专利摘要
本发明公开一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法。该方法包括Foc1分生孢子悬浮液的制备、Foc1菌丝体的收集、菌丝体细胞壁的酶解、Foc1原生质体的收集、Foc1原生质体的再生等步骤。本发明通过所述方法酶解菌丝细胞，所获原生质体的制备数最高达到6.0×108个/mL，所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形。本发明采用含有200g/L葡萄糖的CM固体培养基作为再生培养基，提高了Foc1原生质体的再生率，最高为28.6％，明显高于现有的香蕉枯萎病菌原生质体的再生方法，为后续原生质体转化技术研究香蕉病菌致病分子机制提供了良好的基础。本发明方法制备过程简单、高效，便于操作。
权利要求
1.一种香蕉枯萎病菌1号小种（
（1）Foc1分生孢子悬浮液的制备：
将Foc1接种于PDA培养基中培养；取菌丝块，加至查氏培养基中，震荡培养；将培养液用100～200目细胞筛过滤，离心，弃上清；用NCM培养基重悬沉淀并进行稀释，制得Foc1分生孢子悬浮液；
（2）Foc1菌丝体的收集：
将制备好的分生孢子悬浮液接种于NCM培养基中，使分生孢子终浓度为（1～5）×10
所述的NCM培养基含有以下组分：葡萄糖10 g/L、天冬氨酸4～8 g/L、20×硝酸盐50mL/L、200×铁盐5 mL/L、1000×维生素1 mL/L、1000×微量元素1 mL/L，用去离子水定容，pH值为6.2～6.5；
所述的渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl溶液；
（3）菌丝体细胞壁的酶解：
取步骤（2）获得的新鲜菌丝体，按照每0.1 g新鲜菌丝体添加1 mL酶解液的比值加入酶解液；于30±0.5℃下120～150 rpm的摇床中酶解3～4 h，原生质体数量达到（4.0～6.0）×10
所述的酶解液为：15～20 g/L崩溃酶、溶剂为0.8 mol/L NaCl溶液；配制好后用直径为0.22 μm滤膜过滤除菌；
（4）Foc1原生质体的收集：
用3～5层无尘纸或擦镜纸过滤原生质体酶解液，离心，弃上清；加入预冷的STC溶液重悬沉淀；离心，弃上清；再加入预冷的STC溶液将沉淀重悬，得到Foc1原生质体悬液；
所述的离心的条件均为于4℃、400～800 g离心10～15 min；
所述的STC溶液为pH 7.5的10 mmol/L Tris-HCl，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl
（5）Foc1原生质体的再生：
将Foc1原生质体悬液分别用STC溶液和无菌水稀释至1×10
所述的CM高渗再生培养基为：葡萄糖200 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母提取物1 g/L、酪蛋白水解物1 g/L、20×硝酸盐50 mL/L、1000×维生素1 mL/L、1000×微量元素1 mL/L，用去离子水定容，pH值为6.5；
所述20×硝酸盐的成分组成为：NaNO
所述200×铁盐的成分组成为：FeSO
所述1000×维生素的成分组成为：甘氨酸2 g/L、烟酸0.5 g/L、生物素0.5 g/L、盐酸吡哚醇0.5 g/L、盐酸硫胺素0.4 g/L、核黄素0.5 g/L、肌醇0.1 g/L，加去离子水定容；
所述1000×微量元素的成分组成为：ZnSO
2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的PDA培养基中培养的条件为于25～30℃培养4～7 d；
步骤（1）中所述的震荡培养的条件为于25～30℃、130～150 rpm震荡培养3～4 d；
步骤（1）中所述的离心的条件为于4℃下9000～12000×g离心10 min；
步骤（1）中所述的Foc1分生孢子悬浮液的浓度为0.5～5×10
3.根据权利要求1或2所述的香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的PDA培养基中培养的条件为于28℃培养7 d；
步骤（1）中所述的震荡培养的条件为于28℃、150 rpm震荡培养3～4 d；
步骤（1）中所述的离心的条件为于4℃下10000×g离心10 min；
步骤（1）中所述的Foc1分生孢子悬浮液的浓度为2.5×10
步骤（1）、（2）中所述的细胞筛的目数为200目。
4.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的NCM培养基含有以下组分：葡萄糖10 g/L、天冬氨酸4 g/L、20×硝酸盐50 mL/L、200×铁盐5 mL/L、1000×维生素1 mL/L、1000×微量元素1 mL/L，用去离子水定容，pH值为6.5；
