专利摘要
专利摘要
本发明提供了一种奶香基料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将黄油、乳清粉和水混合后灭菌，然后将所述黄油、乳清粉和水的混合物调节至室温后加入共固定化酶酶解，酶解结束后除去所述共固定化酶或者使所述共固定化酶失活，取上层油相，即为所述奶香基料；其中所述共固定化酶由以下方法制备而成：(1)在海藻酸钠溶液中加入脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD，搅拌均匀后得到共混液；(2)将步骤(1)得到的共混液滴入CaCl2水溶液中，静置固化后形成凝胶颗粒，制得的凝胶颗粒即为所述共固定化酶。采用该方法制备的奶香基料奶香味浓厚、奶香纯正、愉悦度好，可用于制作饼干，制备的饼干奶香味明显，香气浓郁。
权利要求
1.一种奶香基料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将黄油、乳清粉和水混合后灭菌，然后将所述黄油、乳清粉和水的混合物调节至室温后加入共固定化酶酶解，酶解结束后除去所述共固定化酶或者使所述共固定化酶失活，取上层油相，即为所述奶香基料；
其中所述共固定化酶由以下方法制备而成：
(1)在海藻酸钠溶液中加入脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD，搅拌均匀后得到共混液；
(2)将步骤(1)得到的共混液滴入CaCl2水溶液中，静置固化后形成凝胶颗粒，制得的凝胶颗粒即为所述共固定化酶。
2.根据权利要求1所述的奶香基料的制备方法，其特征在于，所述共固定化酶与所述黄油的重量比为0.5:1～1.5:1。
3.根据权利要求1所述的奶香基料的制备方法，其特征在于，所述酶解温度为30～40℃，所述酶解时的转速为150r/min，所述酶解时间为1～3h。
4.根据权利要求1所述的奶香基料的制备方法，其特征在于，所述灭菌温度为75℃，灭菌时间为20min。
5.根据权利要求1所述的奶香基料的制备方法，其特征在于，所述乳清粉的重量是所述黄油重量的12.5％，所述水的重量是所述黄油重量的60％。
6.根据权利要求1所述的奶香基料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的总重量为所述海藻酸钠重量的2.2％-3.52％，所述脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的重量比为脂肪酶A6：脂肪酶MER：蛋白酶MSD＝2:1：0.3。
7.根据权利要求1所述的奶香基料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中海藻酸钠溶液是pH为6.0～8.0、质量分数为1.0％～2.0％的海藻酸钠溶液；所述步骤(2)中CaCl2水溶液是质量分数为3.0％～6.0％的CaCl2水溶液。
8.根据权利要求1所述的奶香基料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中固化温度为20～35℃，固化时间为20～40min。
9.一种采用如权利要求1-8任一所述方法制备而成的奶香基料。
10.如权利要求9所述的奶香基料在制备饼干中的用途。
说明书
技术领域
本发明涉及一种香料的制备方法，具体涉及一种奶香基料的制备方法。
背景技术
德国生理学家威廉·屈内于1878年首次提出了酶这一概念。酶，俗称酵素，是植物、动物、微生物和人体细胞合成生产的一类特殊蛋白质。由于酶具有提高生物化学反应速度和反应质量的催化能力，通常被称为生物催化剂。和传统催化剂相比，酶具有高效性、专一性、多样性、反应条件温和等优点，被广泛应用于各个领域。但其在酸、碱、热及有机溶液等条件下易发生酶蛋白的变性，使酶活降低或丧失，且酶反应多在溶液中进行，反应后不易回收，反应产物分离提纯困难，难以实现工业上的连续化、自动化生产，因此酶工程的应用发展受到了很大的限制。
固定化酶是运用化学或物理方法，对酶进行相应处理，使得原本水溶性较强的酶与固态的不溶于水的载体相互结合，或者被载体包埋，使两者形成一个统一的整体。
经固定化后，固定化酶具有比游离酶更多的优点:
(1)固定化酶与底物、产物较易分离，反应结束后经离心或过滤等简单的操作就可回收固定化酶，且酶活力降低较少，可重复多批次使用，减少了生产成本；
(2)经固定化处理后，一般稳定性会有较大提高，对pH稳定性、热稳定性等提高，对抑制剂的敏感性下降。
(3)固定化酶适用于自动化、连续化生产，易控制催化过程，而且不会将酶蛋白带进产品中导致酶的残留，简化后期提纯工艺，提高了酶的利用效率，降低了生产成本。
当然，固定化酶存在缺点:
(1)固定化时会损失部分酶活；
(2)酶的固定化需要设备和载体，增加了生产成本；
(3)只当底物可溶时固定化酶才适用，且不太适用于大分子底物；
(4)微生物分泌的胞内酶在分离后才能固定化。
随着固定化酶研究的不断深入，固定化方法慢慢过渡到了多种方法的组合。但是发展至今，几乎没有一种固定化技术适用于任何一种酶，因此要根据具体酶的特性和应用目的，选择合适的固定化方法。
酶的固定化方法可分为4类:吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。
吸附法是最早使用的酶的固定化方法之一，吸附法是利用范德华力、离子键、氢键、物理吸附等作用力,把酶固定在载体上的固定方式。一般可分为物理吸附法和离子吸附法。
鲁玉侠利用吸附法将脂肪酶固定在大孔阴离子树脂D201上，得到的固定化酶有较好的操作稳定性。用制备的固定化酶催化天然黄油进行水解反应，水解产物香气柔和、纯厚。
共价结合法是指通过共价键结合的方法把酶上的非必须功能基与载体表面的功能基结合的固定化方法。
化学交联法是借助双功能或多功能试剂把酶蛋白分子彼此发生交联，使酶分子和双功能团试剂或多功能团试剂之间形成共价键，得到三维的交联网状结构。在此过程中，酶分子之间发生交联的同时，分子内部也存在一定程度的交联。化学交联法可分为交联酶晶体和交联酶聚集体。
