专利摘要

本发明公开了一株富钙啤酒酵母与应用。本发明的目的是提供一株高生物量富钙啤酒酵母及其生产富钙酵母的方法。本发明所提供的高生物量富钙啤酒酵母菌株为啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH－66CGMCC№1116。本发明所提供的生产富钙酵母的方法，是发酵啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH－66CGMCC№1116得到富钙酵母。所述发酵过程包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养和发酵罐发酵培养，在发酵罐培养完成后，收集酵母细胞进行干燥、粉碎，得到富钙酵母。本发明利用啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH－66CGMCC№1116生产富钙酵母的方法，生产成本低廉，操作简便，具有广阔的实际应用前景。

权利要求

1、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116。

2、一种生产富钙酵母的方法，是发酵啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116得到富钙酵母。

3、根据权利要求2所述的生产富钙酵母的方法，其特征在于：发酵过程包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养及发酵罐发酵培养。

4、根据权利要求3所述的生产富钙酵母的方法，其特征在于：所述液体种子培养为三级-六级种子培养；所述发酵罐培养完成后，收集酵母细胞进行干燥、粉碎，得到富钙酵母。

5、根据权利要求3或4所述的生产富钙酵母的方法，其特征在于：所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基包括8％-20％总糖量的有机物，80-200毫克/毫升的钙盐，pH为4.0-7.0。

6、根据权利要求3或4所述的生产富钙酵母的方法，其特征在于：所述发酵罐培养的接种量为10％-40％。

7、根据权利要求5所述的生产富钙酵母的方法，其特征在于：所述钙盐为氯化钙。

8、根据权利要求5所述的生产富钙酵母的方法，其特征在于：所述有机物选自麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵工业技术领域中的一株高生物量富钙啤酒酵母与在生产中的应用。

背景技术

钙是生命元素，在人体生长发育过程中起着十分重要的作用，尤其是对正在生长发育的儿童、妇女和老年人尤为重要，缺钙会引起多种疾病。当人体通过食物不能获得足够身体需要的钙时，通常采用服用钙制剂进行补充。随着科学技术的进步，钙制剂已从单纯的碳酸钙向葡萄糖酸钙、氨基酸钙螯合钙制剂发展。但这些钙制剂通常是采用化学反应或化学合成方法得到的，应用中存在以下问题：1)水溶解度小，人体对其吸收利用率较低；2)含有在化学合成过程中生成的副产物，通常对人体有一定副作用；3)生产成本较高。

酵母细胞在其繁殖生长过程中能将培养液中的无机状态的钙富集到细胞内转化成有机状态的钙，利用酵母将无机状态的钙转化成有机状态的钙是开发新型钙源，提高钙的利用率的有效措施。此外，酵母细胞还含有丰富的蛋白质、核酸、维生素及机体必需的十几种微量元素，是一种丰富的营养物质。

目前，已有一些称为“含钙酵母”的产品，生产这些产品的方法大体有三种：第一种是采用混合处理方法，即将一定量的氯化钙与市场上的面包酵母或啤酒酵母细胞混合而成；第二种是采用简单的吸附方法，将市场上的面包酵母或啤酒酵母细胞悬浮于含有一定浓度的氯化钙的水溶液中处理一定时间，使钙离子吸附于酵母细胞表面；第三种是在含有一定钙离子的培养基中培养酵母细胞。

上述方法中，第一种和第二种的主要缺陷在于酵母细胞未能有效地将无机钙转化为有机钙，导致人对其所含钙的吸收利用率低。第三种方法则存在如下不足和缺陷：

一是没有对酵母菌种进行筛选和育种，经常是用啤酒酵母或面包酵母菌种发酵生产含钙酵母。由于不同酵母菌种对钙的抗性差异较大，对钙离子的吸收转化能力差异也较大，因此产品缺乏稳定性，不利于工业化生产。

二是没有对含钙酵母发酵培养基的钙离子浓度、培养条件进行优化，虽然培养的酵母称为“含钙酵母”，但是其酵母细胞的有机钙含量较低(每克干酵母细胞有机钙的含量在20毫克以下)、细胞生物量也较低。

发明内容

本发明的目的是提供一株高生物量富钙啤酒酵母。

本发明所提供的高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66已于2004年03月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1116。

该高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116的细胞为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度30℃，pH为5.5。

本发明的另一个目的是提供一种生产富钙酵母的方法。

本发明所提供的生产富钙酵母的方法，是发酵培养富钙啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116得到富钙酵母。