步骤（2）中，使分生孢子终浓度为1×10
步骤（2）中所述的震荡培养的条件为于28℃下150 rpm震荡培养11～12 h。
5.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，其特征在于：
步骤（3）中，原生质体数量达到（5.5～6.0）×10
步骤（3）中所述的酶解液为：15 g/L崩溃酶、溶剂为0.8 mol/L NaCl溶液；或者，20 g/L崩溃酶、溶剂为0.8 mol/L NaCl溶液；配制好后用直径为0.22 μm滤膜过滤除菌。
6.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的离心的条件均为于4℃、400 g离心10 min；
步骤（4）中所述的Foc1原生质体悬液的浓度为0.5～2×10
7.根据权利要求1或6所述的香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，其特征在于：
步骤（4）中，用4层无尘纸或擦镜纸过滤原生质体酶解液；
步骤（4）中所述的Foc1原生质体悬液的浓度为1×10
说明书
技术领域
本发明涉及的是细胞工程中丝状真菌原生质体制备与再生技术领域，具体涉及一种香蕉枯萎病菌1号小种(Foc1)原生质体的制备与再生方法。
背景技术
香蕉(Musa spp.)是热带亚热带最重要的水果之一，因其营养丰富、味道鲜美，深受人们喜爱。由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubence，Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害，被称为“香蕉癌症”，严重影响香蕉产业的健康发展。香蕉枯萎病是一种典型的维管束病害，可由Foc通过根部及受伤的地下球茎侵入植株，沿维管束向假茎及叶片蔓延，进而堵塞导管。危害我国香蕉的枯萎病菌主要有2个小种，即1号小种(Foc1)和4号小种(Foc4)。开展Foc致病相关基因功能研究，有利于全面阐明Foc的致病机理，也是有效防控香蕉枯萎病的基础。
利用原生质体进行的分子转化技术是开展丝状真菌基因功能研究的重要方法，而高效的原生质体制备与再生技术则是原生质体分子转化的基础。由于不同种类丝状真菌的细胞结构不同，尤其是细胞壁的结构和组成差异明显，因此制备丝状真菌原生质体的最佳条件也存在很大差异。目前，关于香蕉枯萎病菌原生质体制备的方法已有一些报道。例如，张磊等(2017)采用酶解法对Foc TR4原生质体进行了制备(25g/L崩溃酶、0.4g/L几丁质酶和15g/L溶解酶，酶解2h，菌丝与酶解液比例为1:15)，其原生质体产量约为2×107个/mL(每毫升酶解液获得的原生质体个数)。张欣(2007)采用酶解法对Foc4原生质体进行了制备(10g/L的溶壁酶酶解3.5h，菌丝与酶解液比例为1:20)，其原生质体产量为3×106个/mL，再生率为22％。谢德啸等(2012)采用酶解法对Foc4原生质体进行了制备(20g/L溶壁酶和20g/L崩溃酶酶解2h)，其原生质体产量为1×106个/mL。整体上，关于香蕉枯萎病菌原生质体制备与再生方法的文献报道较少，大多直接参考了其它丝状真菌的制备与再生方法；且主要存在的问题在于原生质体制备效率较低，再生率不高。同时，也缺乏Foc1原生质体制备与再生方法的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种高效的香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法。利用该方法使其原生质体的制备数最高达到6.0×108个/mL，再生率最高达到28.6％。本发明可为香蕉枯萎病菌基因功能研究提供便利，也可适用于其它丝状真菌原生质体的高效制备与再生。本方法所获得的原生质体制备数和再生率均明显高于现有报道的香蕉枯萎病菌4号小种原生质体制备与再生的相关方法，也是首次报道香蕉枯萎病菌1号小种的原生质体制备与再生方法。同时，本发明制备原生质体所使用的酶解液还具有经济的特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，包括如下步骤：
(1)Foc1分生孢子悬浮液的制备：
将尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubence race 1，Foc1)接种于PDA培养基中培养；取菌丝块，加至查氏培养基中，震荡培养；将培养液用100～200目(优选200目)细胞筛过滤，离心，弃上清；用NCM培养基重悬沉淀并进行稀释，制得Foc1分生孢子悬浮液；
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉9g/L，加ddH2O定容，121℃灭菌20min；