包埋法是指酶与载体溶液混合后，借助引发剂发生聚合反应，通过物理作用把酶限定在载体的网络结构中，从而实现酶的固定的方法。其优点是固定化成本低、固定化酶量大、操作简单易行、固定化条件温和、酶分子的稳定性高等，但由于酶被固定在载体的内部空间中，反应底物因为传质阻力的影响需经扩散才能到达酶的活性中心发生催化反应。同时，剧烈的酶解反应有可能会对聚合物的微囊膜或网状结构造成损坏，导致酶泄漏。在载体材料的选择上，聚丙烯酞胺、明胶、卡拉胶、壳聚糖和海藻酸钠等是常见的选择。
高尚欣等研究以海藻酸钠为载体，以CaCl2-壳聚糖溶液为凝固剂，采用包埋的方法固定化菠萝茎蛋白酶。试验表明，此方法制备的固定化酶的热稳定性和最适温度提高，反应pH向碱性偏移，酶学性质得到改善。同时，固定化后的酶还具有良好的可操作性，重复使用4次后，相对酶活力仍保留80％以上，固定化效果较好。
鲁玉侠等海藻酸钠为载体，CaCl2溶液为凝固剂，采用包埋法固定脂肪酶。试验表明，此方法制备的固定化酶的热稳定性较好，60℃下加热1.5h后，固定化酶的酶活力只下降了30％。而且，其还具有良好的操作稳定性，连续反复使用10次，固定化酶的酶活力仍保留95％以上。
共固定化酶始于20世纪80年代，是将两种或两种以上的酶固定于同一载体中形成共固定化体系的一种技术。共固定化酶是以单一酶的固定作为基础，综合考虑共固定化的酶的最佳固定化方法，经常被研究使用的共固定化方法有交联法和包埋法。共固定化酶与普通的固定化酶相比，共固定化酶可充分发挥不同酶的特点，同时将其催化特性结合起来，充分体现协同作用，提高催化效率。同时缩短反应时间和减少反应步骤，实现连续化生产，能够更好的控制产品质量。
但是目前，在国内外有关于共固定酶的相关研究报道并不多，且主要集中于糖化酶方面，关于共固定化蛋白酶和脂肪酶的有关研究较少。脂肪酶和蛋白酶是工业化生产应用中最广泛的两种酶类，具有广阔的发展前景。若把脂肪酶和蛋白酶共固定在同一载体上，将其作为酶反应器，可以实现工业化生产，简化工艺，降低成本。
高居易等以脱乙酰壳多糖作为载体，以戊二醛作为交联剂，将木瓜蛋白酶和胰蛋白酶共固定在载体上，其活性比单酶固定化提高了25％，该方法被广泛地应用于酒类的抗混浊、澄清等生产中。
刘自琴的研究探讨了不同蛋白酶对脂肪酶活力的影响，结果发现胰蛋白酶对脂肪酶Palatase 20000L的活力有提高作用。同时通过研究共固定化的方法，成功将蛋白酶和脂肪酶共固定化在大孔树脂上，可有效提高蛋白酶的活力且对脂肪酶的活力损失较少。
奶香香精是香精香料领域中投资最大、开发研究最为活跃的香精之一，可以给食品原料赋香，矫正不良气味，弥补食品中原香气的不足，辅助和稳定食品中固有香气。而以酶解乳脂为基料的复合型奶香香精能克服了调配型奶香香精口感单薄的缺陷，是当前研究的热点。但由于酶的造价比较高，使用游离酶进行酶解反应时，酶只能使用一次而不能回收，导致产物的生产成本较高且后续分离步骤复杂，影响了利用酶应用的商业化。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和酶催化反应特性，同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。而且，对蛋白酶和脂肪酶进行共固定化可充分体现协同作用，提高催化效率，缩短反应时间和减少反应步骤，实现连续化生产，能够更好的控制产品质量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种奶香基料的制备方法，本发明还提供了采用该方法制备的奶香基料。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种奶香基料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将黄油、乳清粉和水混合后灭菌，然后将所述黄油、乳清粉和水的混合物调节至室温后加入共固定化酶酶解，酶解结束后除去所述共固定化酶或者使所述共固定化酶失活，取上层油相，即为所述奶香基料；
其中所述共固定化酶由以下方法制备而成：
(1)在海藻酸钠溶液中加入脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD，搅拌均匀后得到共混液；
(2)将步骤(1)得到的共混液滴入CaCl2水溶液中，静置固化后形成凝胶颗粒，制得的凝胶颗粒即为所述共固定化酶。
优选地，所述共固定化酶与所述黄油的重量比为0.5:1～1.5:1。更优选地，所述共固定化酶与所述黄油的重量比为1:1。
优选地，所述酶解温度为30～40℃。更优选地，所述酶解温度为40℃。
优选地，所述酶解时的转速为150r/min，所述酶解时间为1～3h。更优选地，所述酶解时间为2h。
优选地，所述灭菌温度为75℃，灭菌时间为20min。
优选地，所述乳清粉的重量是所述黄油重量的12.5％，所述水的重量是所述黄油重量的60％。
优选地，所述步骤(1)中脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的总重量为所述海藻酸钠重量的2.2％-3.52％，所述脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的重量比为脂肪酶A6：脂肪酶MER：蛋白酶MSD＝2:1：0.3。更优选地，所述步骤(1)中脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的总重量为所述海藻酸钠重量的3.0％，所述脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD的重量比为脂肪酶A6：脂肪酶MER：蛋白酶MSD＝2:1：0.3。
优选地，所述步骤(1)中海藻酸钠溶液是pH为6.0～8.0、质量分数为1.0％～2.0％的海藻酸钠溶液；所述步骤(2)中CaCl2水溶液是质量分数为3.0％～6.0％的CaCl2水溶液。更优选地，所述步骤(1)中海藻酸钠溶液是pH为6.5、质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液；所述海藻酸钠溶液由以下方法制备而成：将海藻酸钠固体加入到pH 6.5的磷酸缓冲溶液，加热溶解，配成质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液。更优选地，所述步骤(2)中CaCl2水溶液是质量分数为4.0％的CaCl2水溶液。
