专利摘要

本发明提供了带阳离子的聚酯酰胺(PEA)基底水凝胶，水凝胶通过不饱和L-精氨酸基底聚酯酰胺(UArg-PEA)前体、聚醚DA前体、或在预先设定前体成份比例的UArg-PEA和聚醚DA前体组合制备；聚醚DA/UArg-PEA混合水凝胶和纯聚醚DA基底水凝胶是温敏、生物可降解的，纯UArg-PEA基底水凝胶是生物可降解但不温敏的；UArg-PEA基底、聚醚DA基底和混合水凝胶通过不饱和精氨酸基底PEA盐和/或不饱和聚醚酸聚合体合成；不饱和聚醚酸聚合体由将聚醚酸与丙烯酰氯反应合的，聚醚酸两个链末端提供官能乙烯基团；水凝胶用于携带和/或释放分子或化合物如生物活性化合物，在生物医学作生物载体使用。

说明书

技术领域

本发明涉及聚酯酰胺(PEA)和聚醚基底的水凝胶。本发明还涉及合成聚酯酰胺(PEA)和聚醚基底的水凝胶的方法。本发明还涉及合成聚酯酰胺(PEA)和聚醚基底的水凝胶用于携带和/或释放生物活性分子或化合物。

背景技术

水凝胶是指某些能够在水过量的情况下和在湿润的状态下吸附大量水分而膨胀的物料(Ishihara，J.W.Y.K.K.W.N.K.，Hydrogels，Encyclopedia of Biomaterialsand Biomedical Engineering 2004，790-801)。水凝胶通常包含有通过化学方法和/或物理方法交联得到的三维聚合物网。水凝胶具有多种的特质被应用于生物材料和生物医学工程实践中，包括：药物传递载体、组织工程支架和生物医学装置。

作为药物载体，水凝胶可以实现与酶或与非酶同步降解，对刺激作出反应(例如通过pH或温度)后释放药物。广泛应用的医疗装置不但包括用完即弃的物料，如针筒、取样袋和取样管，而且还包括人工器官，如血管。最有发展潜力的用途可包括晶体、肌肉模型和人工软骨。因为其透明度的关系，水凝胶制品主要应用在隐形眼镜中。其中聚(2-羟乙基丙烯酸甲酯(HEMA))，是首次亮相的一种软生物材料，其是由Otto Wichterle实现的(Wichterle，O.；Lim，D.，Hydrophilic Gels forBiological Use.Nature 1960，185，(4706)，117-118)。

最令人满意的是，药物可在凝胶受到刺激下收缩或膨胀时释放。可以使用聚(N-异丙基丙烯酰胺)[poly(NIPAAm)]水凝胶(Schild，H.G.，Poly(N-Isopropylacrylamide)-Experiment，Theory and Application.Progress in PolymerScience 1992，17，(2)，163-249)。然而，当水温超过32℃时(这是熟知的最低临界溶解温度(LCST))聚合物链会脱水，PoIy(NIPAAm)就变为不溶于水。因为其具有这种特性，因此聚凝胶(NIPAAm)在32℃以下膨胀，但在32℃以上收缩，显示出一种体积变化。这种体积变化在生物医学应用中是不符合需要的，如在水凝胶基底药物传递系统中。

第二部份，或本申请内任何部份，内任何参考的引证或识别都不应考虑为承认这些参考是本发明的现有技术。

发明内容

因此，本技术领域需要一种在水溶液中，且在覆盖的宽阔温度范围内和/或在响应热循环的情况下，具有半可逆温敏膨胀性能可使生物降解，且适合生物的水凝胶。本技术领域也需要具有阳离子特征的水凝胶，其可以通过静电吸引有阴离子的生物和/或生物化学的物种(例如阴离子的生长因子和细胞因子、组织工程和修补的细胞)。本发明提出一种聚酯酰胺(PEA)基底水凝胶，以解决上述问题。所述PEA-基底水凝胶是阳离子水凝胶，可对生物降解，并在水溶液中以及在覆盖宽阔温度范围内和/或在响应热循环的情况下，体现出半可逆温敏膨胀的性能。在一实施方案中，所述水凝胶是基于L-精氨酸不饱和聚酯酰胺(″UArg-PEA″或″Arg-UPEA″)的聚合物。在一个实施方案中，所述水凝胶是基于聚醚DA的聚合物。在另一实施方案中，所述水凝胶是基于聚醚DA和UArg-PEA聚合物的混合水凝胶。在另一实施方案中，所述聚醚DA基底和混合水凝胶有温敏性质。在一具体实施中，所述温敏性质来自所述水凝胶的聚醚DA成分。本发明还提出UArg-PEA、聚醚DA和混合水凝胶的聚合物前体。

本发明还提出一种合成UArg-PEA基底水凝胶、聚醚DA基底水凝胶和混合水凝胶的方法。在一实施方案中，所述UArg-PEA基底水凝胶、聚醚DA基底水凝胶和混合水凝胶可以由两个水溶性聚合物：不饱和精氨酸基底PEA盐和/或不饱和聚醚酸反应所制备。

在另一实施方案中，不饱和聚醚酸通过从市面上买到的聚醚酸与丙烯酰氯反应制得，以在聚醚酸链的两端加入功能性乙烯基基团来合成的。

本发明还提出UArg-PEA基底水凝胶、聚醚DA基底水凝胶和混合水凝胶来携带和/或释放分子或化合物的使用方法。所述UArg-PEA基底水凝胶、聚醚DA基底水凝胶和混合水凝胶可以在多种生物医学领域中用作生物载体。本发明所提供的水凝胶可以用于携带和/或释放生物活性的分子或化合物，包括但不限于养份、药品、药物、肽、多肽、寡核苷酸和多核苷酸。

在一具体实施例中，本发明提出一种合成物，其包含不饱和精氨酸基底聚酯酰胺基底(UArg-PEA)聚合物，具有化学结构式如结构式(I)和图1所描述：

结构式(I)；

其中，y表示亚甲基(-CH2-)基团在两个相邻酯的数目，y＝1-20。所示下标n代表重复单位的数目，其大约为5到600。

在另一实施方案中，本发明提出一种合成物，包含不饱和聚醚二丙烯酸(聚醚DA)聚合物，具有化学结构式如结构式(II)和图2所描述：

结构式(II)；

其中，m是聚氧化丙烯部份的数目和，m＝10-90，而n是聚氧化丙烯区段的数目和，n＝1-150。

在另一实施方案中，提出的一种合成物包括：不饱和Arg-PEA(UArg-PEA)聚合物，其具有如结构式(I)所描述的化学结构式；不饱和聚醚DA聚合物，具有如结构式(II)所描述的化学结构式。

本发明提出一种水凝胶，其具有如结构式(I)或(II)所描述的化学式的聚合物。所述水凝胶可以包含多个已交联的聚合物；其中，所述聚合物在聚合和交联过程之前具有如结构式(I)或(II)所描述的化学式。在所述水凝胶的一个实施方案中，所述聚合物在聚合和交联过程之前具有如结构式(I)所描述的化学式。在所述水凝胶的一个实施方案中，所述聚合物在聚合和交联过程之前具有如结构式(II)所描述的化学式。在另一实施方案中，所述水凝胶是一种混合水凝胶，其中，所述聚合物在聚合和交联过程之前具有如结构式(I)或(II)所描述的化学式。在另一个实施例中，所述水凝胶具有温敏性能。

在另一实施方案中，本发明提出一种合成不饱和聚醚DA聚合物的方法，包括将聚醚酸与丙烯酰氯化物反应，其中功能乙烯基团是由两个聚醚酸的链末端提供的。所述方法包括：a)将聚醚酸溶液与酸受体如三乙胺或(DMAP)在每个所述聚醚酸上的-OH基团摩尔过量的浓度下反应；b)将所述聚醚酸溶液与丙烯酰氯，在每个所述聚醚酸上的-OH基团摩尔过量的浓度下反应，生成聚醚酸(聚醚DA)的丙烯酸双酯。在另一实施方案中，所述聚醚DA产物可以用沉淀法重新获得。

在另一实施方案中，本发明提出一种水凝胶的合成方法，包括：提供多个具有如结构式(II)所描述的化学式的不饱和聚醚二丙烯酸的聚醚DA聚合物；并将所述聚醚DA聚合物聚合和交联。在一具体的实施例中，所述方法可以包含起始因子，其中所述聚醚DA聚合物聚合和交联的步骤在有起始因子的情况下执行，光聚合所述聚醚DA聚合物

