专利摘要

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌全细胞转化生产宝丹酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明克隆了来源于Bipolarisoryzae的17β‑羟基类固醇脱氢酶，并实现在E.coliBL21(DE3)中过量共表达。此全细胞转化体系的建立，首次鉴定出Bipolarisoryzae来源的17β‑HSD具有17β‑羟基甾体脱氢酶功能，并在大肠杆菌表达体系中实现了Bipolarisoryzae来源的17β‑HSD的功能鉴定。经过24h全细胞转化，1g/LADD可转化为872.9mg/L宝丹酮。本发明为微生物工业化生产宝丹酮提供了基础。

权利要求

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达17β-羟基类固醇脱氢酶，能够以雄甾烯二酮为底物生产宝丹酮，编码所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET系列为载体，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主。

3.一种构建权利要求1～2任一所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)来源于GeneID:19120956的Bipolaris oryzae 17β-HSD序列，经密码子优化后合成如SEQ ID NO.1所示的基因；

(2)将基因连接到pET28a(+)上得到重组质粒pET28a-17β-hsd；

(3)将重组载体线形化后电转入E.coli BL21(DE3)，筛选阳性克隆并验证，即得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-17β-hsdBo。

4.一种制备宝丹酮的方法，其特征在于，以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶为催化剂。

5.应用权利要求1～2任一所述重组大肠杆菌制备宝丹酮的方法，其特征在于，以重组大肠杆菌作为生物催化剂，以雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮ADD作为底物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用8～12mL、45～55mM、pH 7～8的Tris-HCl缓冲液重新悬浮重组大肠杆菌至细胞湿重为180～220g/L，加入8～12mg底物ADD进行转化，底物助溶剂为甲基化-β-环糊精，转化温度为25-40℃，转化pH为7～8；所述ADD：甲基化-β-环糊精的摩尔比例为1：1。

7.一种培养权利要求1～2任一所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，重组大肠杆菌接种于5～15mL LB培养基中，培养10～13h，然后以8～12％接种量接种于装有45～55mL LB培养基的200～300mL容器中，于35～40℃培养至对数生长后期，然后转入22～25℃进行诱导培养8～12h。

8.权利要求1～2任一所述的重组大肠杆菌在制备食品、医疗保健、生物农药方面的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用重组大肠杆菌全细胞转化生产宝丹酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。2000年甾体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6％。甾体激素类药物分为肾上腺皮质激素、蛋白同化激素和性激素三大类。

宝丹酮是睾酮的衍生物，因此继承了睾酮的大部分性质，比如雄性激素能力和蛋白质合成能力。宝丹酮使肌纤维细胞的氮平衡状态随时保持趋于正向，使肌纤维细胞加速合成蛋白质，肌纤维细胞因此而扩张膨胀，对体能锻炼者增强肌肉，增强耐力有很大功效。因宝丹酮没有明显的雄性、雌性趋向，故其很少有副作用，因此受到广大消费者的认可。目前宝丹酮多采用化学法进行合成，但是该方法副产物多，质量低、合成路线复杂、回收率低、代价高昂，不能满足生产的需要。

17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD)为性激素合成过程中最后步骤的催化酶。17β-HSD作为一种检测用酶，可应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、医疗保健、临床监测、生物农药等领域也具有广泛应用价值。因此，对17β-HSD的深入研究对整个甾体药物行业的发展意义深远。17β-HSD催化性激C17位上的酮基和醇基之间的还原和氧化反应，可以使低生物活性的雌酮、雄烯二酮与高生物活性的雌二醇、睾酮之间相互转化。但是，目前17β-HSD多被用于生产睾酮。