优选地，所述步骤(2)中固化温度为20～35℃，固化时间为20～40min。更优选地，所述步骤(2)中固化温度为30℃，固化时间为30min。
本发明还提供了采用上述所述方法制备而成的奶香基料。
本发明提供了上述所述的奶香基料在制备饼干中的用途。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种奶香基料的制备方法，采用该方法制备的奶香基料奶香味浓厚、奶香纯正、愉悦度好，可用于制作饼干，制备的饼干奶香味明显，香气浓郁。
附图说明
图1为本发明实施例1中牛血清白蛋白标准曲线图；
图2为本发明实施例1中pH值对共固定化酶活力和固定化率的影响的折线图；
图3为本发明实施例1中海藻酸钠浓度对共固定化酶活力和固定化率的影响的折线图；
图4为本发明实施例1中酶量对共固定化酶活力和固定化率的影响的折线图；
图5为本发明实施例1中CaCl2浓度对共固定化酶活力和固定化率的影响的折线图；
图6为本发明实施例1中共固定化温度对共固定化酶活力和固定化率的影响的折线图；
图7为本发明实施例1中共固定化时间对共固定化酶活力和固定化率的影响的折线图；
图8为本发明实施例1中共固定化酶在20℃时的热稳定性的折线图；
图9为本发明实施例1中共固定化酶在60℃时的热稳定性的折线图；
图10为本发明实施例1中共固定化酶的操作稳定性的折线图；
图11为本发明实施例1中共固定化酶的贮藏稳定性的折线图；
图12为本发明实施例1中共固定化酶添加量对酸价和感官评分的影响的折线图；
图13为本发明实施例1中共固定化酶的酶解时间对酸价和感官评分的影响的折线图；
图14为本发明实施例1中共固定化酶的酶解温度对酸价和感官评分的影响的折线图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明以海藻酸钠作为载体，采用包埋法对蛋白酶MSD、脂肪酶A6和脂肪酶MER进行共固定化，以固定化率和共固定化酶的酶活力为主要指标，对共固定化条件进行了优化，将优化后得到的共固定化酶用于制备奶香基料，以酸价和感官评价为主要指标，对奶香基料的制备工艺进行了优化。
1、材料与方法
1.1 试验材料
(1)黄油为市售上多美鲜无盐黄油(乳糖0％，蛋白质0％，脂肪82％)。
(2)乳清粉(乳糖60％，蛋白质9％，脂肪15％)购于广州市日锋畜牧有限公司。
(3)脂肪酶A“天野”6(Lipase A"Amano"6)，简写成脂肪酶A6，由阿玛诺天野酶制剂商贸(上海)有限公司赠送。
(4)脂肪酶MER“天野”(Lipase MER"Amano")，简写脂肪酶MER，由阿玛诺天野酶制剂商贸(上海)有限公司赠送。
(5)蛋白酶M“天野”SD(Protease M“Amano”SD)，简写成蛋白酶MSD，由阿玛诺天野酶制剂商贸(上海)有限公司赠送。
1.2 试验试剂
乙醚、无水乙醇、KOH、邻苯二甲酸氢钾、酚酞指示剂等均为市售分析纯。
1.3 试验主要设备
(1)主要试验设备
表1 试验中主要用到的仪器
(2)其它仪器设备
碱性滴定管、锥形瓶、量筒、烧杯、铁架台、药勺、玻璃棒、移液管、称量纸等。
1.4 试验方法
1.4.1 固定化载体及固定化方法的选择
1.4.1.1 大孔树脂负载壳聚糖膜交联法
称取0.1g壳聚糖溶于100mL质量分数为1％的醋酸中，配成10mg/mL的壳聚糖-醋酸溶液。称取10g大孔树脂和50mL的壳聚糖-醋酸溶液充分混合，在1300Pa状态下50℃水浴旋转抽真空10min，用去离子水洗涤至中性。加入30mL的0.125％戊二醛溶液，20℃静置交联2h。用去离子水洗涤除去残留的戊二醛，直至洗涤液在280nm处的吸收值小于0.01为止。
准确称取1g经预处理的大孔树脂于锥形瓶中，加入10mL去离子水润湿树脂，准确称取10mg游离酶与树脂充分混合，置35℃恒温摇床150r/min振荡吸附1h后，过滤并保留滤液。树脂用去离子水多次洗涤，抽滤后在4℃下保存。
1.4.1.2 大孔树脂吸附法
称取10g树脂置于锥形瓶中，往锥形瓶中加入95％的乙醇，浸泡24h后抽滤，并用去离子水冲洗。树脂用25mL的5％HC1溶液浸泡4h后抽滤，用去离子水洗涤至中性。然后用25mL的5％NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用去离子水洗涤至中性。抽滤后室温保存备用。
准确称取1g经预处理的大孔树脂于锥形瓶中，加入10mL去离子水润湿树脂，准确称取10mg游离酶与树脂充分混合，置35℃恒温摇床150r/min振荡吸附1h后，过滤并保留滤液。树脂用去离子水多次洗涤，抽滤后在4℃下保存。
1.4.1.3 海藻酸钠包埋法
准确称取1g海藻酸钠固体，加入去离子水，加热溶解，配成1％的海藻酸钠溶液。待冷却到45℃后，加入10mg游离酶，充分搅拌均匀后，用5号注射器滴入到100mL质量分数为3％的CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，35℃下静置固化1h。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后在4℃下保存。
1.4.1.4 壳聚糖包埋法
准确称取1g壳聚糖固体，加入1％醋酸溶液，搅拌溶解，配成1％的壳聚糖醋酸溶液。待冷却到45℃后，加入10mg游离酶，充分搅拌均匀后，用5号注射器滴入到100mL质量分数为1％的NaOH溶液中，形成凝胶颗粒，35℃下静置固化1h。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后在4℃下保存。
1.4.2 共固定化条件优化对酶活力的影响
1.4.2.1 pH值对共固定化酶活力的影响
分别称取0.50g海藻酸钠固体加入7个锥形瓶中，加入pH分别是5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸缓冲溶液，加热溶解，配成1.0％的海藻酸钠溶液。待冷却后，各加入0.0080g脂肪酶A6、0.0040g脂肪酶MER和0.0012g蛋白酶MSD，充分搅拌均匀后，用5号注射器滴入到50mL质量分数为3.0％的CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，35℃下静置固化20min。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后备用。