在另一实施方案中，参见图2本发明提出一种合成UArg-PEA聚合物的方法。所述方法可以包括：将不饱和单体型二对硝基苯富马酸NF和具有酸受体(如三乙胺(Et3N)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、碳酸钠或碳酸氢钠)和具有二甲亚砜(DMSO)、或二甲基甲酰胺(DMF)、或二甲基乙酰胺(DMA)的有机溶剂一同反应。所述Et3N、DMAP、碳酸钠或碳酸氢钠在合成UArg-PEA时的缩聚步骤中位酸受体。

在另一实施方案中，本发明提出一种合成水凝胶的方法，包括：提供以多个具有结构式(I)所描述的化学式的UArg-PEA聚合物；聚合和交联所述UArg-PEA聚合物。在一具体实施例中，所述方法可以包含起始因子，其中，所述UArg-PEG聚合物在有起始因子的情况下执行，光聚合所述UArg-PEA聚合物。

本发明还提出一种合成混合水凝胶的方法。所述方法可以包含：提供具有结构式(I)所描述的化学式的UArg-PEA聚合物；提供具有结构式(II)所描述的化学式的聚醚DA聚合物；将所述UArg-PEA和聚醚DA聚合物聚合和交联。在一具体的实施例中，所述方法可以包括起始因子，其中所述UArg-PEA和聚醚DA聚合物的聚合和交联步骤在有起始因子的情况下执行，光聚合所述聚合物。

在另一实施方案中，提出了一种控制分子或化合物释放的方法。所述方法可以包括：提供本发明的水凝胶，其中分子或化合物是装载在所述水凝胶内。

所述分子或化合物可以是生物活性分子或化合物。在具体的实施例中，所述分子或化合物可以是营养物、药品、药物、肽、多肽、寡核苷酸或多核苷酸。

本发明还提出一种在目标范围内直接释放分子或化合物的方法。所述方法可以包含：提供一本发明的水凝胶，所述分子或化合物是装载在所述水凝胶内，所述水凝胶是嵌入目标范围内的。

在另一实施方案中，本发明还提出一种控制释放分子或化合物的装置。

在另一实施方案中，本发明提出一种在目标范围内直接释放分子或化合物的装置。

附图说明

本说明书引用附图在此描述本发明，其中，贯通各个不同视图的相似参考字符代表相似的元素。应当理解的是，本发明在一些例子中的不同方面可以夸大地展示或放大以使本发明易于明白。

图1是UArg-PEA(式I)的化学结构示意图，y代表在diol(即二醇)区段中亚甲基(-CH2-)基团的数目，范围可由1到20；下标n代表重复单位的数目，范围大约为5到600；

图2是聚醚酸合成聚醚DA(式II)的化学结构示意图，m是聚氧化丙烯区段的数目，范围可由10到90；n是聚氧化乙烯区段的数目，范围可由1到150；图2显示两个具体的聚醚DA大分子单体，F127DA(″F127-DA，″m＝62和n＝95)及F68DA(″F68-DA，″m＝31和n＝82)的合成；

图3是显示UArg-PEA和聚醚DA之间可能的UV交联方案示意图(详情见分段6.1)；

图4是显示F127DA、F127、F68DA和F68的FTIR图谱(详情见分段6.1)；

图5是显示纯聚醚DA水凝胶的膨胀特性图(详情见分段6.1)；

图6是F68DA/UArg-PEA水凝胶在干燥、湿润情况下，以及在水中膨胀后体积变化图(详情见分段6.1)；

图7是显示一系列水凝胶的膨胀特性与温度函数图(详情见分段6.1)；

图8是显示不同聚醚水凝胶的震动膨胀特性与温度函数图；其中，F68DA/2U-Arg-y-S是190/10w/w(详情见分段6.1)；

图9是显示F68DA在两个不同的温度下膨胀图(详情见分段6.1)；

图10是显示F68DA/U Arg-PEA水凝胶(90/10w/w)的SEM影像图；其中，A2、A3和A4＝2U-Arg-2、3和4，Size bar is 3μm(详情见分段6.1)；

图11是显示负载了太平洋紫杉醇7日之后的水凝胶结构示意图；包括A)F68DA；B)F127DA；C)F68DA/2U-Arg-3-S(90/10)(详情见分段6.1)；

图12是显示没有胰蛋白酶的不同的水凝胶释放紫杉醇的函数图：其中，F68DA/2U-Arg-2、R1＝50/50、R2＝75/25′R3＝90/10、R4＝100/0(详情见分段6.1)；

图13是显示不同的水凝胶释放DNA的函数图(详情见分段6.1)

图14是以比较F68DA和F127DA，显示聚合物的亲水性在IL-12释放模式上的效果图(详情见分段6.2)；

图15是以比较F68DA和有5％起始因子的F68DA/2U-A-3(3/1)，显示聚合物的亲水性在IL-12释放模式上的效果图(详情见分段6.2)；

图16是以比较F68DA和有1％起始因子的F68DA/2U-A-3(3/1)，显示聚合物的亲水性在IL-12释放模式上的效果图(详情见分段6.2)；

图17是以比较分别具有1％和5％起始因子的样本含量，显示起始因子的含量的效果图(详情见分段6.2)；

图18是显示2U-Arg-3的含量对IL-12释放模式的影响效果图(详情见分段6.2)；

图19是显示不同类型的2U-Arg-y(y＝2，3，4)在IL-12释放模式中的效果图；其中，所有F68DA/2U-Arg-y的比例为50/50(详情见分段6.2)；

图20是显示精氨酸基底的聚酯酰胺单体的合成图；其中，1)a为二羧酸的二对硝基苯酯，三个饱和类型：NSu，NA和NS；1)b.一个不饱和类型：NF(详情见分段5.2)；

图21是显示精氨酸基底的聚酯酰胺单体的合成图；其中，2)a为双(L-精氨酸)烯烃基二酯的四对甲苯磺酸盐，其包括三种类型：Arg-2-S、Arg-3-S和Arg-4-S；2)b为双(L-精氨酸)烯烃基二酯的二对甲苯磺酸二盐酸盐，Arg-3-S-C1(详情见分段5.2)；

图22是不饱和类型的单体NF(见图20)和精氨酸甲苯磺酸或盐酸酯盐合成UArg-PEA聚合物的合成图，合成产物的结构式是图1所示的结构式(详情见分段5.2)；

图23是精氨酸基底聚酯酰胺Arg-PEAs)合成图。

具体实施方式

本发明提出的是带阳离子的、温敏的和生物可降解的水凝胶组合物，其可以通过聚醚三嵌段共聚物和精氨酸基底不饱和聚酯酰胺(UArg-PEA)制备产物体现。

本发明提出带阳离子的聚酯酰胺(PEA)基底水凝胶。所述水凝胶是通过不饱和L-精氨酸基底聚酯酰胺(UArg-PEA)前体、聚醚DA前体、或在预先设置好前体组合物比例的UArg-PEA和聚醚DA前体的结合任一种制备的。混合聚醚DA/UArg-PEA混合水凝胶和纯聚醚DA基底水凝胶两者皆是温敏和生物可降解的，而纯UArg-PEA-基底水凝胶是生物可降解的但不是温敏的。UArg-PEA-聚醚DA-基底混合水凝胶可以通过不饱和精氨酸基底PEA盐和/或不饱和聚醚酸聚合物所合成。不饱和聚醚酸聚合物可以由将聚醚酸与丙烯酰氯反应合成，聚醚酸的两个链末端提供功能性乙烯基团。

UArg-PEA基底的和聚醚DA基底的混合水凝胶为用于携带和/或释放分子或化合物，以及可以作为多种生物医学应用的生物载体。所述水凝胶为用于携带和/或释放的分子或化合物，包括(但不限于)：营养物、药品、药物、肽、多肽、寡核苷酸和多核苷酸。它们可以在体内有多种应用(例如药物治疗、基因治疗或组织工程)，用于浓缩或捕获肽、多肽或多核苷酸，并传送使之进入目标细胞或组织。在一具体实施例中，本发明所述的水凝胶可以用于携带多核苷酸(例如DNA)和细胞因子(例如IL-12)。本发明还提一种水凝胶携带生物分子的使用方法。