在宝丹酮的微生物转化方面，目前陈苗苗等在毕赤酵母中实现AD(雄甾烯二酮)到ADD和BD(宝丹酮)的转化，在最终产物中宝丹酮含量为41％；Mohamed等筛选到一株铜绿假单胞菌，该铜绿假单胞菌能够转化玉米油植物甾醇产生BDL(宝丹酮)，在最终产物中宝丹酮含量为36.8％。但这些方法都是以微生物为催化剂来生产宝丹酮，不清楚具体是微生物中的什么成分在发挥关键的催化作用，而且副产物多、宝丹酮的转化率低，难以大规模工业化应用。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种表达17β-羟基类固醇脱氢酶，能够以雄甾烯二酮(ADD)为底物生产宝丹酮(1(2)-DT)的重组大肠杆菌。应用该重组大肠杆菌催化ADD生成宝丹酮，得到了较高的转化率，为微生物发酵生产1(2)-DT的工业化提供了有益的指导。

在本发明的一种实施方式中，编码所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述17β-羟基类固醇脱氢酶来源于Bipolarisoryzae。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以pET28a(+)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)17β-HSD基因全序列的合成

根据GENBANK网站公布的Bipolaris oryzae(GeneID:19120956)的17β-HSD序列，经过密码子优化后，选择pET-28a(+)质粒上的酶切位点BamH I/SacI，将合成的基因插入质粒相应的位置得到重组质粒pET-28a-17β-hsdBo；

(2)重组质粒pET-28a-17β-hsdBo转化菌株E.coli BL21(DE3)

将重组质粒pET-28a-17β-hsdBo用化转法转化至大肠杆菌中表达；

(3)重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-17β-hsdBo阳性转化子的筛选

挑取在LB和卡那霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，提取质粒进行单双酶切验证，即得到大肠杆菌基因工程菌。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备宝丹酮的方法，以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶为催化剂。

在本发明的一种实施方式中，所述17β-羟基类固醇脱氢酶来源于Bipolarisoryzae。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种应用重组大肠杆菌制备宝丹酮(1(2)-DT)的方法，所述方法是采用8～12mL、45～55mM、pH 7～8的Tris-HCl缓冲液重新悬浮重组大肠杆菌至细胞湿重为180～220g/L，加入8～12mg底物ADD进行转化，转化温度为25-40℃，转化pH为7～8，底物助溶剂为甲基化-β-环糊精，所述ADD：甲基化-β-环糊精摩尔比例为1：1。所述重组大肠杆菌重组表达了17β-羟基类固醇脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述17β-羟基类固醇脱氢酶来源于Bipolarisoryzae。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以pET28a(+)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种培养重组大肠杆菌的方法，重组菌E.coli BL21(DE3)pET-28a-17β-hsdBo接种于5～15mL LB培养基中，培养10～13h，然后以8～12％接种量接种于装有45～55mL LB培养基的200～300mL容器中，于35～40℃培养至对数生长后期，然后转入22～25℃进行诱导培养8～12h。

有益效果：

本发明首次鉴定出Bipolaris oryzae来源的17β-HSD具有17β-羟基甾体脱氢酶功能，并成功构建了表达真菌来源的17β-羟基类固醇脱氢酶的重组大肠杆菌。以该重组大肠杆菌全细胞为催化剂，可在24h内将1g/L ADD转化为872.9mg/L宝丹酮。

本发明提供的这种微生物全细胞生产宝丹酮的方法，具有反应条件温和、原料利用率高、产量高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。

附图说明

图1：ADD和1(2)-DT标样的HPLC检测图；

图2：重组大肠杆菌全细胞转化液中ADD和1(2)-DT的HPLC测定。

具体实施方式

本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L(固体培养基加入2％琼脂粉)。

HPLC分析：ADD和1(2)-DT在254nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法测定产物浓度。色谱条件：色谱柱：DimosoilC18(5μl,250mm×4.6mm)，流动相：甲醇-水(V/V＝70:30)，检测器：UV Detector，检测波长：254nm，柱温：30℃，进样量：5μL，流速：1.0ml/min。

主要试剂：ADD和1(2)-DT均购自美国SIGMA公司。

实施例1：重组E.coliBL21(DE3)pET-28a-17β-hsdBo菌株的构建

1、17β-HSD基因全序列的合成及转化

根据GENBANK公布的Bipolaris oryzae(GeneID:19120956)17β-HSD序列，对密码子进行优化后得到序列如SEQ ID NO.1所示的编码17β-羟基类固醇脱氢酶的基因。利用限制性内切酶BamH I/SacI对目的基因与表达质粒pET-28a(+)进行酶切，目的基因与载体连接后获得重组质粒pET-28a-17β-hsdBo。将重组质粒pET-28a-17β-hsdBo用化转法转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达，即得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-17β-hsdBo。

