专利摘要
专利摘要
本发明公开了一种纳米银的生物合成方法，包括以下步骤：梅奇酵母发酵液离心，取离心所得的上清液；将上清液加入至硝酸银溶液中形成反应体系，所述反应体系中Ag+的终浓度为(10±2)mM；调节反应体系的pH为5.0±0.5，在暗环境中反应(6±0.5)d，得含有纳米银的胶体。采用本发明方法合成的生物纳米银具有良好的抑菌效果和生物相容性。
权利要求
1.纳米银的生物合成方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、梅奇酵母发酵液离心，取离心所得的上清液；
梅奇酵母菌，为KCTC 27726的LPP-12Y(Metschnikowia sp.)；
2)、将上清液加入至硝酸银溶液中形成反应体系，所述反应体系中Ag
调节反应体系的pH为5.0±0.5，在暗环境中反应(6±0.5)d，得含有纳米银的胶体。
2.根据权利要求1所述的纳米银的生物合成方法，其特征在于：
将梅奇酵母菌于PDB培养基中培养，所得的发酵液于(5000±500)rpm/min离心4～6分钟；得上清液。
3.根据权利要求1或2所述的纳米银的生物合成方法，其特征在于：
将一接种环的梅奇酵母菌接种至100mL的PDB培养基中，于(200±50)rpm/min的摇床、(28±1)℃培养(72±4)h；得发酵液。
说明书
技术领域
本发明涉及纳米银的生物合成方法，特别是涉及利用梅奇酵母合成生物纳米银的方法。
背景技术
纳米材料(Nano material)指三维空间中至少一维处于纳米级，或以其为基本单元所构成的材料。纳米银(AgNPs)是极具开发价值的新一代纳米材料，它不仅具有纳米材料通常的理化性质，还具有独特生物学和材料学特性，被广泛应用于医学、材料学等领域。生物纳米银(Bio-AgNPs)是利用生物法合成的纳米银材料，其具有合成条件温和、环境友好、材料学特性优良等特点，又具有特殊的抑菌杀菌、生物兼容性优良等生物学特性，近年来受到研究人员的高度重视。
纳米银(AgNPs)的制备方法有物理合成法、化学合成法和生物合成法。最初纳米银主要用物理方法制备，通过固体分散技术(Solid dispersion)将单质银(Ag)直接转变为纳米粒子。物理方法原理清楚、操作简单，通过电磁、机械、激光等方法降低单质银粒径的尺寸，达到纳米级(nm)，使银粒子具有纳米材料的理化性质。但随着物理方法纳米银材料的应用，物理纳米银的缺点暴露出来，如尺寸控制困难、粒径大小均一性差，及成本高等；化学合成法是通过控制化学反应条件，得到纳米级粒径尺寸的银单质，但化学合成反应条件剧烈，化学废液会造成环境污染，产物中也往往含有大量杂质；生物合成法是利用生物提取物或微生物发酵液与含有Ag
微生物具有生长速度快、培养简便和繁殖速度快等特点，可以在短期内批量生产目标产物，在合成生物纳米银的材料来源中具有极大优势。因此利用生物合成纳米银特别是微生物合成纳米银的新型生物合成方法极为重要。
梅奇酵母，目前已知的用途是：抑制果实采后病菌，例如对桃采后褐腐病菌、苹果采后灰霉病菌、苹果采后青霉病菌和梨采后青霉病菌具有抑制作用；对桃采后褐腐病、苹果采后灰霉病、梨采后青霉病、苹果采后青霉病具有抑制作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种纳米银(AgNPs)的生物合成方法，本发明利用梅奇酵母的发酵液合成纳米银(生物纳米银)，纳米银具有良好的抑菌效果。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种纳米银(AgNPs)的生物合成方法，包括以下步骤：
1)、梅奇酵母发酵液离心，取离心所得的上清液；
2)、将上清液加入至硝酸银溶液中形成反应体系，所述反应体系中Ag
调节反应体系的pH为5.0±0.5，在暗环境中反应(6±0.5)d，得含有纳米银(生物纳米银)的胶体。
作为本发明的纳米银(AgNPs)的生物合成方法的改进：将梅奇酵母菌于PDB培养基中培养，所得的发酵液于(5000±500)rpm/min离心4～6分钟；得上清液。