本发明还提出一种PEA-基底水凝胶的合成方法。在一实施方案中，所述PEA-基底水凝胶可以由两个可溶于水的聚合物：不饱和精氨酸基底PEA盐和聚醚三嵌段共聚物(不饱和聚醚酸)合成。在另一实施方案中，所述PEA-基底水凝胶可以由不饱和聚醚酸(可以从将市面所购得)与丙烯酰氯反应合成，其中，不饱和聚醚酸的两个链端提供功能性乙烯基团。

本发明的详细描述划分为以下小分段，以便清晰地公开本发明，但并不限制其范围。

一、UArg-PEA和聚醚DA聚合物

本发明提出精氨酸基底的不饱和聚酯酰胺和聚醚三嵌段共聚物，可以用作制备水凝胶的原材料。本发明还提出不饱和聚酯酰胺和聚醚三嵌段共聚物，其中精氨酸基底的不饱和聚酯酰胺为主链中带有酯基、酰胺基和L-精氨酸基的聚合物。它们可溶于水并可对生物进行降解，并因为带有L-精氨酸基显正电性。

在一实施方案中，提出了一种包括不饱和精氨酸基底的聚酯酰胺基底(UArg-PEA)聚合物的合成物，其具有如结构式(I)和图1所描述的化学式：

结构式(I)；

其中，y是指在两个相邻酯之间的亚甲基(-CH2-)基团的数目，其中y＝1至20。下标n是指重复单位的数目，范围大约为5到600。

在具体的实施例中，所提出的UArg-PEA聚合物的化学结构式如图1所示，UArg-PEA(2U-Arg-y-S)，其中y＝2、3或4，相当于2U-Arg-2-S、2U-Arg-3-S和2U-Arg-4-S。

聚氧乙烯-b-聚环氧丙烷-b-聚氧乙烯(也称为聚醚聚合物或泊洛纱姆)的三嵌段共聚物是本技术领域熟知的，作为生物适合的聚合物被广泛地应用。

聚醚聚合物属于高分子表面活性剂的类别，其拥有与生物膜互相作用的能力。它们属于嵌段共聚物家族，由聚氧化丙烯(PEO)和聚氧化丙烯(PPO)所组成，其中PPO提供中央疏水性核心，通过甲基团与疏水物质反应而使之溶解。聚醚聚合物具有极佳的水溶性、低毒性和免疫原性，并且经FDA批准用于体内。

在稀释情况下的水溶液中，聚醚聚合物自我聚合而形成分子团(IshiharaJWYKKWNK.Hydrogel，Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering2004：790-801；Wichterle O，Lim D.Hydrophilic Gels for Biological Use.Nature 1960；185(4706)：117-118)。在大约高于20％(w/v)的浓度下，它们显示出温敏溶胶-凝胶转换特性(Schild HG.Poly(N-Isopropylacrylamide)-Experiment，Theoryand Application.Progress in Polymer Science 1992；17(2)：163-249)。所述聚醚水凝胶的温敏性质可以归于LCST特性，即主要因为在聚合物结构上的亲水基和疏水基有微妙的平衡(Kabanov AV，Nazarova IR，Astafieva IV，Batrakova EV，AlakhovVY，Yaroslavov AA，Kabanov VA.Micelle Formation and Solubilization ofFluorescent-Probes in Poly(Oxyethylene-B-Oxypropylene-B-Oxyethylene)Solutions.Macromolecules 1995；28(7)：2303-2314)。

在本发明的一个实施方案中，所述聚醚聚合物的两个末端可以合成，使得它们形成接支双键以赋予交联的能力。所述PEO通过嵌段使所述聚合物具有可水溶性，虽然醚氧与水的氢键相互作用或许倾向在全链上发生作用(Guo，K.；Chu，C.C；Chkhaidze，E.；Katsarava，R.，Synthesis and characterization of novel biodegradableunsaturated poly(ester amide)s.Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry2005，43，(7)，1463-1477)。聚醚DA(PluronicDA)在其两个链末端上具有双键，可作为混合水凝胶的理想构成要素，使UArg-PEAs具有温敏度并增加混合水凝胶释放药物的多样性。

聚醚聚合物或泊洛纱姆是以三位数字的命名系统来分类的，其中首两个位的数字乘以100得出憎水物的大约分子量，而最后的一个位数字乘以10得出亲水物的百分比(以分子量计算)。在北美洲，它们也称为″聚醚″(pluronics)。其中，前面的字母F、P或L表示所述聚合物以薄片、糊状物或液体形式存在。泊洛纱姆是不会被身体代谢并经肾脏排出。它们被认为是惰性材料，而食品及药物管理局(FDA)将之表列在不活跃成份表中。聚醚聚合物也具有在生理温度中的较低的临界溶解温度(LCST)。最常用的泊洛纱姆、F127和F68，在生理温度中是会热凝胶化的(Nystrom，B.；Walderhaug，H.，Dynamic viscoelasticity of an aqueous system of apoly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)triblock copolymerduring gelation.Journal of Physical Chemistry 1996，100，(13)，5433-5439；Malmsten，M.；Lindman，B.，Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions.Macromolecule 1992，25，(20)，5440-5445)。

在一实施方案中，提出了一种包括不饱和聚醚二丙烯酸(聚醚DA)聚合物的合成物，其具有如结构式(II)和图2所描述的化学式：

结构式(II)

其中，m是聚氧化丙烯区段的数目，m＝10至90，而n是聚氧化乙烯区段的数目，n＝1-150。

本发明所提供的UArg-PEA聚合物和聚醚DA聚合物可水溶。UArg-PEA的主链中具有一个＞C＝C＜双键，因此其可以在UV照射下自我聚合，或UArg-PEA与聚醚DA聚合和交联。在最后的事例中，UArg-PEA与聚醚DA聚合和交联所生成的水凝胶为混合水凝胶。其交联过程如图3所示。

二、聚合物前体的合成以制备水凝胶：L-精氨酸基底不饱和聚酯酰胺(UArg-PEA)聚合物和聚醚二丙烯酸盐(聚醚DA)聚合物

以下对带正电荷的水溶性聚酯酰胺的合成和特性进行描述。

原材料包括：L-精氨酸(L-Arg)、甲苯磺酸一水合物、癸二酰氯、己二酰氯，乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)和对硝基苯酚(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)。以上所述的原材料不必进一步纯化即可使用。另外原材料还包括三乙胺(Fisher Scientific，Fairlawn，NJ)和溶剂。其中，三乙胺可以用氢化钙以回流方法干燥，然后蒸馏。溶剂可以从市面上买到，其包括有如甲苯、乙酸乙酯、丙酮、2-丙醇和二甲基亚砜(DMSO)，(例如VWR Scientific，West Chester，PA)，在使用前通过标准方法进行纯化。

可以利用一般的PEAs合成方法来合成Arg-PEAs，参见图23，合成方法如下：由双(L-精氨酸)-α，ω-亚烃基二酯类转化为二对甲基苯磺酸盐(1)、由二羧酸转化为二对硝基苯酯(2)；将(1)溶液和(2)溶液混合反应合成PEAs(3)。合成这些单体的方法也有在美国临时申请号为60/961,876由Chu等人在2007年7月24日申请的和美国专利申请号12/177,628标题为″生物可降解的带阳离子聚合物基因转移组合物及其使用方法″，由Chu等人在2008年7月22日申请的专利申请文件(Atty.Docket No.MEDIV3040-4/CCTEC D-4074-3)中描述，其整体引入作参考。

1、由双(L-精氨酸)-α，ω-亚烃基二酯类制备二对甲基苯磺酸盐

在对甲磺酸一水(0.04mol)、L-精氨酸(0.02mol)和1，3-丙二醇(0.01mol)的混合溶液中加入甲苯(80ml)并进行加热回流。固液混合物加热至120℃进行反应，并加热回流24小时。生产1.08mL(0.06mol)的水，其利用迪安-斯塔克回流冷凝器进行收集。然后将反应混合物(从不完全溶解的)冷却至室温并回收甲苯。