分别称取10g固定化酶放入7个锥形瓶中，然后分别加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应1h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
1.4.2.2 海藻酸钠浓度对共固定化酶活力的影响
分别称取海藻酸钠固体0.25g、0.50g、0.75g、1.0g、1.25g，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液，加热溶解，配成质量分数为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％的海藻酸钠溶液。待冷却后，各加入0.0080g脂肪酶A6、0.0040g脂肪酶MER和0.0012g蛋白酶MSD，充分搅拌均匀后，用5号注射器滴入到50mL质量分数为3.0％的CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，35℃下静置固化20min。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后备用。
分别称取10g固定化酶放入5个锥形瓶中，然后分别加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应1h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
1.4.2.3 酶量对共固定化酶活力的影响
在6个锥形瓶中分别称取0.75g海藻酸钠固体，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液，加热溶解，配成质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液。待冷却后，分别加入脂肪酶A6，加酶量为黄油质量的0.080％、0.100％、0.120％、0.140％、0.160％、0.180％；分别加入脂肪酶MER，加酶量为0.040％、0.050％、0.060％、0.070％、0.080％、0.090％；分别加入蛋白酶MSD，加酶量为0.012％、0.015％、0.018％、0.021％、0.027％、0.03％。充分搅拌均匀后，用5号注射器滴入到50mL质量分数为3.0％的CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，35℃下静置固化20min。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后备用。
分别称取10g固定化酶放入6个锥形瓶中，然后分别加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应1h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
1.4.2.4 CaCl2浓度对共固定化酶活力的影响
在6个锥形瓶中分别称取0.75g海藻酸钠固体，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液，加热溶解，配成质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液。待冷却后，分别加入0.0140g脂肪酶A6、0.0070g脂肪酶MER和0.0021g蛋白酶MSD，充分搅拌均匀后，用5号注射器滴入到50mL质量分数分别为1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％的CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，35℃下静置固化20min。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后备用。
分别称取10g固定化酶放入6个锥形瓶中，然后分别加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应1h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
1.4.2.5 共固定化温度对共固定化酶活力的影响
在6个锥形瓶中分别称取0.75g海藻酸钠固体，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液，加热溶解，配成质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液。待冷却后，分别加入0.0140g脂肪酶A6、0.0070g脂肪酶MER和0.0021g蛋白酶MSD，充分搅拌均匀后，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃水浴的条件下，用5号注射器滴入到50mL质量分数为4.0％的CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，静置固化20min。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后备用。
分别称取10g固定化酶放入6个锥形瓶中，然后分别加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应1h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
1.4.2.6 共固定化时间对共固定化酶活力的影响
