1所示，胆固醇探针可以模拟正常胆固醇恢复由25-OHC造成的细胞毒性，并且能够促进细胞生长。
实施例11:实施例9制备的式(1)胆固醇分子探针在促进胆固醇修饰蛋白的剪切成熟中的应用
促进胆固醇修饰蛋白hedgehog的剪切成熟。Hedgehog蛋白在其成熟过程中会发生自剪切，其C端具有催化功能，可以在其N端的末端共价修饰一个胆固醇分子。胆固醇修饰对hedgehog的成熟和功能必不可少。在293T细胞中转染hedgehog蛋白后，将细胞用加入了胆固醇探针的培养基在37℃条件下培养48小时，收集细胞，检测hedgehog蛋白的剪切成熟。结果如图2所示，胆固醇探针可以模拟正常胆固醇促进hedgehog蛋白的剪切成熟。pCMV-3xFlag-Shh代表：CMV promoter介导的N端3xFlag tag Snoic hedgehog表达质粒。1、2、3分别代表Western Blot的不同泳道。
实施例12:实施例9制备的式(1)胆固醇分子探针在鉴定胆固醇修饰蛋白中的应用
鉴定hedgehog蛋白的胆固醇修饰。实施例11中培养细胞后，收集细胞，进行透析，去掉细胞内未和hedgehog蛋白修饰的游离胆固醇探针，结合式(3)所示的炔基biotin，进行铜离子催化的叠氮基-炔基环加成反应。共价连接一个biotin分子在胆固醇修饰的hedgehog蛋白上，再进行两次透析，去掉没有发生环加成反应的游离炔基biotin。再用Avidin Beads对发生胆固醇修饰的hedgehog蛋白进行富集，最后用Western Blot检测。
本发明中，首先对环加成反应进行了优化，对铜离子(CuSO4)，还原剂维生素C钠盐及一价铜离子稳定剂TBTA(Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine)的用量进行了优化，使环加成反应的效率显著提高。如图3所示，第10道泳道的效率最高。如图4所示，发生环加成反应连接一个biotin后，有胆固醇探针共培养的hedgehog蛋白，发生了明显的分子量上浮，并且Avidin Beads特异性富集的也是发生分子量上浮的hedgehog蛋白，说明胆固醇分子探针可以用于特异性鉴定发生了胆固醇修饰的蛋白。本发明胆固醇分子探针的优势在于可以采取非放射性的方法鉴定胆固醇修饰蛋白，具有安全性高，特异性好，灵敏度高等优点。
pCMV-3xFlag-Shh代表：CMV promoter介导的N端3xFlag tag Snoic hedgehog表达质粒。1-14或1-4分别代表Western Blot的不同泳道。Input代表：免疫沉淀时起始的蛋白量。Pellet代表：免疫沉淀下来的蛋白量。
一种胆固醇分子探针及其制备方法和应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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