剩余的反应混合物干燥后通过2-丙醇进行两次沉淀纯化，其纯化如下：将剩余的混合物加入装有2-丙醇的500mL圆底烧瓶，并加热至100℃进行回流，直至所有混合物溶解，然后转为油浴加热过夜，之后转移到冷冻器形成白色粘块沉淀物；将沉淀物进行沉淀纯化为晶体，晶体通过真空干燥后再纯化一次得到最终产物。所得产物为白色粉末的二对甲基苯苯磺酸盐，最终产物的产量最高可达90％(～90％)。

2、由二羧酸合成二对硝基苯酯

二对硝基苯己二酸(熔点123-124℃)可以在0℃至5℃的情况下通过将己二酰氯(1mol)与溶解在丙酮中的对硝基苯酚(2.01mol)，以及三乙胺(2.01mol)进行混合反应制得。将二对硝基苯己二酸转化的二对硝基苯酯通过乙腈重复再结晶进行纯化。

3、溶液缩聚(1)和(2)

将上述溶液(1)和溶液(2)加入装有1.2M的干N，N-二甲基乙酰胺溶液的反应器，将反应器在烘炉中加热至65℃后保持恒温，搅拌过夜得到粘性反应溶液；将粘性反应溶液通过玻璃过滤器进行过滤，然后倒进蒸馏水中，得到焦油状沉淀物；焦油状沉淀物在室温下用蒸馏水漂洗3至7日转变为非粘性固体，或仍然包含残留对硝基苯酚，其为溶液缩聚作用产生的低分子量副产品，类似于橡胶的聚合物。为获得没有对硝基苯酚的Arg-PEA，将所述聚合物加入到含有甲醇(10％v/w)和过量(以容量计算为甲醇的5-20倍)|的乙酸乙酯混合溶液中。将混合物的上清液轻轻倒出，下层的沉淀聚合物再以新鲜乙酸乙酯(起始容量的乙酸乙酯的40-50％)清洗三至四次，最后在50-60毫米汞柱的降低压力下干燥至恒重。干燥之后，所述聚合物将会变成似角质的，在容器中通过氯仿溶剂溶解，然后转移至玻璃皿上。所得的聚合物可以用核磁共振频谱来判断其特征，而平均分子量可以用凝胶色谱净化法(GPC)判断。

三、不饱和L-精氨酸基底聚酯酰胺(UArg-PEA)聚合物的合成

图20和21显示精氨酸基底聚酯酰胺单体的合成过程。

图20(Ia)显示三种饱和类型的合成：二羧酸的二对硝基苯酯，丁二酸二对硝基苯酯(NSu)，x＝2；己二酸二对硝基苯酯(NA)，x＝4；癸二酸二对硝基苯酯(NS)，x＝8。一个不饱和类型：反丁烯二酸二对硝基苯酯(NF)，x＝2的合成。例如，丁二酸二对硝基苯酯(NSu)可以通过丁二酰氯(0.03mol，3.2mL)在有三乙胺(0.063mol)的存在下与在丙酮中的对硝基苯酚(0.0603mol)互相反应生成，所述对硝基苯酚和三乙胺混合丙酮溶液(100mL)维持在0C。丁二酰氯可先通过50mL的丙酮进行稀释，然后在0℃条件边搅拌边滴加冷冻溶液并保持两小时，然后在室温条件下过夜，得出丁二酸的二对硝基苯酯；可以在蒸馏水中沉淀，然后在室温下真空干燥，在最后由乙酸乙酯结晶三次。

图21显示精氨酸基底聚酯酰胺单体的合成。图21(2a)显示三种双(L-精氨酸)亚烃基二酯的四对甲苯磺酸盐：Arg-2-S、Arg-3-S和Arg-4-S。图21(2b)显示双(L-精氨酸)亚烃基二酯的二对甲苯磺酸二盐酸，Arg-3-S-Cl。可以制备如下的单体，其中，y是亚甲基的数目，可以由2到4。双L-精氨酸)乙烷二酯的四对甲苯磺酸盐Arg-2-S，y＝2；双(L-精氨酸)丙烷二酯的四对甲苯磺酸盐，Arg-3-S，y＝3；双(L-精氨酸)丁烷二酯的四对甲苯磺酸盐，Arg-4-S，y＝4；双(L-精氨酸)丙烷二酯的二对甲苯磺酸二盐酸盐，Arg-3-S-Cl，y＝3。

例如，精氨酸二酯的甲苯磺酸可以在甲苯中回流(沸点110℃，80ml)，在对甲苯磺酸一水(0.04mol)的存在下将Arg-3-S、L-精氨酸(0.02mol)和1，3-丙二醇(0.01mol)进行缩合反应制得，参见图21，异相固态-液态反应混合物可以加热(例如至120℃)回流(例如回流24小时)并收集反应产物(例如通过迪安-斯脱克装置进行)。所述反应后的混合物冷却至室温后倒出溶剂(例如甲苯)。剩余混合产物干燥后，可以用重复沉淀方法(例如在2-丙醇中三次)进行纯化。

所述反应混合物在回流时(例如在100℃)可以完全溶解在2-丙醇中。所获得的透明溶液然后可以冷却至室温和/或冰冻以促进进一步的沉淀。然后倒出2-丙醇，而剩余的白色粘块通过真空干燥得到粉末状最终产物。

用于合成精氨酸二酯的二对甲苯磺酸二盐酸盐的起始精氨酸单体可以是L-精氨酸盐酸盐而不是L-精氨酸。因为平衡离子Cl-已经依附在所述精氨酸单体上，对甲苯磺酸和精氨酸盐酸盐的反应比例为1∶1。所有其它的合成步骤可以如上述般进行。

表1显示饱和精氨酸基底PEAs(SArg-PEAs)和不饱和精氨酸基底PEAs(UArg-PEAs)可以由溶液缩聚单体(例如Arg-2-S、Arg-3-S、Arg-4-S、Arg-3-S-Cl和NSu、NA、NS和NF)，以不同的合成的组合来制备的。SArg-PEAs不可以交联而形成水凝胶，然而UArg-PEAs可以聚合和交联而形成如这里描述的水凝胶。

表1，表示用不同单体的组合合成的聚合物

本发明提出合成UArg-PEA聚合物的方法，参见图22。图22显示不饱和类型的单体反丁烯二酸二对硝基苯酯(NF在图20显示)和精氨酸甲苯磺酸(或盐酸)酯盐反应合成UArg-PEA聚合物。所述NF和所述精氨酸甲苯磺酸(或盐酸)酯盐是与三乙胺(Et3N)(或4-二甲氨基吡啶(DMAP)，碳酸钠或碳酸氢钠)和与二甲亚砜(DMSO)(或二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(DMA))的有机溶剂反应。所述Et3N、DMAP、碳酸钠或碳酸氢钠在合成UArg-PEA的缩聚步骤中作为酸受体。

三个可以合成和用作制备水凝胶的聚合物前体的示例性UArg-PEAs在表2中作概括。根据在此公开的合成和特性判断方法，其它可以用作制备水凝胶的聚合物前体的UArg-PEAs可以由熟练的从业者判断。

表2，供制备水凝胶之用，可以合成为聚合物前体的示例性UArg-PEAs

聚醚DA聚合物的合成

聚醚DA聚合物可以如图2所示进行合成。方法包括：(a)将聚醚酸溶液与酸受体(如三乙胺或DMAP)在每个所述聚醚酸上的-OH基团摩尔过量的浓度下反应；(b)将所述聚醚酸溶液与丙烯酰氯化物，在每个所述聚醚酸上的-OH基团摩尔过量的浓度下反应，生成聚醚酸(聚醚DA)的丙烯酸双酯。在另一实施方案中，所述聚醚DA产物可以用沉淀法重新获得

例如，聚醚酸(例如F127或F68)加热并搅拌的条件下完全溶解于苯。当所述溶液冷却至室温之后，三乙胺在每个所述聚醚酸上的-OH基团摩尔过量的浓度下加入所述聚醚酸溶液中。然后丙烯酰氯化物，在每个所述聚醚酸上的-OH基团摩尔过量的浓度下加入所述聚醚酸溶液中以生成聚醚酸的丙烯酸盐二酯。所述混合物可以在氮气大气下搅拌(例如在室温过夜)。在反应过程中所产生的不能溶解的三乙胺盐通过过滤方法去除，而聚醚DA产物通过在冷冻的己烷中沉淀和过滤方法收集。进一步的纯化可以重复地在苯中再溶解和在冷冻的己烷中再沉淀中进行。所述聚醚DA聚合物可以在室温下的真空烘炉中干燥，并储存在4℃下以供以后使用。

