专利摘要

本发明涉及一种可产生β‑citraurinene的柑橘愈伤细胞，其为带有CrtB基因超表达框和CCD4b基因超表达框的柑橘愈伤细胞，还涉及上述柑橘愈伤细胞在生产β‑citraurinene中的应用，还涉及一种生产β‑citraurinene的方法，包括培养上述柑橘愈伤细胞并提取β‑citraurinene的步骤。通过使用本发明的柑橘愈伤细胞和方法，进行愈伤细胞培养即可生产出β‑citraurinene，解决了供应周期限制(从植物提取只能在12月份果实成熟后)，摆脱了外界自然环境条件影响，此外愈伤细胞中类胡萝卜素种类少，在愈伤中大量生成该物质后，更利于纯化，这些优势将更有利于大量生产这种C30的稀有类胡萝卜素，适用于生物工厂化生产该物质。

权利要求

1.一种可产生β-citraurinene的柑橘愈伤细胞，其特征在于，为带有CrtB基因超表达框和CCD4b基因超表达框的柑橘愈伤细胞。

2.根据权利要求1所述的柑橘愈伤细胞，其特征在于，所述CrtB基因编码的蛋白序列为SEQ ID NO:1。

3.根据权利要求1所述的柑橘愈伤细胞，其特征在于，所述CCD4b基因编码的蛋白序列为SEQ ID NO:2。

4.根据权利要求1所述的柑橘愈伤细胞，其特征在于，所述柑橘愈伤细胞还带有HYD基因超表达框。

5.根据权利要求4所述的柑橘愈伤细胞，其特征在于，所述HYD基因编码的蛋白序列为SEQ ID NO:3。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的柑橘愈伤细胞，其特征在于，所述柑橘愈伤细胞衍生自马叙葡萄柚。

7.权利要求1-6中任一项所述的柑橘愈伤细胞在生产β-citraurinene中的应用。

8.一种生产β-citraurinene的方法，其特征在于，包括培养权利要求1-6中任一项所述的柑橘愈伤细胞并提取β-citraurinene的步骤。

说明书

技术领域

本发明涉及组织代谢工程领域，更特别地，涉及一种可产生β-citraurinene的柑橘愈伤细胞及其应用。

背景技术

类胡萝卜素是自然界广泛存在的一种重要的天然色素，是一类由异戊二烯骨架构成的C40或C30的萜类物质。类胡萝卜素分子呈现黄色、橙色或红色，为人类生活点缀出色彩斑斓的世界。随着类胡萝卜素研究的深入，越来越多的研究表明，类胡萝卜素及其衍生物质是人类营养健康的重要保健产品，对人类健康和食品加工具有重要的作用。一些类胡萝卜素组分具有提高人体免疫力，减少心血管疾病的风险，预防慢性疾病和癌症，保障人类健康的生殖发育等功效；类胡萝卜素还是食品领域或者纺织领域重要的天然着色剂。类胡萝卜素裂解之后产生的脱辅基胡萝卜素(C30、C20、C27等)中，番红花的花柱产生的藏红花酸和藏红花素是具有C20类胡萝卜素骨架的色素成分，其对多种癌细胞均有明显抑制作用，且在与其他常用抗癌药物配合治疗过程中，可降低抗癌药顺铂等的毒副反应，改善疗效；胭脂素(Bixin)是一种在胭脂树红中发现的C25骨架的的脱辅基类胡萝卜素，由于其着色艳丽，因此常用来作为食品的天然色素添加剂。

目前C30的类胡萝卜素研究的不多，但是最新报道表明其有可能参与人类的免疫反应(Liu H.4,4’-diaponeurosporene,a C30carotenoid,effectively activatesdendritic cellsviaCD36and NF-κB signaling in a ROS independent manner:[J].Oncotarget,2016,7(27):40978.)C30的类胡萝卜素在植物体内报道的不多，主要是柑橘果实中报道的β-柠乌素、β-橙色素和β-citraurinene等物质。前面两种物质已经有公司进行标准品生产了，但是对于第三种物质β-citraurinene(分子式为 )，目前仅有我们的一个专利(申请号201710807932.0)披露了一种HPLC方法分离纯化来得到，尚无文献披露可直接生产β-citraurinene的植物愈伤细胞，也没有报道通过遗传操作的方法构建能够产生β-citraurinene的植物愈伤细胞，使该物质极为稀有，限制了该物质的研究和应用。