作为本发明的纳米银(AgNPs)的生物合成方法的进一步改进：将一接种环的梅奇酵母菌接种至100mL的PDB培养基中，于(200±50)rpm/min的摇床、(28±1)℃培养(72±4)h；得发酵液。
本发明所使用的梅奇酵母菌，为购自KCTC 27726的LPP-12Y(Metschnikowiasp.)。
本发明提供一种合成生物纳米银的新方法。本发明按照常规的酵母培养法获得梅奇酵母发酵液，然后利用离心机离心，弃掉菌体沉淀，得到上清发酵液(上清液)，然后利用上清液进一步合成生物纳米银。
在用本发明的方法合成生物纳米银的过程中，由于Ag
目前梅奇酵母多用于病害的防治，纳米银的生物合成来源多见于真菌和细菌，几乎没有利用酵母合成生物纳米银的相关报道，相对于目前其它微生物合成生物纳米银，本发明具有以下技术优势：
1)本发明利用防治病害的梅奇酵母合成生物纳米银，由于梅奇酵母的发酵液本身具有抑制果蔬霉菌的特点，而生物纳米银具有抑制常见致病微生物的功能能够，生物纳米银和梅奇酵母发酵液两种材料合成的胶体在抑菌方面具有极大优势；
2)本发明所得到的生物纳米银经过电镜表征(图2)可知：本发明合成的生物纳米银粒径更加均匀；
3)本发明利用防治病害的梅奇酵母合成生物纳米银，进一步扩大了生物纳米银合成的材料来源。
4)生物纳米银具有良好的抑菌效果和生物相容性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明得到的生物纳米银胶体；
图2为本发明合成得到的生物纳米银微观形貌图；
图3为生物纳米银的抑菌效果图；
A：大肠杆菌(E.coli)；B：金黄色葡萄球菌(S.aureus)；C：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)D：白色念珠菌(M.albican)；E：铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)；
右下角示例图中：a：LPP-12Y纳米银样品；b：卡那霉素；c：氨苄青霉素；d：HX-YS纳米银样品；e：PDA对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为去离子水。
PDB培养基配方：0.26g马铃薯葡萄糖粉，加去离子水定容至100mL，调节pH为7.0；
硝酸银溶液：取0.09g硝酸银固体，加去离子水至500mL，得到了100mM(0.001umol/L)的硝酸银溶液。
实施例1、梅奇酵母发酵液的制备(即，梅奇酵母的种子复壮培养)
1)、用灭菌的接种环挑取梅奇酵母LPP-12Y保存液，用划线的方法将其接种于PDA平板固体培养基表面，用封口膜密封，防止杂菌污染，然后放置在28℃培养72h后，平板上有明显的单菌落产生；
2)、取250毫升的培养瓶，装入PDB培养基100毫升，灭菌后，从步骤1)的固体平面上挑一接种环的单菌落接种到该PDB培养基中，密封培养瓶后，28℃、200rpm振荡培养72h后，培养基可见混浊，得梅奇酵母发酵液。即，可用此梅奇酵母的常规复壮培养方法获得了梅奇酵母的种子。
实施例2、梅奇酵母上清发酵液(上清液)的获取
将实施例1所得的梅奇酵母发酵液(带有菌体)于5000rpm/min离心5min，弃掉位于下层的菌体，获得上清发酵液(简称上清液)。
实施例3、合成生物纳米银的条件控制
1)调节发酵液的pH
取实施例2所得到的上清液(梅奇酵母上清发酵液)50毫升，利用pH计测量上清液的pH，显示约为7.0，逐滴加入稀硝酸溶液(摩尔浓度为0.5mol/L)，调节上清液的pH至5.0；
2)调节起始Ag
取10毫升的EP管，装入步骤1)中pH为5.0的上清液(梅奇酵母上清发酵液)9mL，再加入1mL浓度为100mM的硝酸银溶液，即调节反应体系中的Ag+浓度为10mM。
震荡均匀，用锡纸将EP管包裹严紧从而形成暗环境，静置6d，上清液的颜色由浅黄色溶液逐渐变为深棕色胶体，得到了生物纳米银；即，得到了含有生物纳米银的胶体。
实验一、将实施例3所得的含有生物纳米银的胶体进行全波长扫描，在波长400-450nm之间具有特征吸收峰，证明胶体中含有纳米银，利用电子显微镜所得微观形貌图如图2所述，从而证明本发明所得确实为生物纳米银。