聚醚F127二丙烯酸盐(F127DA)和F68二丙烯酸盐(F68DA)的示例性合成如下：将25g的F127(2.08mmol)在氮气大气中溶解于苯并通过装有活化分子筛的索式萃取器通过溶剂回流干燥。4小时后，所述溶液慢慢冷却至室温然后以冰浴冷却至0℃。在滴液漏斗中先加入1.2mL的三乙胺(8.63mmol，2equiv.per OH group)，然后加入20mL的二氯甲烷，最后是稀释在20ml的二氯甲烷内的0.5新鲜蒸馏的丙烯酰氯化物(6.24mmol，1.5equiv.per OH group)。所述混合物搅拌12小时，然后将已沉淀的三乙基氯化铵滤去并在旋转蒸发器将溶剂蒸发。所得出的粘性油溶解于二氯甲烷，以水清洗，用硫酸钠干燥，而最后在冷乙醚中沉淀。100％转化(从1HNMR资料)。产量为80％。FT-IR：2990-2790(n C_H)，1724(n C-O)，1467(ds CH2)，1 342，1 279，1 242，1 097(nas C_O_C)，962，841(ns C_O_C)cm 1.1HNMR(CDCI3)：d1/4 1.1(m，190H，PPG甲基团63个单体单位)，3.4(m，63H，PPG次甲基团63个单体单位)，3.5(m，124H，PPG亚甲基团62个单体单位)，3.65(m，818H，PEG炼质子1/4204个单体单位)，4.3(t，2H，_CH2_CH2_O_CO_CH-CH2)，5.8(dd，2H，CH2-CH_COO_)，6.15和6.4(皆为dd，方案1，图202H，CH2-CH_COO_)。

四、L-精氨酸基底不饱和聚酯酰胺(UArg-PEA)基底的水凝胶、聚醚二丙烯酸(聚醚DA)基底水凝胶、混合聚醚DA/UArg-PEA基底水凝胶和水凝胶的合成。

提出UArg-PEA基底、聚醚二丙烯酸(聚醚DA)基底和混合水凝胶。这些水凝胶为带阳离子、温敏和生物可降解的。还提出上述水凝胶的合成方法。

混合水凝胶是指一种水凝胶系统，其包含两种或更多种截然不同种类的分子构成要素。在一个具体实施例中，提供了一种制造混合水凝胶的组合物，其包含UArg-PEA和聚醚DA聚合物。在另一实施方案中，提供了一种混合水凝胶，其包含聚合了的和交联了的UArg-PEA和聚醚DA聚合物。聚合过程和交联后，所述UArg-PEA和不饱和聚醚DA聚合物部份或全部变成饱和。如此，当UArg-PEA和聚醚DA聚合物前体反应而形成水凝胶，会丧失它们的不饱和特性，即UArg-PEA前体在水凝胶内变成SArg-PEA和聚醚DA前体在水凝胶内变成聚醚酸。

UArg-PEA和聚醚二丙烯酸(聚醚DA)聚合物可以在胶束凝胶状态下合成和交联以形成水凝胶。在一实施方案中，所述交联可以用光聚作用或UV交联作用来实现。在另一实施方案中，可以通过使用化学交联剂交联来达成交联，例如任何具有双硫代(-SH)基团的化合物，可以与具有双键的不饱和聚醚DA或UArg-PEA聚合物反应。

聚醚DA基底水凝胶通过聚醚DA聚合物与少量可水溶的起始因子作光聚合来制备的。UArg-PEA基底水凝胶可将UArg-PEA聚合物与少量可水溶的起始因子作光聚合制备。聚醚DA/UArg-PEA基底混合水凝胶可将不同重量比例的两种聚合物制备，如将聚醚DA和UArg-PEA在少量可水溶的起始因子下作光聚合来制备。上述起始因子为本技术领域熟知的，其使用的量大概总量的1％到5％的范围内。

如本技术领域所熟知，水凝胶配方内较高份量的起始因子可以导致较高的交联密度或更紧密的凝胶结构。混合聚醚DA/UArg-PEA基底水凝胶可拥有理想的水凝胶特性组合：温敏度和带正电荷。

制备纯聚醚DA基底或UArg-PEA基底水凝胶的方法基本上与制备混合聚醚DA/UArg-PEA基底水凝胶的方法相同的。在交联反应完全时可以观察到差别。

纯聚醚DA基底水凝胶需要数秒至数分钟完成完全交联，其时间完成时间的长度根据混合物溶液中聚醚DA和起始因子的浓度确定。另一方面，纯UArg-PEA基底水凝胶需要更长的UV照射时间，正常情况下需要数小时。以下是制备纯UArg-PEA基底水凝胶的实例：将20wt％的UArg-PEA溶解于蒸馏水中，并加入5％的起始因子，放置在UV光底下15小时。所得水凝胶产物与聚醚DA基底或混合聚醚DA/UArg-PEA基底水凝胶比较时具有小的膨胀比例。

水凝胶可以预先加入目标分子或化合物。例如，制备载有太平洋紫杉酚的50/50F68DA/2U-Arg-3-S混合水凝胶时，将0.3gF68DA、0.3g2U-Arg-3-S和0.06g的起始因子混合，并溶解于3ml的混合溶剂溶液中。制备所述混合溶剂溶液，预先将太平洋紫杉酚溶解于浓度为12mg/ml的乙醇中。所述3ml的混合溶剂溶液因此包括1ml太平洋紫杉酚乙醇溶液、0.4mlDMSO和1.6ml乙醇。所述具有起始因子的F68DA和2U-Arg-3-S聚合物溶液和混合溶剂在微热和UV条件下光聚合。

合成的水凝胶，在广阔的温度范围的水溶液中，或在回流热循环中会体现半可逆转的温敏膨胀特性。进入光交联的聚合物网内的聚醚分子团的内部核心结构可敏感地对温度作出响应。位于聚醚胶团与聚合物网的交联联结点的酯链慢慢被水解分开，从而这些水凝胶是生物可降解的。

在一具体实施例中，混合聚醚DA/UArg-PEA基底水凝胶合成方法，其包括原材料：L-精氨酸(Sigma，产品分类号A3784)、L-精氨酸盐酸盐(Sigma)、对甲苯磺酸一水(Alfa Aesar存货号36506，Ward，Hill，MA)、丁二酰氯、癸二酰氯、己二酰氯、乙二醇、1，3-丙二醇(Avocado Research Chemicals Ltd.存货号A10829)、1，4-丁二醇(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)和对硝基苯酚(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)其可以直接使用而不需要进一步纯化。

对甲苯磺酸一水、反丁烯二酰氯、乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-二醇(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)和对硝基苯酚(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)也可以直接使用而不需要进一步的纯化。聚醚F127(Mw＝12600)，F68(Mw＝8700)和丙烯酰氯(AldrichChemical Company，Milwaukee，WI)也可以直接使用而不需要进一步纯化。

从Fisher Scientific(Fairlawn，NJ)获得的三乙胺可以通过氢化钙回流干燥，然后蒸馏。蒸馏溶剂使用前以通过标准方法纯化，其可以是甲苯、乙酸乙酯、丙酮、2-丙醇和二甲基亚砜(DMSO)。可以作为起始因子Irgacure 2959，其包含2-羟基-1-[4-羟乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(Ciba Specialty Chemicals Inc.)