因此，需要一种能够产生β-citraurinene的愈伤细胞，以及生产方法。

发明内容

类胡萝卜素双加氧裂解酶CCD4b是类胡萝卜代谢过程中十分重要的酶。然而，发明人在研究过程中发现，当向柑橘愈伤细胞中单独转入CCD4b基因超表达框使其超表达CCD4b时，柑橘愈伤细胞并不能产生β-citraurinene。但是，当在超表达CrtB(八氢番茄红素合成酶)或在同时超表达HYD(胡萝卜素羟基化酶)和CrtB的柑橘愈伤细胞中超表达CCD4b时，出乎意料地，所得到的转基因愈伤细胞能够大量产生β-citraurinene。

基于以上发现，本发明提供了一种可产生β-citraurinene的柑橘愈伤细胞，其为带有CrtB基因超表达框和CCD4b基因超表达框的柑橘愈伤细胞。

在一个优选实施方案中，所述CrtB基因编码的蛋白序列为与SEQ ID NO:1的一致性在85％以上的蛋白序列。

在一个优选实施方案中，所述CCD4b基因编码的蛋白序列为与SEQ ID NO:2的一致性在85％以上的蛋白序列。

在一个优选实施方案中，所述柑橘愈伤细胞还带有HYD基因超表达框。

在一个优选实施方案中，所述HYD基因编码的蛋白序列为与SEQ ID NO:3的一致性在85％以上的蛋白序列。

在一个优选实施方案中，所述柑橘愈伤细胞衍生自马叙葡萄柚。

本发明还提供了上述柑橘愈伤细胞在生产β-citraurinene中的应用。

本发明还提供了一种生产β-citraurinene的方法，包括培养上述柑橘愈伤细胞并提取β-citraurinene的步骤。

通过使用本发明的柑橘愈伤细胞和方法，进行愈伤细胞培养即可生产出β-citraurinene，解决了供应周期限制(从植物提取只能在12月份果实成熟后)，摆脱了外界自然环境条件影响，此外愈伤细胞中类胡萝卜素种类少，在愈伤中大量生成该物质后，更利于纯化，这些优势将更有利于大量生产这种C30的稀有类胡萝卜素，适用于生物工厂化生产该物质。

本发明的方法在愈伤中产生β-citraurinene，相对于果皮来说更方便纯化和提取，果皮中的类胡萝卜素种类很繁多，需要皂化才能得到β-citraurinene，而愈伤不需要皂化大大缩短了纯化β-citraurinene的时间。

附图说明

图1为用于构建OxCCD4b-Rm33的超表达载体PH7WG2D-CCD4b的质粒图谱；

图2为检测多个OxCCD4b-Rm33细胞系中CCD4b表达情况的western照片，4b-Rm33-6表示筛选得到的编号为6的OxCCD4b-Rm33细胞系，4b-Rm33-9和4b-Rm33-22依次类推；；

图3为用于构建Ox4b-HYD-Rm33的超表达载体pB2GW7-CCD4b的质粒图谱；

图4为检测多个Ox4b-HYD-Rm33细胞系中CCD4b表达情况的western照片，4b-HYD-Rm33-3表示筛选得到的编号为3的Ox4b-HYD-Rm33细胞系，4b-HYD-Rm33-9和4b-HYD-Rm33-19依次类推；

图5为Rm33和OxCCD4b-Rm33的HPLC谱图；

图6为OxCCD4b-Rm33经HPLC分离得到的目标物的LC-MS鉴定图；

图7为Rm33和OxCCD4b-Rm33细胞投射电镜图片(TEM投射电镜所使用的愈伤材料为饥饿处理的愈伤组织)；

图8为Rm33和Ox4b-HYD-Rm33的HPLC谱图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.基本实验步骤

1.1农杆菌侵染液的制备

1)农杆菌单克隆活化：将已经检测的携有目的基因的农杆菌单克隆菌液接种于固体LB培养基(spec终浓度100mg/L加少量利福平)，28℃恒温培养箱2d；

2)农杆菌扩繁:挑取单克隆进一步验证阳性，再用接种环蘸取农杆菌阳性的单克隆，划线(密一点)于固体LB平板(含有spec 100mg/L不加利福平)，28℃恒温培养箱2d；

3)准备农杆菌侵染液：在超净台内，用枪头吸取含20mg/L(100μmol/L)AS(乙酰丁香酮，提前加入有助于活化农杆菌的vir区)的MT悬浮培养基于LB平板中,吸打均匀，并置于220r/min，28℃恒温摇床内20min；

4)用紫外分光光度计测定农杆菌菌液浓度,调整至OD600在0.6左右。

1.2外植体(愈伤)的准备

胚性愈伤组织于MT固体培养基上光照培养，每隔18-20天继代一次。取继代培养20d左右长势良好的愈伤组织，置于MT液体悬浮培养基中，在110rpm下于暗处培养4d。