发酵培养过程包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养、发酵罐发酵培养。

所述液体种子培养为多级种子培养，以三级-六级种子培养为好；在发酵罐培养完成后，收集酵母细胞，然后进行干燥、粉碎，得到富钙酵母。

所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基包括8％-20％总糖量的有机物，80-200毫克/毫升的钙盐，pH为4.0-7.0。发酵培养的接种量为10％-40％。所述有机物选自麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合；钙盐通常以氯化钙形式加入。本发明的优化的发酵培养条件为：接种量为10-30％，25-35℃搅拌培养16-30小时。

本发明通过筛选和杂交育种，获得了一株遗传性状稳定的高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116。该菌株具有生物量高和细胞有机钙含量高的优点，在优化的发酵培养条件下，每升培养液的细胞干重能达到20克以上，每克干细胞含钙达60毫克以上。

本发明利用高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC№1116生产富钙酵母，所用发酵培养基为普通的麦芽汁、淀粉水解糖、糖蜜或它们的任意组合，只需调节其总糖含量，添加钙盐(氯化钙)即可，具有成本低廉的优点。本发明的生产方法实用性强，操作简便，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产还适合于小批量的生产，具有广阔的实际应用前景。

具体实施方式

实施例1、高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC№1116的选育

高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116的选育分为以下几个步骤：

1)根据酵母菌对氯化钙的抗性测定进行初筛：取380株不同种属的酵母菌，将其培养在含有20毫克/毫升、40毫克/毫升、60毫克/毫升、80毫克/毫升、100毫克/毫升、120毫克/毫升、140毫克/毫升、160毫克/毫升、180毫克/毫升、200毫克/毫升的梯度钙离子浓度的YEPD固体培养基(酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖2％，1％琼脂粉)上，从中选出32株在含有120毫克/毫升钙离子浓度的YEPD固体培养基上生长良好的菌株。

2)测定初筛得到的32株菌株在含有120毫克/毫升钙离子浓度的YEPD液体培养基中培养的细胞生物量和细胞含钙量。通过筛选，获得6株细胞生物量较高的菌株(每升培养液的细胞干重在15克以上，但每克干细胞的含钙量在20毫克以下)和7株细胞含钙量较高的菌株(每克干细胞的含钙量在40毫克以上，但每升培养液的细胞干重在11克以下)。

3)通过生孢实验，从上述菌株中挑选出一株生物量较高、生孢好的二倍体面包酵母菌ZY-29(中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号：CGMCC 2.240)和一株细胞含钙量较高、生孢好的二倍体面包酵母菌ZY-242(中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号：CGMCC 2.558)，按常规方法对其进行生孢培养和单倍体分离。分别测定单倍体菌株的细胞生物量和细胞含钙量，从中选出生物量较高的单倍体ZY-29-22(a)和细胞含钙量较高的单倍体ZY-242-16(α)。

4)用硫酸二乙酯和亚硝基胍分别对ZY-29-22(a)和ZY-242-16(α)进行诱变，获得营养缺陷突变株，从突变株中选出带有不同氨基酸缺陷标记的突变株ZY-29-22-14(a，his)和ZY-242-16-7(α，met)作为杂交亲株。

5)用群体杂交法将ZY-29-22-14(a，his)和ZY-242-16-7(α，met)的细胞进行杂交，在基本培养基(YNB培养基)上筛选杂交子。

6)测定获得的杂交子在含有120毫克/毫升钙离子浓度的YEPD培养基中培养的细胞生物量和细胞含钙量，从中选育出细胞生物量和细胞含钙量高的杂交菌株ZGFH-66，即高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116。

该杂交菌株ZGFH-66每升培养液的细胞干重在20克以上，每克干细胞的含钙量在45毫克以上，都明显高于亲株ZY-29和ZY-242，是一株优良的富钙酵母菌株。

高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116的遗传稳定性分析：将高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66CGMCC №1116在YEPD固体培养基传代培养30次，取细胞在涂布YEPD的平皿上培养，然后随机挑取100个单菌落于无菌水中，在室温条件下饥饿4-6小时。取饥饿后的菌液分别接种于含有120毫克/毫升钙离子的YEPD培养基、YNB培养基、YNB+HIS培养基和YNB+MET培养基，培养结果证明挑取的100个单菌落在这四种培养基都生长，没有出现分离现象。随机挑10个单菌落在含有120毫克/毫升钙离子的YEPD培养基中培养，培养后测定细胞生物量和细胞含钙量，结果表明细胞生物量和细胞含钙量都无明显变化。上述结果证明高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66CGMCC №1116具有很好的遗传稳定性。