查氏培养基：NaNO3 3g/L、K2HPO4 1g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.018g/L、蔗糖30g/L，用蒸馏水定容，调节pH值至6.0，121℃灭菌20min；
所述的PDA培养基中培养的条件为于25～30℃培养4～7d；优选为于28℃培养7d；
所述的震荡培养的条件为于25～30℃、130～150rpm震荡培养3～4d；优选为于28℃、150rpm震荡培养3～4d；
所述的离心的条件为于4℃下9000～12000×g离心10min；优选为于4℃下10000×g离心10min；
所述的Foc1分生孢子悬浮液的浓度为0.5～5×108个/mL；优选为2.5×108个/mL；
(2)Foc1菌丝体的收集：
将制备好的分生孢子悬浮液接种于NCM培养基中，使分生孢子终浓度为(1～5)×106个/mL；于25～30℃下130～150rpm震荡培养11～12h，用100～200目(优选为200目)细胞筛过滤，并用渗透压稳定剂冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体；
所述的NCM培养基含有以下组分：葡萄糖10g/L、天冬氨酸4～8g/L、20×硝酸盐50mL/L、200×铁盐5mL/L、1000×维生素1mL/L、1000×微量元素1mL/L，用去离子水定容，pH值为6.2～6.5；
优选的，所述的NCM培养基含有以下组分：葡萄糖10g/L、天冬氨酸4g/L、20×硝酸盐50mL/L、200×铁盐5mL/L、1000×维生素1mL/L、1000×微量元素1mL/L，用去离子水定容，pH值为6.5；
所述20×硝酸盐的成分组成为：NaNO3 120g/L、KCl 10.4g/L、MgSO4·7H2O 10.4g/L、KH2PO4 30.4g/L，加蒸馏水定容；
所述200×铁盐的成分组成为：FeSO4·7H2O 7.5g/L、Na2EDTA·2H2O 5.6g/L，加蒸馏水定容；
所述1000×维生素的成分组成为：甘氨酸2g/L、烟酸0.5g/L、生物素0.5g/L、盐酸吡哚醇0.5g/L、盐酸硫胺素0.4g/L、核黄素0.5g/L、肌醇0.1g/L，加去离子水定容；
所述1000×微量元素的成分组成为：ZnSO4·7H2O 22g/L、H3BO3 11g/L、MnCl2·4H2O 5g/L、KI 8g/L、CoCl2·6H2O 17g/L、CuSO4·5H2O 16g/L、Na2MoO4·2H2O 15g/L，加蒸馏水定容；
优选的，使分生孢子终浓度为1×106个/mL；
优选的，所述的震荡培养的条件为于28℃下150rpm震荡培养11～12h；
所述的渗透压稳定剂为0.6～0.8mol/L NaCl溶液；优选为0.8mol/L NaCl溶液。
(3)菌丝体细胞壁的酶解：
取步骤(2)获得的新鲜菌丝体，按照每0.1g新鲜菌丝体添加1mL酶解液的比值加入酶解液；于30±0.5℃下120～150rpm的摇床中酶解3～4h，原生质体数量达到(2.0～6.0)×108个/mL，得到原生质体酶解液；
优选的，原生质体数量达到(4.0～6.0)×108个/mL；更优选的，原生质体数量达到(5.5～6.0)×108个/mL；
所述的酶解液为：10～15g/L溶壁酶、10～15g/L崩溃酶、溶剂为0.6～0.8mol/LNaCl溶液；或者，15～20g/L崩溃酶、溶剂为0.6～0.8mol/L NaCl溶液；配置好后用直径为0.22μm滤膜过滤除菌；
优选的，所述的酶解液为：10～15g/L溶壁酶、10～15g/L崩溃酶、溶剂为0.8mol/LNaCl溶液；或者，15～20g/L崩溃酶、溶剂为0.8mol/L NaCl溶液；配置好后用直径为0.22μm滤膜过滤除菌；
更优选的，所述的酶解液为：10g/L溶壁酶、10g/L崩溃酶、溶剂为0.8mol/L NaCl溶液；或者，15g/L溶壁酶、15g/L崩溃酶、溶剂为0.8mol/L NaCl溶液；或者，15g/L崩溃酶、溶剂为0.8mol/L NaCl溶液；或者，20g/L崩溃酶、溶剂为0.8mol/L NaCl溶液；配置好后用直径为0.22μm滤膜过滤除菌；
(4)Foc1原生质体的收集：
用3～5层(优选4层)无尘纸或擦镜纸过滤原生质体酶解液，离心，弃上清；加入预冷的STC溶液重悬沉淀；离心，弃上清；再加入预冷的STC溶液将沉淀重悬，得到Foc1原生质体悬液；
所述的STC溶液为10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/LCaCl2；
所述的离心的条件均为于4℃、400～800g离心10～15min；优选均为于4℃、400g离心10min；
所述的Foc1原生质体悬液的浓度为0.5～2×107个/mL；优选为1×107个/mL。