1.3侵染及共培养

取MT悬浮培养4d的愈伤组织(注意检查是否污染)，倒掉三角瓶中的液体培养基，用灭菌完全的镊子将愈伤放置于无菌的滤纸上，吸干多余水分，使愈伤尽可能的干燥。用镊子夹取愈伤到第一步制备好的农杆菌侵染液中。用手晃动5min，待充分混合后再静置20min。倒去菌液，将愈伤组织铺于无菌滤纸表面，并用无菌滤纸将愈伤多余水分吸干(不要太干燥，菌液被吸干净就行)，用镊子夹取愈伤铺在装有一层铺有滤纸的MT共培养基上(pH值5.7，利于农杆菌侵染)，于20～22℃培养箱中黑暗共培养3天。

1.4筛选培养

用镊子夹取共培养3天的愈伤组织于无菌滤纸将愈伤多余水分吸干(不吸干容易导致农杆菌污染，但不要太干燥，菌液被吸干净就行)，愈伤均匀地转移至MT培养基中(加50mg/L的潮霉素+400mg/L Cef，或50mg/L kana，或25mg/L Basta)固体培养基上(此时培养基要倒厚一些，因为要培养1～2个月)。愈伤不要铺的太厚，也不要太密。于28℃培养箱暗培养1～2个月，直到长出抗性愈伤为止。

1.5阳性鉴定和HPLC检测

抗性愈伤长出来之后，进行阳性鉴定，并进行实时荧光定量检测，选择表达量较高的愈伤系，提取类胡萝卜素进行HPLC检测。选取β-citraurinene产量高的愈伤细胞进行培养条件优化和扩大生产。

2.愈伤细胞系Rm33和Ox-HYD-Rm33的构建

本实验室已经将这两个细胞系发表在Cao,H.,Zhang,J.,Xu,J.,Ye,J.,Yun,Z.,Xu,Q.,...&Deng,X.(2012).Comprehending crystalline β-carotene accumulation bycomparing engineered cell models and the natural carotenoid-rich system ofcitrus.Journal of experimental botany,63(12),4403-4417。

3.用Rm33(来源于上述已发表文献)和Ox-HYD-Rm33(来源于上述已发表文献)构建OxCCD4b-Rm33和Ox4b-HYD-Rm33

从红橘克隆CCD4b基因，插入pH7GW2D中35S启动子的下游，构建CCD4b基因的超表达载体PH7WG2D-CCD4b(图1)。Rm33本身具有kana霉素抗性，因此选用pH7GW2D-CitCCDb载体(潮霉素抗性载体)通过土壤农杆菌的方法导入Rm33中，使用50mg/L终浓度的Hyg进行筛选，得到具有Hyg抗性的阳性愈伤系，简称OxCCD4b-Rm33。

通过western鉴定(图2)可以看出CCD4b的抗体只在超表达CCD4b的愈伤系中能够检测出条带，证明我们构建的愈伤系CCD4b的表达量提高，且能够检测出蛋白表达。

将CCD4b基因插入pB2GW7中35S启动子的下游，构建CCD4b基因的超表达载体pB2GW7-CCD4b(图3)。Ox-HYD-Rm33本身携带Hyg抗性和kana霉素双抗性。因此使用pB2GW7-CitCCD4b载体(Basta抗性)通过土壤农杆菌的方法导入Ox-HYD-Rm33中，使用25mg/L终浓度的Basta进行筛选，得到具有Basta抗性的阳性系愈伤，简称Ox4b-HYD-Rm33。

通过western鉴定(图4)可以看出CCD4b的抗体只在超表达CCD4b的愈伤系中能够检测出条带，证明我们构建的愈伤系CCD4b的表达量提高，且能够检测出蛋白表达。

4.OxCCD4b-Rm33的培养及β-Citraurinene检测

对OxCCD4b-Rm33进行培养，25℃暗处培养，每20天继代一次，并进行扩繁。

收集培养得到的愈伤组织，提取类胡萝卜素进行HPLC检测，以Rm为对照。结果如图5所示，相对于Rm愈伤系来说，大量地积累了β-Citraurinene，并且β-carotene和lutein含量明显降低。

LC-MS的质谱鉴定结果也支撑该峰的确是含有30个C原子分子质量为419的β-Citraurinene(图6)。投射电镜的结果也显示CCD4b和CrtB同时超表达的愈伤系中积累更多的质体小球(图7)。β-Citraurinene是含有羟基的类胡萝卜素，有可能是导致质体小球数量增加的原因。

