专利摘要

本发明公开了蛹虫草蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。该蛹虫草蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：1）将蛹虫草子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到蛹虫草水溶性提取物；2）对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述蛹虫草蛋白质提取物。该蛹虫草蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，IC50值分别为10μg/mL，14μg/mL，8μg/mL，并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加；光镜下可观察细胞凋亡形态的改变。

权利要求

1.蛹虫草蛋白质提取物在制备抗肿瘤产品或抗肿瘤细胞产品中的应用，所述蛹虫草蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1)将蛹虫草子实体粉碎后在4℃用水浸提，采用12000g的离心力离心收集水溶性物质得到蛹虫草水溶性提取物；所述蛹虫草子实体为鲜蛹虫草子实体；

2)对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述蛹虫草蛋白质提取物；所述肿瘤为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述肿瘤细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞；

所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行；所述步骤2)中，在4℃对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀。

2.蛹虫草蛋白质提取物在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用，所述蛹虫草蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1)将蛹虫草子实体粉碎后在4℃用水浸提，采用12000g的离心力离心收集水溶性物质得到蛹虫草水溶性提取物；所述蛹虫草子实体为鲜蛹虫草子实体；

2)对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述蛹虫草蛋白质提取物；

所述肿瘤细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞；

所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行；所述步骤2)中，在4℃对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀。

说明书

技术领域

本发明涉及蛹虫草蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。

背景技术

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)，隶属于子囊菌门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属的子囊真菌，是一种珍贵的药用真菌。蛹虫草化学成分和药理作用与冬虫夏草相似，在临床上常替代冬虫夏草入药。蛹虫草具有杀菌、消炎、增强免疫力等功效，不仅能食用，而且还可制成保健品和药品。人工栽培蛹虫草时，往往遇到出草率下降的情况，王贺祥等着重讲述了野生蛹虫草菌株的分离和高产菌株的筛选的方法，以提高人工栽培的商业效率。林金盛等总结了蛹虫草药用机理，并提出了解决蛹虫草产业化栽培瓶颈的几项对策。现代科学论证，蛹虫草中含有多种有效成分，不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值，其中尤以虫草素、虫草多糖等多种生物活性物质的药用价值最为显著。祁波等建立了从蛹虫草中综合提取虫草素和虫草多糖的最佳工艺。采用正交试验对蛹虫草中虫草素和虫草多糖综合提取工艺进行了研究，为进一步开发利用提供有价值的参考数据。姜明兰等用苯酚-硫酸法分别测定了野生和人工栽培的蛹虫草中多糖的含量。结果显示，两种蛹虫草的多糖含量都很高，野生蛹虫草的多糖含量比人工栽培的蛹虫草高许多。江晓路等分别用薄层层析法和高碘酸氧化法测定了蛹虫草、冬虫夏草及其发酵菌丝中腺昔和甘露醇的含量。虫草多糖被医学界认为是非常好的免疫促进剂之一，可增强机体免疫力。目前的研究进展还未发现从蛹虫草子实体中提取蛋白类物质直接杀伤肿瘤细胞的报道。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供具有抗肿瘤活性的蛹虫草蛋白质提取物。

本发明所提供的蛹虫草蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1）将蛹虫草子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到蛹虫草水溶性提取物；

2）对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述蛹虫草蛋白质提取物。

上述步骤1）中，所述用水浸提可为在2-6℃用水浸提10-14小时。所述水可为去离子水。

所述蛹虫草子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。所述干燥的子实体是将新鲜的蛹虫草子实体在常温（如20-25℃）下干燥得到的。

所述新鲜蛹虫草子实体和水的体积比可为1：4-6，如1：4。

上述步骤1）中，可采用离心收集所述水溶性物质。离心收集所述水溶性物质的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。上述步骤2）中，也可采用离心收集所述沉淀。离心收集所述沉淀的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。

上述步骤2）中，在4℃对所述蛹虫草水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀。

上述步骤2）中，所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。

上述制备方法还包括将透析后的半透膜内的液体在3000-9000g（如6000g），离心10-20分钟（如15分钟），收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，制备成蛹虫草蛋白质提取物干粉的步骤。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述蛹虫草蛋白质提取物的用途。

本发明所提供的上述蛹虫草蛋白质提取物的用途，为下述A或B：

A、抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品），其活性成分为上述蛹虫草蛋白质提取物；

B、上述蛹虫草蛋白质提取物在制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品）中的应用。

上述用途中，所述肿瘤可为实体肿瘤。

所述实体肿瘤可为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述肿瘤细胞可为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞。所述肺癌可为肺腺癌，所述肺癌细胞可为肺腺癌细胞。