(5)Foc1原生质体的再生：
将Foc1原生质体悬液分别用STC溶液和无菌水稀释至(0.2～1)×104个/mL(优选为1×104个/mL)；再取100～200μL(优选为100μL)原生质体稀释液与15mL CM高渗再生培养基混匀后倒平板，于25～30℃(优选为28℃)倒置培养，培养2～3d直至长出再生菌落(再生菌落的直径约1mm)；调查再生情况，计算再生率；再生率(％)＝(STC溶液稀释处理上长出的菌落数目-无菌水稀释处理长出的菌落数目)×100/总原生质体数；
所述的CM高渗再生培养基为：葡萄糖200g/L、蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、酪蛋白水解物1g/L、20×硝酸盐50mL/L、1000×维生素1mL/L、1000×微量元素1mL/L，用去离子水定容，pH值为6.5。
所述20×硝酸盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分均与步骤1(2)中相同。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.制备过程简单、高效，便于操作；
2.原生质体制备数达到(2.0～6.0)×108个/mL，再生率最高达到(25.9～28.6)％。
本发明使用的NCM培养基，能促进香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发，萌发率高达92.3％。
本发明通过所述方法酶解菌丝细胞，所获原生质体的制备数高(每0.1g菌丝酶解最高可获得6.0×108个原生质体)，所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形。本发明所选丝状真菌的菌丝体来自于分生孢子充分生长的新鲜幼嫩时期(11～12h)，该阶段所获的菌丝量较大，用该时期菌丝来制备原生质体，为获得高产量的原生质体提供了基础。同时，该所述方法使用的酶解液还具有试验成本经济的特点。
本发明采用含有200g/L葡萄糖的CM固体培养基作为再生培养基，提高了香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的再生率，最高为28.6％，明显高于现有的香蕉枯萎病菌原生质体的再生方法，为后续原生质体转化技术研究香蕉病菌致病分子机制提供了良好的基础。
本发明还优化了原生质体制备条件(酶解时间、离心力)，使Foc1原生质体制备更易于操作，费用更低，并显著提高了Foc1原生质体制备数及再生率。
附图说明
图1是Foc1分生孢子在NCM培养基中的生长情况。
图2是Foc1原生质体形态。
图3是酶解时间对Foc1原生质体产量的影响。
图4是不同酶解液对Foc1原生质体产量的影响。
图5是Foc1原生质体在不同培养基中的再生率。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
其中，尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubence race1，Foc1)，即香蕉枯萎病菌1号生理小种，在“201710903818.8、一种香蕉枯萎病菌培养基及其应用”中公开。
实施例1
1、Foc1原生质体的制备和再生方法，具体操作步骤如下：
(1)Foc1分生孢子的制备
将尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubence race 1，Foc1)接种于PDA培养基中，于28℃培养7d。用直径为5mm的打孔器打取菌丝块，加至250mL查氏培养基中；于28℃、150rpm震荡培养3～4d。将培养液用200目细胞筛过滤，于4℃下10000×g离心10min，弃上清。用NCM培养基重悬沉淀并进行稀释后，制得Foc1分生孢子悬浮液，用血球计数板计数，使分生孢子浓度为2.5×108个/mL。
PDA培养基配制：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉9g，加ddH2O定容至1L，121℃灭菌20min。
查氏培养基配制：NaNO3 3g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O0.018g、蔗糖30g，用蒸馏水定容至1L，调节pH值至6.0，121℃灭菌20min。
(2)Foc1菌丝体的收集
将制备好的Foc1分生孢子悬浮液接种于250mL的NCM培养基中，使分生孢子终浓度为1×106个/mL；于28℃下150rpm震荡培养11～12h，用200目细胞筛过滤，并用0.8mol/LNaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。