在5个锥形瓶中分别称取0.75g海藻酸钠固体，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液，加热溶解，配成质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液。待冷却后，分别加入0.0140g脂肪酶A6、0.0070g脂肪酶MER和0.0021g蛋白酶MSD，充分搅拌均匀后，用5号注射器滴入到50mL质量分数为4.0％的CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，30℃下分别静置固化10min、20min、30min、40min、50min。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后备用。
分别称取10g固定化酶放入5个锥形瓶中，然后分别加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应1h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
1.4.3 共固定化酶的稳定性
1.4.3.1 共固定化酶的热稳定性
将共固定化酶置于20℃的恒温水浴箱中分别水浴0min、30min、60min、90min、120min、150min。水浴后称取10g固定化酶放入锥形瓶中，然后分别加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应2h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
将共固定化酶置于60℃的恒温水浴箱中分别水浴0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min。水浴后称取10g固定化酶放入锥形瓶中，然后分别加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应2h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
1.4.3.2 共固定化酶的操作稳定性
称取10g固定化酶放入锥形瓶中，然后加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应2h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。过滤后的固定化酶用去离子水洗涤，抽滤后继续重复上述步骤，考察共固定化酶酶活力随使用次数的变化。
1.4.3.3 共固定化酶的贮藏稳定性
将共固定化酶置于4℃的冰箱中保藏0、2、4、6、8、10天。每次称取10g固定化酶放入锥形瓶中，然后加入6g去离子水和10g黄油，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应2h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，判断固定化酶的酶活力。
1.4.4 奶香基料的制备
1.4.4.1 共固定化酶添加量
分别往6个锥形瓶中加入10g黄油作为底物，辅底物乳清粉添加量为0.125g(黄油质量的12.5％)，加水量为6g(黄油质量的60％)，置于恒温水浴锅中(75℃，20min)灭菌后，冷却至室温后再分别添加共固定化酶，添加量与黄油的比例为0、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应2h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，并对产生的香气进行感官评价。
1.4.4.2 共固定化酶的酶解时间
分别往6个锥形瓶中加入10g黄油作为底物，辅底物乳清粉添加量为0.125g(黄油质量的12.5％)，加水量为6g(黄油质量的60％)，置于恒温水浴锅中(75℃，20min)灭菌后，冷却至室温后再分别添加共固定化酶10g(共固定化酶添加量与黄油质量的比例1：1)，置于恒温摇床中(35℃，150r/min)反应2h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，并对产生的香气进行感官评价。
1.4.4.3 共固定化酶的酶解温度
分别往6个锥形瓶中加入10g黄油作为底物，辅底物乳清粉添加量为0.125g(黄油质量的12.5％)，加水量为6g(黄油质量的60％)，置于恒温水浴锅中(75℃，20min)灭菌后，冷却至室温后再分别添加共固定化酶10g(共固定化酶添加量与黄油质量的比例1：1)，分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃的恒温摇床中150r/min反应2h。滤出固定化酶后3000r/min离心15min，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，并对产生的香气进行感官评价。
1.5 酸价
1.5.1 试剂
(1)中性乙醚乙醇混合液：将乙醚和乙醇按照1：1的比例混合，加入3滴酚酞指示剂，用氢氧化钾滴定液至指示剂显中性。
(2)酚酞指示剂：10g/L，10g的酚酞溶解于1L的95％乙醇溶液。
(3)氢氧化钾乙醇溶液(c(KOH)＝0.050mol/L)：称取4g氢氧化钾于聚乙烯容器中，加5ml水溶解，用95％乙醇稀释至1L，密闭放置24h[17]。
1.5.2 氢氧化钾乙醇溶液的标定
准确称取0.375g于105℃-110℃干燥至恒重的邻苯二甲酸氢钾，溶加入50ml无二氧化碳的水溶解，加入2滴酚酞指示剂，用氢氧化钾乙醇溶液滴定至呈粉红色，同时做空白试验。氢氧化钾乙醇溶液浓度按下列式子计算。
式中：m-邻苯二甲酸氢钾的质量，g；
V1-消耗氢氧化钾乙醇溶液的体积，mL；
V2-空白试验消耗氢氧化钾乙醇溶液的体积，mL；
204.22-邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量
1.5.3 酸价的测定
准确称取奶香基料1.0g放入锥形瓶中，加入10mL中性乙醚乙醇混合液使油样溶解，滴加2滴酚酞指示剂，用氢氧化钾乙醇标准溶液滴定至出现微红色，色泽变化维持30s，记录消耗的氢氧化钾乙醇标准溶液的用量[18]。
奶香基料的酸价按以下式子计算：
式中：X-奶香基料的酸价，mg/g；
V-滴定消耗的氢氧化钾乙醇标准溶液体积，mL；