在另一实施方案中，合成混合聚醚DA/UArg-PEA基底水凝胶：将0.08g的2U-Arg-2-S聚合物和0.32g的F68DA聚合物(2U-Arg-2-S/F68DA)即以重量比例20/80加入装有2mL的蒸馏水的小瓶中(Φ＝25mm)，使其溶解形成透明的均相溶液。然后加入0.02g的光起始因子Irgacure2959(占聚合物总重量的5wt％)，微热下使其完全溶解于所述聚合物溶液。将所述聚合物溶液在室温条件通过长波长UV灯(365nm，16W)照射一小时。

转移合成的水凝胶(Φ＝25mm，厚度≈4mm)，在室温下将其浸入蒸馏水中48小时，以清除其他的化学品杂质。定期更换所述蒸馏水以对其进行纯化。纯化工序完毕后，所述水凝胶浸泡在蒸馏水中以达到膨胀平衡后移出，在进一步判断其特征前，需将其在室温下真空干燥48小时。

水凝胶的凝胶含量(G_f)可以用以下方程式定义：

Gf=WdWp×100%]]>

其中W_d是干燥水凝胶的重量和W_p是两个聚合物和光起始因子的总重量。

五、水凝胶的特性

表3和4(实施例2)显示本发明的一种示例性聚醚DA/UArg-PEA基底混合水凝胶系列的特性。当所述UArg-PEA聚合物前体是总反应重量的20％，但当其重量百分比下降至10％，如表4所示，所述混合水凝胶的凝胶含量(Gf)低于纯F68DA基底水凝胶。

根据表3和4(实施例2)，处于平衡状态(Qcq)的膨胀比例，会随着在UArg-PEA(从2U-Arg-2-S到2U-Arg-4-S)的亚甲基链长度增加而上升。这是因为2U-Arg-4-S具有最低的交联密度，而因此在水凝胶内有较大的孔或更大的空间以储存水。2U-Arg-4-S的压缩系数亦因为同样理由是最低的。

所述聚醚DA基底水凝胶和聚醚DA/UArg-PEA基底混合水凝胶可具有温敏性。三嵌段共聚物聚醚在稀释情况下的水溶液中自我聚合而形成胶团。在超过大概20％(w/v)的高浓度下，三嵌段共聚物聚醚体现温敏溶胶-凝胶转变性质(JunBae Lee，Jun Jin Yooni，Doo Sung Lee，Tae Gwan Park，Photo-crosslinkable，Thermal-sensitive and biodegradable pluronic hydrogels for sustained release of protein，J.Biomater.Sci.Polymer Edn，2004；15(12)：1571-1583)。所述聚醚水凝胶的温敏特性是利用了其最低临界溶解温度(LCST)的性质，其主要是聚合物结构上亲水基和疏水基的微妙平衡所导致的。所述LCST是与聚醚共聚物中的临界胶团温度(CMT)有紧密关系。当温度升高至所述LCST之上时，高度浓缩的聚醚共聚物溶液会转变成紧密挤压的球状胶团，实时变成热定型凝胶状态(Jun Bae Lee，Jun JinYooni，Doo Sung Lee，Tae Gwan Park.Photo-crosslinkable，thermo-sensitive andbiodegradable pluronic hydrogels for sustained release of protein，J.Biomater.Sci.Polymer Edn，2004；15(12)：1571-1583)。

半固化的凝胶结构形成上述的CMT。然而当用其它水性液体稀释时，因为其需要将聚醚胶团紧密挤压的共聚物浓度实时下降而失去其结构完整性。在一实施方案中，一UV诱导交联网在聚醚水凝胶中产生，以防止上述问题发生同时保持其温敏性。

如图7所示，所述聚醚DA基底水凝胶和聚醚DA/UArg-PEA基底混合水凝胶的膨胀比例可以随着温度上升而单调下降，因为所述已进入的温敏聚醚胶团是控制膨胀比例的重要要素。

水凝胶可以用本技术领域熟知的方法测定特性，例如凝胶含量(Gr)、平衡膨胀比率(Qeq)、压缩系数和内部形态。聚合物前体(例如聚醚DA：UArg-PEA)的反应比率对水凝胶的特性影响也可以判断。

1、FTIR光谱

使用本技术领域熟知的标准方法以傅立叶转换红外光(FTIR)测试对聚合物作特性描述。例如，聚合物可以打成粉状与KBr在1∶10重量比例下混合，然后压缩成KBr颗粒。使用标准方法通过光谱仪(例如，Perkin-Elmer Nicolet Magan 560 FTIR光谱仪，Madison，WI)测定获得FTIR光谱。标准软件包例如Omnic软件包(ThermoFisher Scientific Inc.，Waltham，MA)可以用于数据收集和分析。

2、膨胀动力量度

水凝胶的膨胀动力可以用标准方法量度。干的水凝胶可以先称重和在室温下浸入15mL的PBS缓冲液中一段预设的时间，然后移出，去除表面的水后称重。膨胀比例可以依照以下方程序计算：

Q=Ws-WdWd×100%]]>

其中W_s是已膨胀的水凝胶在时间t上的重量，和W_d是干的水凝胶在t＝0时的重量。

3、机械性测试

已膨胀的水凝胶的压缩机械性测试可以用标准方法进行。压缩系数可以由曲线的起始线性部份的斜度来计算。每一种水凝胶可以重复测试，和使用本技术领域熟知的标准方法来计算具有标准差的平均值。

4、内部形态的扫描电子显微镜检查

可以使用扫描电子显微镜(SEM)的标准方法来分析水凝胶的内部形态结构像作为水凝胶聚合物前体转化率的功能。标准冷冻固定技术可以用作观察所述已膨胀的水凝胶的结构。例如，水凝胶可以在室温下的蒸馏水中培养至达到其膨胀平衡。所述水凝胶然后可以轻轻取出并立刻转移至液态氮中冻结和保存已膨胀的结构。然后样本可以用真空冻干法，固定在铝桩上并以金涂盖来制备以供SEM观察。

六、水凝胶用于传递和/或释放目标分子

提出了使用UArg-PEA基底水凝胶、聚醚DA基底水凝胶和混合水凝胶携带和/或释放分子或化合物的方法。

在一实施方案中，提出了控制释放分子或化合物的方法。所述方法包括提出UArg-PEA基底、聚醚DA基底和/或混合水凝胶，其中所述分子或化合物是已经包含在水凝胶内。

在另一实施方案中，提出了释放目标分子或化合物的方法。所述方法包括提出一种UArg-PEA基底、聚醚DA基底和/或混合水凝胶，其中所述分子或化合物是已经装载在水凝胶中，其中所述水凝胶是插入对象中的目标区域。所述目标区域可以是对象身体上的区域，如身体、身体部分、器官、器官系统、细胞或组织。

在另一实施方案中，提出了控制释放分子或化合物的装置，包括本发明的水凝胶。

在另一实施方案中，提出了在目标区域导向释放分子或化合物的装置，包括本发明的水凝胶。

这样的装置可以插入、注射进、固定在或依附在目标区域。

在另一个实施方案中，提出一种包含本发明的水凝胶的套装工具或本发明的装置。

所述UArg-PEA基底水凝胶，聚醚DA基底水凝胶和混合水凝胶可以用作多种生物医学用途的生物载体。本发明提供的水凝胶可以用于携带和/或释放有生物活性的分子或化合物。使用本发明的水凝胶，可以将生物活性的化合物携带进和/或释放在目标区域。生物活性的化合物可以用作为营养、生理或治疗的药剂递送至细胞、组织或器官上。生物活性的分子是本技术领域所熟知的，并可包括(但不限于)：养份、药品、药物、肽、多肽、寡核苷酸和多核苷酸。

生物活性的分子可以装载入本发明的水凝胶中，并可控制其快速释放和/或较慢的持续释放。释放率可以通过改变光聚合过程中混合物的比例来控制。不同的释放模式也可以根据改变UArg-PEA的亚甲基链的长度来实现。

为促进释放目标分子，本发明的水凝胶可以利用其亲水性或疏水性、带正电荷的和/或较少交联密度的、或水凝胶内交联剂的种类。生物活性的化合物可以使用本技术领域熟知的方法来预先或后来装载进所述水凝胶中。为了预先装载，将生物活性的药剂与凝胶前体混合，然后进行凝胶化。因为UArg-PEA水凝胶的带阳离子特性，任何在本技术领域熟知的带阴离子的生物药剂，例如肝素、DNA、生长因子、细胞因子、可以在凝胶制备好后装载入本发明的水凝胶中。带阴离子的生长因子例子包括(但不限于)：酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)，脑下丘衍生因子(aHDGF)。静电作用会将带阴离子的生物药剂吸引进本发明带阳离子的水凝胶中。在一具体实施例中，癌症治疗药物如白细胞介素-12(IL-12)或太平洋紫杉酚可以预先装载入本发明的水凝胶中，并作癌症治疗药物递送。

目标分子从已装载了的水凝胶中释放是可以用本技术领域所熟知的标准技术来研究。例如，释放研究可以在具有或没有胰蛋白酶(0.1mg/mL)的PBS缓冲液中进行。已装载目标分子的水凝胶样本(例如小颗粒)可以插入装有5ml PBS(或PBS-胰蛋白酶)溶液的小瓶中。整个系统可以在37℃下以持续旋转摇晃(大约100rmp)方式培养。每隔24小时将水凝胶样本转移至装有5ml PBS(或PBS-胰蛋白酶)溶液的新小瓶中。