实施例2、高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC№1116的优化培养条件

采用单因子发酵实验和多因子正交实验进行高生物量富钙啤酒酵母ZGFH-66的培养条件实验(包括培养基组分、钙盐浓度、培养基的pH值、通气量、接种量及发酵时间等)，确定了优化培养条件：总糖含量为8％-20％的麦芽汁培养基(或糖蜜培养基或淀粉水解糖培养基)，培养基中钙盐(氯化钙)浓度为80毫克-200毫克/毫升，pH为4.5-7.0，通气量为0.8v.v.m，培养接种量为10％-40％，25℃-35℃搅拌培养16-30小时。

在该优化的培养条件下，每升培养液的细胞干重可以达20克以上，每克干细胞的含钙量达60毫克以上。

实施例3、富钙酵母的生产

高生物量和高钙含量的富钙酵母产品的生产工艺包括：

斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→富钙酵母。下面对各生产工艺进一步说明如下：

(1)斜面菌种：将高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66CGMCC №1116接种于含有总糖含量为8％、氯化钙浓度为80毫克/毫升的麦芽汁固体斜面上，在25-35℃的条件下，培养48小时后，放入4℃冰箱保存。

(2)液体菌种：将保存的高生物量富钙啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-66 CGMCC №1116活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为10％、氯化钙浓度为100毫克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25-35℃的条件下，振荡培养16-20小时，即为液体菌种。

(3)一级液体种子培养：按15％的接种量将液体菌种接入装有150毫升总糖含量为18％、氯化钙浓度为100毫克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25-35℃的条件下，振荡培养16-20小时，即为一级液体种子培养物。

(4)二级液体种子培养：按15％的接种量将一级种子培养液接入装有45升总糖含量为20％、氯化钙浓度为100毫克/毫升的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐，在25-35℃的条件下，搅拌培养16-20小时，即为二级液体种子培养物。

(5)三级液体种子培养：按15％的接种量将二级种子培养液接入装有450升总糖含量为20％、氯化钙浓度为120毫克/毫升的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐，在25-35℃的条件下，搅拌培养12-16小时，即为三级液体种子培养物。

(6)发酵罐发酵培养：按40％的接种量将三级种子培养液接入装有2250升总糖含量为20％、氯化钙浓度为140毫克/毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-35℃的条件下，搅拌培养12-18小时。

(7)收集酵母细胞及干燥：采用板框压榨或离心收集富钙酵母细胞。在该培养条件下，每升培养液的细胞干重为20-22克，每克干细胞的含钙量为60-64毫克。

(8)风干：在45～85℃条件下风干使富钙酵母细胞的含水量小于5％。

(9)粉碎：用粉碎机将风干的富钙酵母细胞粉碎。

(10)包装：用不透气的包装袋包装，得到成品。

实施例4、富钙酵母的生产

以淀粉水解糖为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是：总糖量为8-20％的淀粉水解糖，0.5％的玉米水解液，0.4％硫酸铵，80-200毫克/毫升的氯化钙，培养基的pH为4-6，接种量为10-40％，在28-35℃的条件下，搅拌培养12-20小时。

本实施例的生产工艺增加四级液体种子培养，其接种量以及培养基组成与三级液体种子培养相同，其他工艺条件与实施例3相同。在本实施例的条件下，每升培养液的富钙酵母细胞干重为20-23克，每克干细胞的含钙量为60-65毫克。

实施例5、富钙酵母的生产

以糖蜜为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是：总糖量8-20％的甜菜糖蜜和蔗糖糖蜜，其重量份数比为1∶3，0.8％的玉米水解液，0.8％硫酸铵，0.10％磷酸，80-200毫克/毫升的氯化钙，培养基的pH为4-6，接种量为10-40％，在25-35℃搅拌培养12-20小时。

其生产工艺包括：液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→五级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→富钙酵母。

本实施例在实施例4的基础上增加五级液体种子培养，其接种量以及培养基组成与四级液体种子培养相同，其他工艺条件与实施例4相同。在本实施例的条件下，每升培养液的富钙酵母细胞干重为20-25克，每克干细胞的含钙量为60-63毫克。

一株富钙啤酒酵母与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。