研究OxCCD4b-Rm33愈伤中CCD4b基因的表达量与β-Citraurinene的含量的相关性，结果如表4所示，随着CCD4b基因的表达量增加，β-Citraurinene含量也增加，说明CCD4b的蛋白表达增加导致了该愈伤中β-Citraurinene的积累，最高可达110.1±8.7μg/g DW的含量。尽管CCD4b的表达量有高有低，但是，与Rm33中不产生β-Citraurinene相比，各株OxCCD4b-Rm33中的β-Citraurinene含量从65至110μg/g DW不等。

表1不同的OxCCD4b-Rm33细胞系中类胡萝卜素的组分

Rm是野生型愈伤，Rm33：CK是代表超表达CrtB的Rm愈伤，Rm33：CCD4b-6表示筛选得到的编号为6的OxCCD4b-Rm33细胞系；Rm：CCD4b-9,22,10依次类推。显著性差异使用ANOVA进行分析：*代表P-value<0.05，**代表P-value<0.01，***代表P-value<0.001

5.Ox4b-HYD-Rm33的培养及β-Citraurinene检测

对Ox4b-HYD-Rm33进行培养，25℃暗培养，每隔20天继代一次，进行扩繁。收集培养得到的愈伤组织，提取类胡萝卜素进行HPLC检测，以CK-HYD-Rm33为对照。结果如图8和表2所示，相对于只超表达HYD和CrtB基因的愈伤系来说，同时超表达CCD4b，HYD和CrtB大量地积累了β-Citraurinene，并且β-carotene和lutein含量明显降低。但是和只超表达CCD4b和CrtB基因的愈伤系相比，目的物质β-citraurinene的含量并没有明显提高，相反还有所降低。所以这个实验从侧面反映CCD4b+CrtB的组合是非常利于高含量β-citraurinene生物合成的含量提高的。

表2不同的OxCCD4b-HYD-Rm33细胞系中类胡萝卜素的组分

HYB-Rm33：CCD4b-3代表同时超表达CCD4b,HYD,CrtB三个基因的细胞系，3,9,19,7,18代表不同的细胞系。

本文中所说的超表达是指目的基因的表达量高于原宿主中表达量。虽然本申请中为了举例的目的使用的马叙葡萄柚衍生的愈伤细胞，但是其他柑橘品种类的愈伤皆在本专利的应用范围之内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>多基因代谢工程构建的产生β-citraurinene的柑橘细胞及应用

<160>3

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>353

<212>PRT

<213>欧文氏菌

<400>1

Met Ala Ser Met Ile Ser Ser Ser Ala Val Thr Thr Val Ser Arg Ala

1 5 1015

Ser Arg Gly Gln Ser Ala Ala Val Ala Pro Phe Gly Gly Leu Lys Ser

202530

Met Thr Gly Phe Pro Val Lys Lys Val Asn Thr Asp Ile Thr Ser Ile

354045

Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys Met Ala Val Gly Ser Lys Ser

505560

Phe Ala Thr Ala Ser Lys Leu Phe Asp Ala Lys Thr Arg Arg Ser Val

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Leu Met Leu Tyr Ser Trp Cys Arg His Cys Asp Asp Val Ile Asp Asp

859095

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100 105 110

Gln Arg Leu Met Gln Leu Glu Met Lys Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Gly

115 120 125

Ser Gln Met His Glu Pro Ala Phe Ala Ala Phe Gln Glu Val Ala Met

130 135 140

Ala His Asp Ile Ala Pro Ala Tyr Ala Phe Asp His Leu Glu Gly Phe

145 150 155 160

Ala Met Asp Val Arg Glu Ala Glu Tyr Ile Gln Leu Asp Asp Thr Leu

165 170 175

Arg Tyr Cys Tyr His Val Ala Gly Val Val Gly Leu Met Met Ala Gln

180 185 190

Ile Met Gly Val Arg Asp Asn Ala Thr Leu Asp Arg Ala Cys Asp Leu

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Gly Leu Ala Phe Gln Leu Thr Asn Ile Ala Arg Asp Ile Val Glu Asp

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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Cys Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gly Leu Pro Leu Arg Ser Ala Trp Ala

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Glu Lys Leu Ser Leu Leu Leu Met Ala Ser Gly Gln Ala Ile Thr Ser

325 330 335

Arg Met Arg Pro His Pro Pro Arg Pro Ala His Leu Trp Gln Arg Pro

340 345 350

Ile

<210>2

<211>563

<212>PRT

<213>红橘

<400>2

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Leu Met Gly Thr Asn Ser Ser Tyr Asn Thr Lys Ser Ala Pro Ser Leu