所述肝癌细胞可为人肝癌细胞，如HepG2细胞；所述乳腺癌细胞可为人乳腺癌细胞，如MCF-7细胞；所述肺癌细胞可为人肺腺癌细胞，如A-549细胞。

上文中，所述蛹虫草具体可为蛹虫草（Cordycepsmilitaris）（安徽）CFCC89535。

本发明的蛹虫草蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，HepG2、MCF-7、A-549细胞的增殖均明显受到抑制，且IC₅₀值分别为10μg/mL，14μg/mL，8μg/mL,并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加；光镜下可观察细胞凋亡形态的改变。说明蛹虫草蛋白质提取物对HepG2、MCF-7、A-549细胞均有显著的抑制增殖作用，可用于制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品。

附图说明

图1为BCA蛋白定量试剂盒制作标准曲线。

图2为MTT法测定蛹虫草蛋白质提取物处理HepG2细胞72h后细胞凋亡情况。

图3为MTT法测定蛹虫草蛋白质提取物处理MCF-7细胞72h后细胞凋亡情况。

图4为MTT法测定蛹虫草蛋白质提取物处理A-549细胞72h后细胞凋亡情况。

图2-图4中，0、4、8、12、16、20分别表示0μg/mL组、4μg/mL组、8μg/mL组、12μg/mL组、16μg/mL组、20μg/mL组；下方的培养板从左至右的列依次为0μg/mL组，4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组；数据结果以平均数±标准差表示（n=3），经单因素方差分析，其中*表示与0μg/mL组比较具有显著性差异（*P<0.05）的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的蛹虫草（Cordycepsmilitaris）（安徽）CFCC89535，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心（中国林业微生物菌种保藏管理中心,ChinaForestryCultureCollectionCenter英文缩写CFCC，简称林业微生物中心）获得。

实施例1、蛹虫草蛋白质提取物的制备

1、制备蛹虫草子实体

将蛹虫草（Cordycepsmilitaris）（安徽）CFCC89535斜面菌种接种到一级种培养基中进行活化，25℃恒温培养，待菌丝长满试管后将其接种到二级种液体培养基中，25℃、160r/min发酵培养10天，将二级液体种接种到装有栽培培养基的罐头瓶中20℃避光的条件下发菌20天，待菌丝发满整瓶后，给予光照并用10℃条件冷刺激，促进转色和子座的形成，出菇条件保持湿度控制在80-90%之间，温度为18-25℃，收集子实体，得到蛹虫草（Cordycepsmilitaris）（安徽）CFCC89535子实体。

其中，该实验所用的培养基如下：

一级种培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，3gKH₂PO₄,10mg维生素B₁,5g蛋白胨，1.5gMgSO₄，1000mL蒸馏水，经121℃，30min高压灭菌。

二级种培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，3gKH₂PO₄,10mg维生素B₁,5g蛋白胨，1.5gMgSO₄，1000mL蒸馏水，经121℃，30min高压灭菌。

栽培培养基：每瓶30g大米,45mL营养液（（MgSO₄0.5g,KH₂PO₄1g,蛋白胨10g,VB₁、VB₂各10mg,水1000mL）,调节pH至7.0，经121℃，1.5h高压灭菌。

2、制备蛹虫草水溶性提取物

用4倍体积的去离子水浸泡步骤1的新鲜蛹虫草（Cordycepsmilitaris）（安徽）CFCC89535子实体2小时，利用组织捣碎机将混合物进行组织破碎至糊状，于4℃浸提（即静置）12h后，12000g离心15min，收集上清溶液，该上清溶液即为蛹虫草水溶性提取物。

3、制备蛹虫草蛋白质提取物

在4℃向步骤2的蛹虫草水溶性提取物中加入(NH₄)₂SO₄至(NH₄)₂SO₄的饱和度为80%，于4℃条件下静置4小时，12000g离心15min，收集沉淀，对该沉淀进行透析。其中，透析采用的半透膜的截留分子量为3kDa，沉淀在半透膜中在流动的自来水中透析5h，再在去离子水中透析12h。将透析后的半透膜内的液体在6000g离心15min，收集上清液，将该上清液置于液氮中冷冻干燥36小时，得到蛹虫草蛋白质提取物，作为抑制肿瘤细胞增殖药物。