NCM培养基的具体配制步骤为：葡萄糖10g、天冬氨酸4g、20×硝酸盐50mL、200×铁盐5mL、1000×维生素1mL、1000×微量元素1mL，用去离子水定容至1L，调节pH值至6.5。所述20×硝酸盐的成分组成为：NaNO3 120g、KCl 10.4g、MgSO4·7H2O 10.4g、KH2PO4 30.4g，加蒸馏水至1L。所述200×铁盐的成分组成为：FeSO4·7H2O 7.5g、Na2EDTA·2H2O 5.6g，加蒸馏水至1L。所述1000×维生素的成分组成为：甘氨酸2g、烟酸0.5g、生物素0.5g、盐酸吡哚醇0.5g、盐酸硫胺素0.4g、核黄素0.5g、肌醇0.1g，加去离子水至1L。所述1000×微量元素的成分组成为：ZnSO4·7H2O 22g、H3BO3 11g、MnCl2·4H2O 5g、KI 8g、CoCl2·6H2O 17g、CuSO4·5H2O 16g、Na2MoO4·2H2O 15g，加蒸馏水至1L。
(3)菌丝体细胞壁的酶解
取0.2g新鲜菌丝体，加入2mL酶解液。于30℃下120～150rpm的摇床中酶解3～4h，得到原生质体酶解液，并于显微镜下观察原生质体产生情况。
所述的酶解液配制：崩溃酶15g/L、溶剂为0.8mol/L NaCl溶液，配置好后用直径为0.22μm滤膜过滤除菌。
(4)Foc1原生质体的收集
用4层无尘纸(Kimtech)过滤原生质体酶解液，于4℃、400×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl2)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc1原生质体悬液，显微镜下观察以计算原生质体浓度，约为1×107个/mL。
(5)Foc1原生质体的再生
将100μL Foc1原生质体悬液(浓度约1×107个/mL)分别用STC溶液和无菌水稀释至1×104个/mL；再取100μL原生质体稀释液与15mL CM高渗再生培养基混匀后倒平板，于28℃倒置培养，培养2～3d直至长出直径约1mm再生菌落；调查再生情况，计算再生率。
再生率(％)＝(STC溶液稀释处理上长出的菌落数目-无菌水稀释处理长出的菌落数目)×100/总原生质体数。
CM高渗再生培养基配制：葡萄糖200g、蛋白胨2g、酵母提取物1g、酪蛋白水解物1g、20×硝酸盐50mL、1000×维生素1mL、1000×微量元素1mL，琼脂粉9g，用去离子水定容至1L，调节pH值至6.5。
所述20×硝酸盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分均与本实施例步骤1(2)中相同。
2、结果：
(1)采用NCM培养基来进行Foc1孢子萌发，其萌发率可高达92.3％；培养11～12h后，即可获得大量适合于原生质体制备的新鲜幼嫩的菌丝体(图1)。
(2)采用含崩溃酶(15g/L)的等渗酶解液进行Foc1的菌丝体酶解，原生质体制备数最高可达6.0×108个/mL，且所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形，利于原生质体的再生(图2)。
(3)采用CM高渗再生培养基进行Foc1原生质体的再生，其再生率最高达到28.6％。
对比例1
将实施例1步骤1(2)中的Foc1分生孢子悬浮液接种于NCM培养基分别替换成常用的PDB培养基和CM培养基，对其分生孢子萌发率和菌丝产量进行了观察。
结果分析：将Foc1分生孢子悬浮液接种于常规的PDB培养基和CM培养基后，于11h后取样观察；结果表明，Foc1分生孢子在PDB和CM培养基中的萌发率相似，均可达到98％以上，在NCM培养基中为93％左右；对其菌丝湿重进行了统计，发现每250mL的NCM培养基中，Foc1重量为0.12g，在PDB和CM培养基中分别为0.14g和0.15g。即在不同培养基中，Foc1分生孢子的萌发率和菌丝产量均没有显著差异。
由于NCM培养基不含复杂蛋白，仅以天冬氨酸作为氮源，制备方法简易，适合推广应用；既有利于香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发率，又能减少培养基中的外源蛋白(或大分子肽段)的干扰；因此，该培养基有利于Foc1相关生理生化指标的分析，以及有利于Foc与香蕉在细胞水平互作的研究。
PDB培养基配制：马铃薯200g，葡萄糖20g，加ddH2O定容至1L，121℃灭菌20min。
NCM培养基配制：葡萄糖10g、天冬氨酸4g、20×硝酸盐50mL、200×铁盐5mL、1000×维生素1mL、1000×微量元素1mL，用去离子水定容至1L，调节pH值至6.5。所述20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分均与实施例1步骤1(2)中相同。