505560

Phe Thr Asn Ile Ile Asp Arg Pro Leu His Pro Ser Val Asp Pro Lys

65707580

His Val Phe Thr Gly Asn Phe Ala Pro Val Asp Glu Leu Gly Pro Thr

859095

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100 105 110

Tyr Ile Arg Asn Gly Pro Asn Pro Gln His Met Pro Arg Gly Pro Leu

115 120 125

His Phe Phe Glu Gly Asp Gly Met Leu His Ser Met Gln Leu Ser Lys

130 135 140

Gly Arg Ala Ile Tyr Ser Ser Arg Tyr Val Lys Thr Tyr Lys Tyr Lys

145 150 155 160

Leu Glu Arg Asp Ala Gly Gly Gln Ile Phe Pro Asn Val Phe Ser Gly

165 170 175

Phe Tyr Gly Leu Val Asp Met Val Gln Cys Val Ala Ser Thr Ala Arg

180 185 190

Val Leu Met Gly His Val Asn Leu Lys Lys Gly Phe Gly Leu Ala Asn

195 200 205

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210 215 220

Asp Leu Pro Tyr Ile Ile Lys Cys Thr Arg Glu Gly Asp Ile Glu Thr

225 230 235 240

Leu Gly Arg Trp Asp Phe Asp Glu Glu Leu Phe Ala Ser Met Thr Ala

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Gly Val Lys Gln Lys Asp Val Pro Ile Leu Ser Ile Asn Arg Pro Thr

290 295 300

Phe Ile His Asp Phe Ala Ile Thr Lys Arg Phe Ala Ile Phe Ser Glu

305 310 315 320

Thr Gln Leu Ala Val Ser Ala Ala Asn Val Met Leu Gly Lys Gly Met

325 330 335

Pro Thr Val Phe Asp Pro Glu Lys Val Pro Arg Ile Gly Ile Ile Leu

340 345 350

Lys Tyr Ala Thr Ser Asp Ala Glu Met Lys Trp Phe Asn Val Pro Gly

355 360 365

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485 490 495

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Lys Ser Leu

<210>3

<211>319

<212>PRT

<213>水稻

<400>3

Met Ala Val Ala Arg Leu Val Ala Ala Arg Ala Pro Leu Leu Ser Pro

1 5 1015

Ala Ala Val Ala Ala Ala His Arg Ser Pro Pro Ala Leu Leu Arg Leu

202530

Ala Phe Ala Pro Leu Pro Ala Arg Arg Leu Ala Val Pro Leu Arg Val

354045

Ala Val Gly Glu Pro Glu Pro Glu Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Ala

505560

Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gln Ser Glu Arg Arg Thr Tyr Leu Val Ala

65707580

Ala Val Met Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ser Met Ala Ala Ala Ala Val

859095

Tyr Tyr Arg Phe Ala Trp Gln Met Glu Val Gly Asn Thr Pro Ser Pro

100 105 110

Asn Ser Arg Ser His Leu Thr Ile Thr Gln Phe Gly Asn Ser Phe Ala

115 120 125

Ala Ala Leu Lys Phe Leu Arg Val Leu Asp Gln Gly Ser Gly Glu Ile

130 135 140

Pro Val Thr Glu Met Phe Gly Thr Phe Ala Leu Ser Val Gly Ala Ala

145 150 155 160

Val Gly Met Glu Phe Trp Ala Arg Trp Ala His Arg Ala Leu Trp His

165 170 175

Ala Ser Leu Trp His Met His Glu Ser His His Arg Pro Arg Asp Gly

180 185 190

Pro Phe Glu Leu Asn Asp Val Phe Ala Ile Thr Asn Ala Val Pro Ala

195 200 205

Met Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Phe Phe Thr Arg Gly Leu Val Pro Gly

210 215 220

Leu Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly Ile Thr Leu Phe Gly Met Ala Tyr

225 230 235 240

Met Phe Val His Asp Gly Leu Val His Arg Arg Phe Pro Val Gly Pro

245 250 255

Ile Ala Asn Val Pro Tyr Phe Arg Arg Val Ala Ala Ala His Gln Ile

260 265 270

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275 280 285

Pro Lys Glu Leu Glu Glu Val Gly Gly Ile Glu Glu Leu Glu Lys Glu

290 295 300

Ile Lys Arg Arg Ile Lys Arg Lys Glu Thr Leu Asp Ala Ile Gln

305 310 315

多基因代谢工程构建的产生β-citraurinene的柑橘细胞及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。