为测定目标分子如药物的释放量，可以在收集得来的5ml释放介质中加入本技术领域熟知的溶剂如乙腈5ml。所述溶液可以旋涡搅拌至所有在溶液内的目标分子溶解。目标分子包含的物质可以使用标准方法，如用高效液相色谱法来分析测定。

标准软件包例如ChemStation(Palo，Alto，CA，USA)可以用作数据分析之用。

标准方法例如夹心酶联免疫吸附测试法(Sandwich ELISA)也可以用于测量从水凝胶中释放的目标分子的量。

实施例

实施例1

以下是L-精氨酸基底不饱和聚酯酰胺/聚醚二丙烯酸酯基底水凝胶的合成和特性描述。

一、实施例简要说明

这个实施例描述L-精氨酸基底不饱和聚酯酰胺/聚醚DA基底水凝胶的合成和特性描述。

基于聚醚三嵌段共聚物和精氨酸基底不饱和聚酯酰胺(UArg-PEA)的温敏和生物可降解的水凝胶通过光聚合作用制备。在聚醚F127或F68(图2)的两个末端羟基基团丙烯酸酯化生成聚醚聚合体。以凝胶含量(Gr)、平衡膨胀比例(Qeq)、压缩系数和内部形态对水凝胶的特性进行描述。水凝胶聚合物前体(聚醚DA：UArg-PEA)的转化率对水凝胶的性质的影响也有研究。将UArg-PEA聚合物加入聚醚DA基底水凝胶可增加它们的亲水性，降低交联密度、机械性强度和QCq。不同混合比例的水凝胶，其性质的差别与UArg-PEA区段的化学结构有关，即UArg-PEA内亚甲基基团的长度或UArg-PEA的疏水性。

温度上升时，利用UV照射来制备的光交联聚醚DA/UArg-PEA基底水凝胶的膨胀比率逐渐下降，并控制温度4℃-37℃之间时膨胀比例体现温敏转变。因为丙烯酸酯化聚醚末端UArg-PEA的酯链接裂开，这些水凝胶会慢慢降解。

当一种典型抗癌药太平洋紫杉酚被装载入水凝胶时，就可达到双相蛋白释放数据：在一星期的时段中，最初观察到一种没有爆发和迅速控制的释放量，然后就是更慢的持续释放。释放比率可以通过光聚合过程中改变混合比例来控制。

当质粒DNA被装载在水凝胶中以供持续传送时，可以改变UArg-PEA的亚甲基链的长度来达至不同的释放量。整体释放比率是非常慢及释放量是低至不足以诱导任何细胞转染。

二、导论

混合水凝胶是指包含两个或以上的不同分子类别成份的水凝胶系统。混合水凝胶是由组合有利的性质来创造的：温敏和带正电荷。从通过三种UArg-PEA和两种聚醚DA(F127DA，F68DA)以光交联方法合成一系列的生物可降解水凝胶。聚醚是一种广泛应用的拥有极佳水溶性、低毒性和免疫原性的生物适合的聚合物，最重要是其被FDA认可用于人体内的。聚醚DA在其两个链末端皆具有双键，它被选为辅助具有温敏性的UArg-PEAs的构成要素，及增强所产生的混合水凝胶的药物释放多样性。

新近合成的生物可降解聚醚DA/UArg-PEA基底水凝胶以凝胶含量(Gr)、平衡膨胀比率(Qeq)、压缩系数和内部形态来作特性描述。水凝胶聚合物前体(聚醚DA：UArg-PEA)的反应比率对水凝胶的性质的影响也有研究。

太平洋紫杉酚(分子量＝853.92Da)是一种从紫杉木提炼出来的天然物质。所述药物以静脉给药及作为一种治疗患有多种癌症病人的重要化疗药。然而，太平洋紫杉酚是非常亲脂的而且几乎不能溶解于水中。人们多次尝试传送太平洋紫杉酚。本实施例所描述的研究是设计为观察从一亲水系统中释放疏水基的。

鉴于水凝胶的精氨酸上的正电荷和DNA的负电荷之间有静电交互作用，质粒DNA也被装载入混合水凝胶中以研究其释放模式。

三、物料

物料包括：L-精氨酸(Sigma，产品分类号A3784)、L-精氨酸盐酸盐(Sigma)，对甲苯磺酸一水(Alfa Aesar存货号36506，Ward，Hill，MA)、丁二酰氯、癸二酰氯、己二酰氯、乙二醇、1，3-丙二醇(Avocado Research Chemicals Ltd.存货号A10829)、1，4-丁二醇(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)和对硝基苯酚(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)；以上所述的物料可以直接使用无需进一步纯化。

对甲苯磺酸一水、反丁烯二酰氯、乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)和对硝基苯酚(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可以直接使用而不需要进一步纯化。聚醚F 127(分子量＝12600)，F68(分子量＝8700)和丙烯酰氯可以从Aldrich Chemical Company(Milwaukee，W1)购得，并且可以直接使用而不需要进一步纯化。

三乙胺可以从Fisher Scientific(Fairlawn，NJ)购得，其通过与氢化钙回流干燥，通过蒸馏进行纯化后使用。溶剂如甲苯、乙酸乙酯、丙酮、2-丙醇和二甲基亚砜(DMSO)从VWR Scientific(West Chester，PA)购得，在使用前通过标准的方法进行纯化。起始因子Irgacure 2959，其包含：2-羟基-1-[4-(羟乙氧基]苯基]-2-甲基-1-丙酮，是从Ciba Specialty Chemicals Inc购得。其它化学品和试剂如非特别指明，是从Sigma(St.Louis，MO)购得。

四、合成聚合物和水凝胶的方法

1、饱和和不饱和Arg-PEAs的合成

饱和Arg-PEAs(SArg-PEAs)的合成方法采用段落5.2所描述的合成方法。相比正规合成疏水的氨基酸二酯的对甲苯磺酸盐，合成精氨酸二酯的对甲苯磺酸盐所用的对甲苯磺酸份量是双倍的。

一般合成SArg-PEA和UArg-PEA聚合物的方案如图20-21和23所示。图20(步骤Ia和Ib)显示制备二羧酸的二对硝基苯酯。图21(步骤2a和2b)显示制备双(L-精氨酸)-α，ω-亚烃基二酯类的四对甲苯磺酸盐。

2、合成二羧酸的二对硝基苯酯(图20)

二羧酸的二对硝基苯酯是用图20所示的方法：将不同亚甲基长度(x)的二羧基酰氯与对硝基苯酚反应来制备的。制成四个单体：丁二酸二对硝基苯酯(NSu)，x＝2；己二酸二对硝基苯酯(NA)，x＝4；癸二酸二对硝基苯酯(NS)，x＝8；反丁烯二酸二对硝基苯酯(NF)，x＝2。

例如，一个产量为68％的丁二酸二对硝基苯酯(NSu)是由丁二酰氯(0.03mol，3.2mL)与含有硝基苯酚(0.0603mol)的丙酮在有三乙胺(0.063mol)的条件下下反应所制备的。制备一冰/水混合物以保持对硝基苯酚和与丙酮混合的三乙胺溶液(100mL)维持在0℃。在逐滴加入上述冷冻溶液前，先以50mL的丙酮稀释丁二酰氯，然后在0℃下边加边搅拌2小时，然后在室温下过夜。所得出的丁二酸的二对硝基苯酯在蒸馏水中沉淀，然后在室温下真空干燥，在最后通过乙酸乙酯再结晶三次。

合成双(L-精氨酸)亚烃基二酯类的四对甲苯磺酸盐(图21)

相对本技术领域熟知的和上述的正规疏水氨基酸基底二酯单体合成方法，所用的对甲苯磺酸的份量是双倍的。

制成四个单体，其中，y是亚甲基基团的数目：双(L-精氨酸)乙烷二酯的四对甲苯磺酸盐Arg-2-S，y＝2；双(L-精氨酸)丙烷二酯的四对甲苯磺酸盐，Arg-3-S，y＝3；双(L-精氨酸)丁烷二酯的四对甲苯磺酸盐，Arg-4-S，y＝4；双(L-精氨酸)丙烷二酯的二对甲苯磺酸二盐酸盐，Arg-3-S-Cl，y＝3。Arg-3-S和Arg-3-S-Cl之间的差别，是平衡离子是依附在所述PEA的精氨酸的胍基团；前者是甲苯磺酸离子而后者是氯离子。