CM培养基含有以下组分：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、酪蛋白水解物1g/L、20×硝酸盐50mL/L、1000×维生素1mL/L、1000×微量元素1mL/L，用去离子水定容，pH值为6.5。所述20×硝酸盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分均与实施例1步骤1(2)中相同。
实施例2
将实施例1步骤1(3)中的酶解时间分别替换成1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h和4.5h，对原生质体的产生情况进行观察。
结果分析：分别将Foc1新鲜菌丝体酶解不同时间后，对获得的原生质体在显微镜下观察，结果表明菌丝体在酶解1.5h后，原生质体产量快速上升；在酶解3h时即可获得稳定的原生质体产量，制备数最高可达6.0×108个/mL(图3)。
实施例3
将实施例1步骤1(4)中的原生质体离心力分别替换成220×g(1500rpm)、400×g(2000rpm)、600×g(2500rpm)、880×g(3000rpm)和1600×g(4000rpm)，再对原生质体进行显微观察。
结果分析：分别将Foc1原生质体在不同离心力作用下进行沉淀，对获得的原生质体在显微镜下观察，结果发现原生质体经400×g(2000rpm)离心后，在上清液中不能或极少观察到分生孢子，表明该离心力下即可获得良好的沉淀效果；由于原生质体没有细胞壁的保护，易于破碎，因此随着离心力的提高，原生质体的完整性可能降低。
实施例4
将实施例1步骤1(4)中的原生质体用无尘纸(Kimtech)过滤分别替换成miracloth过滤、擦镜纸过滤，再对原生质体进行显微观察。
结果分析：分别将Foc1原生质体用miracloth、擦镜纸、无尘纸进行过滤，经离心沉淀，对获得的原生质体在显微镜下观察，结果发现经3种材料过滤后获得的Foc1原生质体没有明显差异。用miracloth过滤是收集丝状真菌原生质体最通用的方法，但其成本相对较高，而且也比较难于获得。无尘纸和擦镜纸价格便宜，为实验室的常用材料。因此推荐使用无尘纸和擦镜纸来过滤获得Foc1原生质体。
实施例5
将实施例1步骤1(3)中菌丝体细胞壁的酶解液(15g/L崩溃酶)分别替换成酶解液1(10g/L崩溃酶)、酶解液2(20g/L崩溃酶)、酶解液3(15g/L溶壁酶)、酶解液4(20g/L溶壁酶)、酶解液5(10g/L溶壁酶+10g/L崩溃酶)、酶解液6(15g/L溶壁酶+15g/L崩溃酶)、酶解液7(10g/L溶壁酶+20g/L纤维素酶+30g/L蜗牛酶)，对原生质体产量与和原生质体形态进行观察。
结果分析：分别将Foc1菌丝体用不同酶解液酶解后，对原生质体形态和产量进行分析。结果发现酶解液、酶解液2、酶解液5、酶解液6效果好，原生质体制备数可稳定在2.5×108个/mL以上(图4)；且所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形，利于原生质体的再生。本发明所优选的酶解液同时还具有试验成本最经济的特点。
实施例6
将实施例1步骤1(5)中CM高渗再生培养基分别替换成CM蔗糖再生培养基、PSA再生培养基和YPS再生培养基，调查再生情况，计算再生率。
结果分析：采用不同再生培养基对Foc1原生质体进行再生，对其再生率进行统计。结果表明，原生质体在CM高渗再生培养基的再生率最高，可以达到28.6％；PSA再生培养基次之；CM蔗糖再生培养基和YPS再生培养基的再生率则比较低(图5)。
CM高渗再生培养基配制：葡萄糖200g、蛋白胨2g、酵母提取物1g、酪蛋白水解物1g、20×硝酸盐50mL、1000×维生素1mL、1000×微量元素1mL，琼脂粉9g，用去离子水定容至1L，调节pH值至6.5。
CM蔗糖再生培养基：蔗糖200g，蛋白胨2g、酵母提取物1g、酪蛋白水解物1g、20×硝酸盐50mL、1000×维生素1mL、1000×微量元素1mL，琼脂粉9g，用去离子水定容至1L，调节pH值至6.5。
PSA再生培养基：蔗糖274g(0.8mol/L)、马铃薯200g，琼脂粉9g，用去离子水定容至1L。
YPS再生培养基：蔗糖200g，酵母提取物6g，酪蛋白水解物6g，琼脂粉9g，用去离子水定容至1L。
其中，所述20×硝酸盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分均与实施例1步骤1(2)中相同。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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