c-氢氧化钾乙醇标准溶液的实际浓度，mol/L；
m-奶香基料试样质量，g；
56.11-氢氧化钾的摩尔质量，g/mol。
1.6 相对酶活力
在同一组数据中将实验值最高点的值记作100％，其他实验点的值与这个点的比值，就是酶的相对活力，用百分数表示。
1.7 蛋白含量测定
共固定化时滤液中的酶蛋白含量用考马斯亮蓝染色法测定。
1.7.1 试剂
(1)考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g，溶解于50mL质量分数为95％的乙醇中，再加入85％磷酸100mL，用去离子水稀释至1L。
(2)标准蛋白溶液：以牛血清白蛋白作为标准蛋白，准确称取10mg牛血清白蛋白,加水溶解，定容至100mL，配成0.1mg/mL的标准蛋白溶液。
1.7.2 绘制牛血清白蛋白标准曲线
取6支干燥的比色管，编号并按表3往比色管中添加试剂。加入试剂后摇匀，静置5min后，以1号样作为空白对照，在595nm处测定其余样的吸光度。实验结果以吸光度为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标绘制标准曲线，如表2。
表2 牛血清白蛋白标准曲线的绘制
1.7.3 样品测定
取滤液1mL于比色管中，加入考马斯亮蓝试剂5mL，摇匀，静置5min后在595nm处测定吸光度。按照标准曲线计算滤液中的蛋白含量。
1.8 固定化率
载体固定化酶蛋白的能力(固定化率)可用下面式子进行计算。
固定化率＝错误！未找到引用源。
式中：m-加入固定化体系初始酶量，mg；
c-固定化后滤液的酶蛋白含量，mg/mL；
V-固定化后滤液的体积，mL。
1.9 奶香基料的应用试验
1.9.1 工艺流程
1.9.2 工艺要点
(1)面团调制：将原辅料按低筋面粉：糖：油：水：膨松剂＝50：20：8：16：0.3的比例备好。将水和油充分搅拌均匀，加入0.125g香精(面粉质量的0.25％)和膨松剂等辅料搅拌均匀。然后加入过筛后的糖粉拌匀，最后加入过筛后的面粉搅拌，搅拌时间应尽量短，防止过多的面筋形成。
(2)辊轧成型：用擀面棒将面团压成厚薄均匀、表面光滑、质地细腻的面片，厚度大概3mm，再用模具将面团印出饼胚形状。
(3)烘烤：烤箱预热至180℃，烤盘上铺一层烘培纸，将成型的饼胚放在烘培纸上。将烤盘放入烤箱中，于180℃烤15min。
(4)冷却：将烤盘取出，待饼干冷却后进行感官评价。
1.9.3 饼干的制作
1.9.3.1 不添加奶香香基
将水和油按比例充分搅拌均匀，加入膨松剂、糖粉和面粉搅拌均匀，辊压成3mm的厚度，用模具印出饼胚形状，放入烤箱(180℃，15min)。
1.9.3.2 添加奶香香基
将水和油按比例充分搅拌均匀，加入面粉质量0.25％的奶香香基，再加入膨松剂、糖粉和面粉搅拌均匀，辊压成3mm的厚度，用模具印出饼胚形状，放入烤箱(180℃，15min)。
1.10 感官评价
选定若干个人组成感官评价鉴定小组，按表3分别对酶解产物的香气强度、香气纯度和留香情况进行评分，评分结果为3者之和，总分为10。评分标准见表3。
表3 香气评分标准
2、结果与分析
2.1 牛血清白蛋白标准曲线
共固定化时滤液中的酶蛋白含量用考马斯亮蓝染色法测定。在合适的条件下，考马斯亮蓝G-250能与蛋白质生成蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收值，蛋白质浓度与化合物蓝色的深浅程度成正比。考马斯亮蓝染色法可以稳定快速地测出酶液中蛋白质的含量，牛血清白蛋白标准曲线如图1所示。
2.2 固定化载体及固定化方法的选择
固定化载体是影响固定化酶的稳定性和酶活力，而选择合适的固定化载体有利于提高固定化酶的各项性能。固定化酶的性能除取决于固定化所使用的载体外还取决于固定化方法。但是不同种类的酶的等电点、平均直径、亲疏水性等性质有显著差异，因此几乎没有一种固定化方法适用于任何一种酶，所以要根据具体酶的特性，选择合适的固定化方法。
实验中选择四种载体，采用了吸附法、交联法和包埋法，分别对脂肪酶A6、脂肪酶MER和蛋白酶MSD进行固定化试验，测定不同载体和固定化方法对固定化率的影响，结果如表4所示。
表4 不同载体和固定化方法对固定化率的影响(％)
由表4可见，以壳聚糖为载体对三种游离酶采用包埋的方法进行固定化效果并不理想。对于脂肪酶A6，用海藻酸钠直接包埋的固定化方法效果最好，固定化率为97.8％。对于脂肪酶MER，以大孔树脂X-5为载体负载壳聚糖膜交联法进行固定化和用海藻酸钠直接包埋效果较好，固定化率分别为99.1％和98.2％。而蛋白酶MSD采用以海藻酸钠为载体直接包埋的固定化率最高。综上所述，三种酶采用以海藻酸钠为载体直接包埋的固定化效果较为理想，固定化率在97％以上，可以考虑采用以海藻酸钠为载体直接包埋的方法对三种酶进行共固定化。
2.3 共固定化条件优化对酶活力的影响
2.3.1 pH值对共固定化酶活力的影响
在酶的固定化反应中，由于固定化载体和酶都存在于缓冲液中，而缓冲液的pH可以改变固定化载体和酶分子的离子化状态；此外，酶作为一种蛋白质，当体系的pH值超出范围时，其微观结构将会发生改变，从而造成酶变性失活。因此缓冲液pH值是影响固定化酶酶活力和固定化率的重要因素之一。
从图2中可以看出，在pH6.5以下，随着固定化体系pH的增大，固定化率呈现增大的趋势。当pH值为6.5时，固定化率为98％，达到最高；此时测得酸价为1.16mg/g，共固定化酶酶活力也最高。可能是在其他条件一致时，固定化酶的固定化率越高，单位质量的固定化酶中酶含量越高，酶解产物酸价越大。pH大于6.5时，随着固定化体系pH的增大，固定化率在97.5％-98％左右，变化不大，共固定化酶的酶活力变化也较为平缓。所以，共固定化的最佳pH为6.5。
2.3.2 海藻酸钠浓度对共固定化酶活力的影响
汤鸣强曾研究过，海藻酸钠不仅影响溶液的黏度、胶粒的圆整度和机械强度，还影响到固定化酶活力。海藻酸钠有强烈的吸附性，可与铜、钙等正二价阳离子形成凝胶。海藻酸钠浓度太大时，凝胶孔径较小，影响底物与酶的结合。海藻酸钠浓度太小时，凝胶孔径较大，固定化酶易流失，酶活力较低。所以在共固定化过程中海藻酸钠应有一个最佳的浓度值。