例如，在合成精氨酸二酯的甲苯磺酸盐中，将Arg-3-S，L-精氨酸(0.02mol)和1，3-丙二醇(0.01mol)，是在有对甲苯磺酸一水(0.04mol)存在的情况下，直接在甲苯(d.p.110℃)(80ml)回流合成。将异相固态-液态反应混合物加热至120℃，直至产生1.08ml(0.06mol)的水，剩余产物由迪安-斯塔克装置收集后回流24小时；然后将所述反应混合物冷却至室温，倒出甲苯；所得出的干燥混合物再通过2-丙醇重复沉淀三次进行纯化；纯化所得出的干燥混合物放置在一个500ml圆底烧瓶，并加入足够份量的2-丙醇然后在100℃下回流，使反应混合物完全溶解得到透明溶液；将透明的溶液自然冷却至室温，并静置过夜，然后在转移到一冷冻器促进近一步沉淀；之后倒出2-丙醇，而剩下为白色粘性团，将其在真空中干燥；最后得粉末状产物，其产量大约为90％。其具体方案，参见图21。

至于精氨酸二酯的二对甲苯磺酸二盐酸盐，所用的起始精氨酸单体是L-精氨酸盐酸盐而不是L-精氨酸。因为所述平衡离子Cl-是已经依附在所述精氨酸单体上，只需要一个1∶1比例的对甲苯磺酸：精氨酸盐酸盐。其它全部步骤如上描述。

3、以溶液缩聚合成饱和与不饱和Arg-PEA聚合物

将上述八个单体(Arg-2-S，Arg-3-S，Arg-4-S，Arg-3-S-Cl和NSu，NA，NS和NF)混合形成溶液并进行聚合反应，以制备饱和与不饱和精氨酸基底PEAs。示例性合成聚合物的特性描述在表1中概述。

例如，通过溶液缩聚合成8-Arg-3-S如下：将0.54ml干燥DMSO中的单体NS(1.0mmol)和Arg-3(1.0mmol)以旋涡搅拌混合。当在旋涡搅拌时，所述混合物溶液慢慢加热使之形成均匀的混合物。当所述混合物加热至70℃时，将三乙胺(0.31mL，2.2mmol)逐滴加入所述混合物并用力搅拌直至所述单体完全溶解。反应瓶然后保持在一恒温炉中，在70℃和没有搅拌的情况下保持48小时。所得出的溶液在冷的乙酸乙酯中沉淀、倒出、干燥、在甲醇中再溶解及在乙酸乙酯中再沉淀以进一步将其纯化。这个纯化程序在最后的室温真空干燥前重复两次。

表1，由不同单体组合所合成的聚合体

4、不饱和精氨酸基底聚酯酰胺(UArg-PEAs)的合成

如上述和图22显示般合成不饱和精氨酸基底聚酯酰胺(UArg-PEAs)。制备UArg-PEAs是使用不饱和二醇或/和二酸，而如上述般制备SArg-PEAs是使用饱和二醇或/和二酸。表2概述三个合成的UArg-PEAs并用作制造水凝胶和聚醚DA/UArg-PEA混合水凝胶的前体。

表2，合成UArg-PEAs为制造水凝胶的聚合物前体

聚醚DA聚合物的合成

聚醚DA聚合物的合成方法与G.M.Cruise，D.S.Scharp，J.A.Hubbell，Biomaterials，19：1287，1998在先前描述的聚乙二醇二丙烯酸(PEGDA)的合成方法相比，进行了一些修改。简单来说，将12.6g的F127或8.7g的F68溶解在150mL的苯中，并搅拌加热至45℃直至完全溶解。当所述溶液冷却至室温后，向所述聚醚溶液加入每个所述聚醚酸上的-OH基团五倍摩尔过量浓度的三乙胺；然后向所述溶液逐滴加入每个所述聚醚酸上的-OH基团五倍摩尔过量浓度的丙烯酰氯，生成所述聚醚的丙烯酸盐二酯。所述混合物在室温和氮气大气下搅拌过夜；在所述反应中生成的不能溶解的三乙胺盐通过过滤法去除，而所述聚醚DA产物在700ml冷冻己烷中沉淀通过过滤法进行收集；然后在20ml的苯中溶解以进一步纯化，并在700ml冷冻己烷中再沉淀两次。所述聚醚DA聚合物最后在室温真空下干燥24小时，并在4℃条件下进行储存，以供以后使用。

五、聚醚DA基底水凝胶和UArg-PEA/聚醚DA基底混合水凝胶的制备

聚醚DA基底水凝胶(100％聚醚酸)和混合水凝胶是通过光缩聚方法制备(表3、4和5)。聚醚DA/UArg-PEA水凝胶是将不同重量比例的两个聚合物：UArg-PEA和聚醚DA在少量可水溶的起始因子的条件下通过光缩聚的方法来制备的。混合水凝胶的制备如下：

将0.08g的2U-Arg-2-S和0.32g的F68DA(20/80重量比例的2U-Arg-2-S/F68DA)混合加入装有2mL的蒸馏水小瓶(Φ＝25mm)，使之溶解形成透明均匀溶液；因UArg-PEA的存在溶液显淡黄色。将0.02g的光起始因子Irgacure2959(聚合物总量的5wt％)加入所述聚合物溶液并微热使至完全溶解。所述溶液通过长波长UV灯(365nm，16W)在室温照射1小时后，将所得出的水凝胶(Φ＝25mm，厚度＝4mm)移除，并在室温下浸入蒸馏水中48小时以清除其他化学杂质；并定期更换蒸馏水。在纯化工序后，将所述水凝胶浸泡在蒸馏水中以达至膨胀平衡，然后移除并在进一步作特性描述前在室温真空下干燥48小时。

水凝胶的凝胶含量(G_f)可以用以下方程式定义：

Gf=WdWp×100%]]>

其中W_d是干燥水凝胶的重量和W_p是两个聚合物和光起始因子的总重量。

六、物料特性描述

1、FTIR光谱

在傅立叶转换红外光(FTIR)测试时，聚合物(包括三种UArg-PEAs和两种聚醚DA)打成粉状，与KBr在1∶10重量比例下混合，然后压缩成KBr颗粒。使用标准方法通过光谱仪(例如，Perkin-Elmer Nicolet Magan 560FTIR光谱仪，Madison，WI)进行测量，获得FTIR光谱。标准方法所使用的软件包，例如Omnic软件包(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA)用于数据收集和分析。

2、膨胀动力量度

水凝胶的膨胀动力在室温下膨胀动力量度数天。干的水凝胶可以先量重并在室温下在15mL的PBS缓冲液浸泡一段预设的时间；然后移出，并通过过滤纸轻轻吸去除表面的水，然后量重。其膨胀比率可以依照以下方程序计算：

Q=Ws-WdWd×100%]]>

其中W_s是已膨胀的水凝胶在时间t上的重量，和W_d是干的水凝胶在t＝0时的重量。

3、机械性测试

进行已膨胀的水凝胶的压缩机械性测试。压缩系数可以由曲线的起始线性部份的斜度来计算。每一种水凝胶可以重复测试三次，而它们的平均值是以一标准差来计算。亦有检查水凝胶聚合物前体的转化率，对已膨胀的水凝胶的压缩系数的影响。

4、内部形态的扫描电子显微镜检查

使用扫描电子显微镜(SEM)分析水凝胶的内部形态结构作为水凝胶聚合物前体转化率的功能。冷冻固定技术有最少的人为现象，可以用作观察所述已膨胀的水凝胶的结构。水凝胶可以在室温下的蒸馏水中培养至达到其膨胀平衡。然后将上述水凝胶轻轻取出，立刻转移至液态氮中冻结并保存已膨胀的结构；然后用真空冻干法将其在Virtis Freeze Drier(Gardiner，NY)真空、-50℃条件下干燥72小时，最后固定在铝桩上并以金涂盖40秒，以Hitachi S4500 SEM(

温敏精氨酸基底水凝胶为生物载体专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

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