实施例2、蛹虫草蛋白质提取物抑制肿瘤细胞增殖实验

1.1供试细胞株

人肝癌HepG2细胞（购自美国ATCC）、人乳腺癌MCF-7细胞（购自美国ATCC）和人肺腺癌A-549细胞（购自美国ATCC）。

1.2实验方法

1.2.1细胞系及细胞培养

人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞按照常规培养方法进行活化和传代。其中，人肝癌HepG2细胞的传代和活化培养基是DMEM-高糖+1%双抗+10%FBS（在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）和胎牛血清（FBS，Hyclone，SV30087.02），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的传代和活化培养基是RPMI1640+1%双抗+10%FBS（在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素、链霉素混合液和胎牛血清（FBS），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。

1.2.2细胞活性检测

采用噻唑蓝比色法（MTT）检测实施例1的蛹虫草蛋白质提取物对人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的抑制活性，具体方法如下：

本实验选用步骤1.2.1的P8代（第8代）细胞，以每孔7×10³个/mL细胞接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，随机选18孔细胞分为6组，一个对照组和5个实验组，分别为0μg/mL组（对照组），4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组。每组三孔细胞。0μg/mL组的每孔细胞中加入200μL无血清培养液，4μg/mL组每孔加入200μL蛹虫草蛋白质提取物浓度为4μg/mL的含蛹虫草蛋白质提取物培养液；8μg/mL组每孔加入200μL蛹虫草蛋白质提取物浓度为8μg/mL的含蛹虫草蛋白质提取物培养液；12μg/mL组每孔加入200μL蛹虫草蛋白质提取物浓度为12μg/mL的含蛹虫草蛋白质提取物培养液；16μg/mL组每孔加入200μl蛹虫草蛋白质提取物浓度为16μg/mL的含蛹虫草蛋白质提取物培养液；20μg/mL组每孔加入200μL蛹虫草蛋白质提取物浓度为20μg/mL的含蛹虫草蛋白质提取物培养液。加完培养液在37℃培养72h后，每孔加入200μLMTT工作液（无菌水配制的5mg/mLMTT溶液：无血清培养液=1:9（体积比）避光继续培养4h，小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加200μLDMSO（二甲基亚砜），震荡孵育10min，使结晶物充分融解。用酶标仪在560nm波长处测吸光度，以对照组的细胞存活率为100%，计算实验组细胞的存活率：实验组细胞存活率=OD（实验组）/OD（对照组）%。各组细胞的凋亡率=100%-各组细胞的存活率。实验重复三次。

试验所有数据采用SPSS12.0（SPSSInc.，USA）统计软件的独立样本t检验处理统计。根据各组细胞的凋亡率计算蛹虫草蛋白质提取物对每种癌细胞的IC50值（使癌细胞的凋亡率为50%的含蛹虫草蛋白质提取物培养液中蛹虫草蛋白质提取物浓度）。

其中，人肝癌HepG2细胞的无血清培养液是DMEM-高糖+1%双抗；4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组中每孔加入的含蛹虫草蛋白质提取物培养液分别是向DMEM-高糖+1%双抗中加入蛹虫草蛋白质提取物母液得到的蛹虫草蛋白质提取物浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL的液体。DMEM-高糖+1%双抗是在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。

人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的无血清培养液是RPMI1640+1%双抗；4μg/mL组，8μg/mL组，12μg/mL组，16μg/mL组，20μg/mL组中每孔加入的含蛹虫草蛋白质提取物培养液分别是向RPMI1640+1%双抗中加入蛹虫草蛋白质提取物母液得到的蛹虫草蛋白质提取物浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL的液体。RPMI1640+1%双抗是在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。

上述蛹虫草蛋白质提取物母液均是用各种细胞的相应无血清培养液溶解实施例1制备的蛹虫草蛋白质提取物，配制成蛋白质含量为100μg/ml的蛹虫草蛋白质提取物水溶液。

其中，蛹虫草蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量的测定方法如下：

1）标准曲线的制作：利用标准样品小牛血清蛋白（BSA）配置成不同浓度的蛋白溶液，采用BCA（北京博迈德科技公司）蛋白定量试剂盒制作标准曲线（图1）。

2）采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛹虫草蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量，该蛋白质含量即为蛹虫草蛋白质提取物水溶液中蛹虫草蛋白质提取物浓度。

2实验结果及分析

2.1蛹虫草蛋白质提取物抗肿瘤活性检测结果

MTT法测定结果表明，实施例1的蛹虫草蛋白质提取物对三株癌细胞均有抑制作用，抑制率均表现出剂量依赖性，与对照组相比，随着蛹虫草蛋白质提取物浓度的增加，HepG2细胞、MCF-7细胞和A-549细胞的凋亡率均增高，且IC50值分别为10μg/mL，14μg/mL，8μg/mL；光镜下可观察到细胞凋亡形态的改变。具体抑制效果见表1。

表1蛹虫草蛋白质提取物对三株癌症细胞体外抑制率

蛹虫草蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。