2、重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-17β-hsdBo阳性转化子的筛选

挑取在LB和卡那霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，提取质粒进行单双酶切验证，将正确的转化子转接和诱导，收集细胞，进行全细胞转化，转化体系为10mL，温度为30℃，转化pH为7.5，底物助溶剂为甲基化-β-环糊精(3g/L)，底物浓度为1g/L。用HPLC检测转化液中的产物1(2)-DT。检测到有产物1(2)-DT，说明构建成功了具有转化ADD为1(2)-DT的重组菌株。

空白对照：将质粒pET-28a用化转法转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达，即得重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a。挑取在LB和卡那霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，将正确的转化子转接和诱导，收集细胞，进行全细胞转化，转化体系为10mL，温度为30℃，转化pH为7.5，底物助溶剂为甲基化-β-环糊精(3g/L)，底物浓度为1g/L。用HPLC检测转化液中的产物1(2)-DT，结果未检测到有产物1(2)-DT。

实施例2：重组菌株全细胞转化性能检测

将实施例1中构建的重组菌E.coliBL21(DE3)pET-28a-17β-hsdBo以单菌落接种于10mL LB培养基中，培养12h。按10％接种量接种于装有50mL LB培养基的250mL容器中，于37℃培养至对数生长后期。转入24℃诱导培养10h，离心回收菌体，洗涤两次，用10mL、50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液重新悬浮至细胞湿重为200g/L，加入10mg底物ADD进行转化，转化条件为：转化温度为30℃，转化pH为7.5，底物助溶剂为甲基化-β-环糊精(ADD：甲基化-β-环糊精摩尔的比例为1:1)。经过24h全细胞转化后对重组菌全细胞转化液中ADD和1(2)-DT进行HPLC测定，结果如图2所示。ADD和1(2)-DT标样HPLC检测如图1所示。

结果显示，经过24h全细胞转化，1g/L ADD可转化为872.9mg/L宝丹酮。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用重组大肠杆菌全细胞转化生产宝丹酮的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggatccatgc cgcacgtgga gagcaccccg tcgacctata tcccgggccg tttagacggc 60

aaagtcgctt tagtcaccgg tagcggccgc ggcatcggcg ccgcggtggc cacccattta 120

ggccgcctcg gcgccaaggt cgtcgtgaac tacgccaact cgaccaagga cgccgaaaag 180

gtggtgtcgg agatcaaggc gctgggctcg gacgcgatcg ccatcaaggc cgacatccgg 240

caagttccgg acatcgtgcg tttattcgat gaggcggtcg cccacttcgg ccatctggac 300

atcgccgtgt cgaactcggg cgtggtgagc ttcggccatt taaaggacgt caccgaggaa 360

gagttcgacc gcgtcttctc gctgaatacc cgcggccagt tcttcgtggc ccgcgaggcc 420

taccgccatt taaccgaggg tggccgcatc attctgactt cttctaacac cagccgcgat 480

ttctcggtcc cgaagcactc gctgtattcg ggctcgaagg gcgccgtcga ctcgttcgtg 540

cgcatcttct cgaaggactg cggtgacaag aagatcaccg tcaacgccgt cgcccccggc 600

ggtaccgtca ccgacatgtt ccacgaggtg tcgcaccact acatcccgaa tggtttagac 660

tacaccgccg agcagcgcca gcagatggcc gcccacgcgt cgcctttaca tcgcaacggc 720

ttcccgcaag atgtggccaa cgtggtgggc tttttagtgt cgaaagaggg cgagtgggtc 780

aacggcaagg tgctgacgct ggacggcggc gcggcctgag agctc 825

一种利用重组大肠杆菌全细胞转化生产宝丹酮的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。