如图3，在制备固定化酶时，可以明显地看到当海藻酸钠浓度小于0.5％时，形成的凝胶结构不稳定，无法形成凝胶颗粒。当海藻酸钠浓度为0.5％时，最终形成不规则的胶粒，且颗粒较为柔软，机械强度差，导致制备的海藻酸钠微球容易破壁，使得大部分的游离酶无法固定。当海藻酸钠浓度为1.0％-1.5％时，固定化酶的固定化率较高，制备的胶粒机械性能好，所测得的酸价较高，固定化酶活力较高。可能是适当地增加载体海藻酸钠的浓度会使其可承载酶蛋白分子的能力增强，故固定化率增大。继续增加海藻酸钠的浓度，固定化率及酸价反而下降。原因可能是当海藻酸钠浓度较高时，固定在单位质量海藻酸钠上的酶减少，固定化率下降；形成固定化酶胶粒的薄层太厚，被包埋的酶与底物之间的传质阻力增大，从而使得固定化酶活力下降。当海藻酸钠浓度大于2.5％时，则很快凝固且不易操作，很难将海藻酸钠溶液从注射器中挤出。故选用质量分数为1.5％的海藻酸钠进行共固定化较适宜。
2.3.3 酶量对共固定化酶活力的影响
在进行固定化酶时，当载体含量与给酶量相适宜时才能达到最理想的固定化效果，否则，当载体含量相对过低时就会造成部分游离酶无法与载体结合，造成不必要的浪费，当载体含量相对过高时则会造成载体无法充分发挥其结合酶蛋白的能力，一定程度上也提高了固定化成本。因此，选择最适宜的给酶量有利于提高固定化酶的效益。
如图4，当海藻酸钠浓度不变时，随着给酶量的增加，固定化率也增大，固定化酶的酶活力呈先上升后下降的趋势。给酶量小于27mg/g海藻酸钠时，固定化率增加趋势比较明显，说明当给酶量较小时，单位载体的固定化并未出现饱和，因此随着给酶量增加，固定化率增加增大。而当给酶量大于27mg/g海藻酸钠时，固定化率曲线变得平缓，说明此时固定化己经接近饱和。当给酶量为30mg/g海藻酸钠时，固定化酶的酶活力达到最大值，此时测得酸价为1.73mg/g。这是因为在载体量不变的条件下，当给酶量相对较少时，载体包埋的酶蛋白也较少，使载体没有被充分利用，因此酶活性也很低。然而当给酶量相对较多时，载体所包埋的酶蛋白也较多，从而造成酶蛋白相互聚集成团，酶分子的活性中心可能被遮盖，影响酶与底物结合，尽管海藻酸钠包埋的酶量很多，但酶活性仍很低。所以，共固定化的最佳给酶量是30mg/g海藻酸钠。
2.3.4 CaCl2浓度对共固定化酶活力的影响
Ca2+与海藻酸钠形成海藻酸钙凝胶是固定化酶的重要过程。CaCl2作为凝固剂即决定固定化酶的机械强度，也决定了固定化酶的固定化“牢固”程度。
结果如图5所示，共固定化酶的固定化率及酶活力随CaCl2浓度的增大而增大，当CaCl2浓度达到4.0％时，共固定化酶的固定化率及酶活力达到最高，而且大部分凝胶颗粒成有规则的球形。CaCl2浓度继续增加时，固定化率变化不大，共固定化酶的酶活力随CaCl2浓度的增大而下降。可能的原因是当CaCl2浓度过低，共固定时包埋不完全，部分酶无法固定到凝胶颗粒中，固定化率较低；固定化所得的凝胶颗粒较柔软，机械强度弱，洗涤时损失较多的酶活，固定化酶的酶活力较低。当CaCl2浓度过高时，凝胶颗粒表面会形成一层致密的海藻酸钙层，不利于底物的扩散，使固定化酶的酶活力下降。因此，共固定化的最佳CaCl2浓度是4.0％。
2.3.5 温度对共固定化酶活力的影响
适当的温度可增加酶分子的动能，提高酶与载体间的接触率，从而增大固定化效率。但是酶作为一种蛋白质，高温容易造成其变性失活。
从图6可以看出，温度不超过30℃时，固定化的温度对共固定化酶酶活力影响并不是很大。温度超过30℃时，固定化酶酶活力呈下降趋势。20℃-35℃范围内，固定化率呈上升趋势。35℃时固定化率达最高，固定化率为99.2％。温度继续增大时，固定化率下降。原因可能是当固定化温度较低时，海藻酸钠在低温下会凝固，从而加大了操作的难度，固定化率较低；由于温度较低，温度对固定化酶酶活力影响并不大。所以，共固定化的最佳温度时30℃。
2.3.6 时间对共固定化酶活力的影响
固定化时间指的是酶与海藻酸钠的混合液滴落到CaCl2后静置反应的时间。
由图7可知，固定化时间对固定化率的影响不明显，随着固定化时间的增加，固定化率始终维持在98％左右，固定化率较高。而固定化酶酶活力随着固定化时间的增大呈先上升后下降的趋势。这是因为海藻酸钠与CaCl2反应并形成凝胶颗粒的过程是需要时间的。共固定化初期，包埋渐渐紧密，流失减少，固定化酶酶活力呈上升趋势；30min后固定化酶酶活力达到最大，此时测得酸价为1.69mgKOH/g；但是时间继续增加会使Ca2+与酶作用，并且凝胶过于紧密，影响底物与酶结合，影响共固定化酶酶活力。故选择最适的固定化时间为30min。
2.4 共固定化酶的稳定性
2.4.1 共固定化酶的热稳定性
温度对酶的影响十分复杂，温度影响酶蛋白分子的构象、参与酶促反应功能团的解离状态，还影响到底物与酶的亲和力。
从图8可得，共固定化酶在20℃下水浴150min后仍然保留81.4％的酶活力，热稳定性较好。可能是因为载体提供了一种环境，对酶起了保护作用。
从图9可知，共固定化酶在60℃下水浴时，酶活力下降幅度较大。0-20min时，酶活力下降较快；20min后，酶活力变化不大，相对酶活力保持在70％-75％左右。共固定化酶在60℃时酶活力迅速下降的原因可能是由于高温时酶容易失活以及在较高温度下共固定化酶外层的海藻酸钙会因为温度的升高而软化，使包埋在其中的酶泄漏出来，因此酶活力下降较快。
2.4.2 共固定化酶的操作稳定性
固定化酶的操作稳定性是有别于游离酶的一项重要特征，是反映固定化效果的重要指标。固定化酶的重复利用不但有利于酶解后产物的回收和纯化，而且有利于节约成本。
从图10可以看出，随着使用次数的增加，相对酶活力降低，可能是由于不断搅拌，海藻酸钠载体持水性发生变化，共固定化酶凝胶结构改变，酶从海藻酸钠载体上脱落并与底物接触不断水解。共固定化酶使用4次后，酶活力仍保持原来的92.4％，稳定性较好。与此同时，共固定化酶使用4次后制得的奶香基料与第一次的奶香基料的香气在感官上没有太大差别。
2.4.3 共固定化酶的贮藏稳定性
由图11可见，共固定化酶贮藏0-4天时，酶活力保持在91.8％以上。说明酶与海藻酸钠载体结合后，载体的存在阻止了酶蛋白之间的相互作用，抑制了酶蛋白的变性和降解，使共固定化酶具有一定的贮藏稳定性。共固定化酶贮藏4天以后，其酶活力迅速下降，第10天时固定化酶酶活力是66.8％。酶活力下降的原因可能是海藻酸钠凝胶中的蛋白酶水解脂肪酶，影响脂肪酶的酶活力。