实验二、抑菌实验：
实验利用K-B法对五种常见致病菌(大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、白色念珠菌(M.albican)、铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa))进行了抑菌实验。
将五种常见致病菌分别进行以下操作：
菌悬液调至0.6-0.8OD值，后按1/10体积比加入LB半固体培养基中；在培养皿中倒入10ml含致病菌的培养基。培养基凝固后，将5片滤纸片等距离贴于培养基上，分别加入10μl样品溶液。样品溶液分别为：卡那霉素(100μg/ml)以及氨苄青霉素(100μg/ml)作为阳性对照，PDA培养基为阴性对照，2种纳米银样品原液为实验组。于30℃培养箱培养24小时后，测量滤纸片周围抑菌圈的直径即可初步判断出含有生物纳米银的胶体抑菌效果的强弱。
为了确保实验的可信度，每组实验做三个重复组，测量抑菌圈的大小并求其平均值，降低无关变量对实验结果造成的影响。实验以100ug/mL的氨苄青霉素和卡那霉素作为对照实验。实验设置含有合成纳米银的原始发酵液培养基PDA的滤纸片为对照组。
抑菌圈结果见图3，测量抑菌圈直径，汇总如下：
表1、抑菌结果比较
注：以梅奇酵母HX-YS代替梅奇酵母LPP-12Y，其余等同。
根据上述实验结果可得知，本发明所合成的生物纳米银效果突出，对于常见的致病菌大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、白色念珠菌(M.albican)和铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)，生物纳米银的抑菌能力大于100ug/mL的氨苄青霉素和卡那霉素。
对比例1-1、将实施例3中的“调节上清液的pH至5.0”改成“调节上清液的pH至4.0”，其余等同于实施例3。
利用全波长扫描，生物纳米银胶体在400-450nm之间的吸收峰大大降低，结果表明降低反应的pH后，胶体里面纳米银的含量降低，合成效果明显下降。
对比例1-2、将实施例3中的“调节上清液的pH至5.0”改成“调节上清液的pH至6.0”，其余等同于实施例3。
利用全波长扫描，生物纳米银胶体在400-450nm之间无吸收峰，结果表明升高反应的pH后，发酵液合成的纳米银发生聚沉，形成大颗粒沉淀物，没有纳米银的形成。
对比例2-1、改变实施例3中的硝酸银溶液浓度；从而相应的将反应体系中的Ag+浓度由“10mM”改成“5mM”；其余等同于实施例3。
利用全波长扫描，生物纳米银胶体在400-450nm之间的吸收峰大大降低，结果表明降低反应的Ag+浓度后，胶体里面纳米银的含量降低，合成效果明显下降。
对比例2-2、改变实施例3中的硝酸银溶液浓度；从而相应的将反应体系中的Ag+浓度由“10mM”改成“20mM”；其余等同于实施例3。
利用全波长扫描，生物纳米银胶体在400-450nm之间无吸收峰，结果表明升高反应的Ag+浓度后，发酵液合成的纳米银发生聚沉，形成大颗粒沉淀物，没有纳米银的形成。
对比例3-1、将实施例3中静置时间由改成6d改成5d，其余等同于实施例3。利用全波长扫描，生物纳米银胶体在400-450nm之间有特征吸收峰，但是吸收峰峰值小于6d吸收峰峰值，表明纳米银有合成，但是没有达到最佳合成时间。
对比例3-2、将实施例3中静置时间由改成6d改成7d，其余等同于实施例3。利用全波长扫描，生物纳米银胶体在400-450nm之间有特征吸收峰，但是吸收峰峰值小于6d吸收峰峰值，表明合成的生物纳米银胶体在6d之后发生聚沉，形成沉淀，纳米级别银单质的含量降低。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
纳米银的生物合成方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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