实验结果表明，共固定化的最佳条件是：磷酸缓冲液的pH为6.5，海藻酸钠的浓度为1.5％，总加酶量为30mg/g海藻酸钠(MSD:A6:MER＝0.3：2：1)，CaCl2浓度为4.0％，共固定化的温度为30℃，共固定化的时间是30min。此时共固定化酶的固定化率为98.0％，第4次使用后酶活力仍保持原来的92.4％，贮藏10天后酶活力仍保持原来的66.8％，稳定性较好。
2.5 奶香基料的制备
2.5.1 共固定化酶添加量
酶催化生成奶香基料时，酶的添加量对奶香基料的风味影响较大。酶的添加量较少时，生成的风味物质的量少，奶香味较淡；酶添加量过多时，虽可产生大量的风味物质，却会产生某些不良气味，同时也会增加生产成本。因此，应选择合适的共固定化酶添加量。
表5 共固定化酶添加量对奶香基料的感官影响
由图12和表5可知，当共固定化酶添加量小于黄油质量时，随着共固定化酶的增加，产香效果越好，香气越浓郁。共固定化酶等于黄油质量时，所得到的奶香基料为甜香型奶味，香气浓郁、圆润且回味悠长，此时测得酸价为1.86mg/g。当共固定化酶添加量大于黄油质量时，开始产生酸臊味，且随着加酶量的增加，奶香基料的酸价增加较快，酸臊味越来越严重。综合考虑，最适宜的共固定化酶的添加量与黄油的质量相等。
2.5.2 共固定化酶的酶解时间
为了得到最好的效果和提高生产效率，选择合适的酶解时间也是很重要的。就理论而言，酶解时间越长，酶解反应越彻底。事实上，过长的酶解时间会生成较多的不良风味物质，影响香基的整体风味。但是当酶解时间过短时，酶解反应不完全，风味物质生成过少，风味没有充分形成。要奶香基料达到理想的风味，酶解反应时间应控制好。
表6 酶解时间对奶香基料的感官影响
从图13和表6可以看出，酶解产物的酸价随着酶解时间的增加而增大。当酶解时间是2h时，产香效果最好，所得奶香基料香气浓郁、圆润，并与奶甜味协调，留香时间长，此时酸价为1.70mg/g。当酶解时间超过2h后，酸价继续上升，开始出现酸败味，感官评分下降，可能是黄油的酶解程度过高导致酶解产物中不良风味物质生成。综合考虑，选择酶解最适宜的时间为2h。
2.5.3 共固定化酶的酶解温度
酶对温度较为敏感,温度的不同会影响到酶活性中心的分子构象分布及底物黄油的乳化状态，从而影响到整个酶解反应的进程。当酶解温度低于最适温度时，温度会抑制酶的活性，使酶活力较低，同时也会影响底物的粘度，进而影响传质速度，酶解反应的速度变慢。当酶解温度高于最适温度时，由于高温会导致酶变性而减弱甚至失去催化活性，而且在较高温度下共固定化酶外层的海藻酸钙会软化，使包埋在其中的酶泄漏出来，酶活力下降。
表7 酶解温度对奶香基料的感官影响
由图14和表7可以看见，当酶解温度低于40℃时，随着温度的升高，奶香基料的香气越来越强烈，香气纯度越来越协调、丰富，原因可能是温度的升高促进了酶解反应的进行，风味产物也随之增加。当温度达到40℃时，所得到的奶香基料的感官评分最高，此时的奶香基料是偏奶酪的奶香，奶香较强，香气较纯正圆润，留香时间长，所测得酸价是1.58mg/g。当酶解温度达到45℃时，酶解产物的酸价最高，酸价是3.58mg/g，感官评分降低，可能是因为酶解过度产生不良风味物质。酶解温度超过45℃时，可能是由于酶解温度高于最适温度导致酶变性而减弱甚至失去催化活性，或者是因为共固定化酶外层的海藻酸钙因为温度的升高而软化，使包埋在其中的酶泄漏出来，使酶活力开始下降导致酸价和感官评分降低。综上所述，适宜酶解温度是40℃。
2.6 游离酶与共固定化酶制备奶香基料的比较
虽然固定化酶技术解决了游离酶的生产成本高等问题，但由于酶分子从游离态变成牢固态结合于载体时，酶分子的微观环境发生了变化。因此游离酶和共固定化酶制备的奶香基料在工艺条件和感官评分方面还是存在一些差别。
表8 游离酶与共固定化酶制备奶香基料的比较
由表8可知，虽然在共固定化过程中游离酶和海藻酸钠的使用和共固定化过程中产生了生产成本，但由于固定化酶能重复使用，且酶解工艺更简单，利用固定化酶制备奶香基料可以达到节约生产成本的目的。而游离酶和海藻酸钠制备的奶香基料都是偏奶酪香型奶香，香气较纯正圆润，留香情况较好，感官评分相近，但是游离酶制备的奶香基料的香气比固定化酶制备的奶香基料的香气稍微浓郁一些。可能是海藻酸钠凝胶颗粒在一定程度上妨碍了酶和底物的接触，使某些呈味物质生成较少或无法生成，造成香气强度稍弱。又可能是因为海藻酸钠凝胶颗粒妨碍了某些呈味物质的扩散，使制得的奶香香基的香气较弱。
实验结果表明，制备奶香基料的最佳工艺条件是：以黄油为底物，加水量为黄油重量的60.0％，以乳清粉为辅底物，辅底物添加量为黄油重量的12.5％，共固定化酶的添加量与底物黄油的质量比为1:1，酶解时间是2h，酶解温度是40℃。本发明所得的奶香基料奶香味浓厚、奶香纯正、愉悦度好，可用于制作饼干，制备的饼干奶香味明显，香气浓郁。
2.7 奶香基料的应用试验
将奶香基料应用于饼干，主要是为了验证其耐热性、产香效果和持香性。看看该香基在高温烘烤后是否还留有奶香，其奶香能否保持较长时间。
2.7.1 不加奶香基料的饼干
外表有点褐色不均，饼干表面较平整，但是由于对饼干工艺流程的操作不纯熟，所以做出来的饼干没有想象中的对比没那么酥脆，质地较硬，因为没有添加奶香基料和其他具有奶香气味的辅料如黄油等，味道较单调，吃起来只有面粉味。
2.7.2 添加奶香基料的饼干
添加了奶香基料的饼干，外表有点褐色不均，饼干表面较平整，但是由于对饼干工艺流程的操作不纯熟，所以做出来的饼干没有想象中的对比没那么酥脆，质地较硬。但能闻到较明显的类似奶酪的奶香味，奶香浓郁，奶甜味也改善了一点口感，使加了奶香基料的饼干比不添加奶香基料的饼干更能引起人的食欲。饼干虽然因为制作得不纯熟而达不到酥脆的效果，但还是得到了试吃人员较满意的评价。饼干放置一周后仍带有奶香味。
综上所述，应用奶香基料做成的饼干得到的效果较好。对比不添加奶香基料的饼干，添加了奶香基料的饼干闻起来更香甜，口感更好，味道更加丰富，说明此奶香基料具有一定的耐热性和持香性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
一种奶香基料的制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
动态评分
0.0