专利摘要

本发明提供了一种黑曲霉种子培养方法，通过在培养过程中对产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力中的监控来选择移种的时机；并具体公开了产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力中的测定方法和披露了溶氧浓度对培养过程的影响，解决了现有培养方法中主要依靠观察黑曲霉菌球大小、形态来判断种子的生长状态的不足。本发明的方法培养的种子发酵结果标准差更小，批次间更稳定，发酵转化率提高，发酵周期明显缩短。

权利要求

1.一种黑曲霉种子培养方法，该方法包括：将黑曲霉孢子悬液接种至培养基中进行培养，所述培养过程中适时测量产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力中的至少一种，当所述产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力达到最大值后进行移种，所述移种是在产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力达到最大值后1～5h内进行的；

所述培养过程中还包括对溶氧浓度的控制，溶氧浓度在发酵过程中控制在不低于初始浓度的20％；

所述溶氧浓度通过溶氧浓度与搅拌转速或风量偶联的反馈控制，将溶氧浓度与搅拌转速或风量偶联，当溶氧浓度低于20％时，提高搅拌转速或风量，或同时增加转速、风量、罐压来增加溶氧浓度；

所述培养基所选用的氮源包括无机氮源和有机氮源中的一种或多种；无机氮源为硫酸铵、硝酸铵或尿素；有机氮源为豆粕粉、棉粕粉、蛋白胨、酵母膏；所述培养基总糖浓度为8～12％，总氮浓度为0.15～0.4％，黑曲霉孢子悬液接种后浓度为10～80万个/毫升种子液。

2.如权利要求1所述的黑曲霉种子培养方法，其特征在于，所述产酸速率是通过在线或离线方式测定的。

3.如权利要求1所述的黑曲霉种子培养方法，其特征在于，黑曲霉孢子悬液接种后浓度为20～40万个/毫升种子液。

4.如权利要求1所述黑曲霉种子培养方法培养的黑曲霉种子的应用，其特征在于，所述黑曲霉种子应用于柠檬酸的发酵生产中。

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种黑曲霉种子培养方法。

背景技术

柠檬酸是目前产量和消费量最大的有机酸，广泛应用于饮料、食品及医药等行业。我国是柠檬酸生产大国，总产能已超过100万吨。国内柠檬酸生产是以黑曲霉作为菌种，以玉米、木薯等淀粉质为原料的深层液体发酵，一般采用二级发酵。在进行发酵制备柠檬酸之前，通常进行一级种子培养，以获得大量活力高、产酸能力强的黑曲霉菌丝体。

微生物生长过程中，通常对数生长中后期细胞活力较高，一般种子培养至对数生长中后期需要移种。在黑曲霉种子培养过程中，也遵循这一规律，以便给后续发酵提供活力旺盛的菌体。对数生长期需要测定种子生长曲线来判定。而生长曲线主要通过细胞浓度来反映，一般是通过测定种子液600nm可见光下吸光度来计算。而黑曲霉种子培养，通常采用玉米液化液等淀粉质粗料作为培养基，固形物含量较高，并且黑曲霉菌体以菌球形态存在，种子液沉降速度快，很难采用吸光度来准确反映细胞浓度，因此这一方法很难在黑曲霉种子培养中应用。

目前，在发酵之前对黑曲霉进行培养时，通常是通过观察来判断黑曲霉的生长是否符合用于生产柠檬酸的发酵应用，但现有的观察方法主要是通过观察黑曲霉菌球大小、形态，来判断种子的生长状态，而移种主要根据培养时间来确定。该方法很难真实反映出黑曲霉的生长状态，并且由于批次间的差异性，以培养时间来确定移种，导致不同批次间种子处于不同的生长阶段，并不能保证处于活力较高的生长阶段，从而影响后续发酵结果。因此，迫切需要开发一种能够准确反映黑曲霉种子生长规律的指标和以此作为依据的移种判断标准，为后续发酵培养提供高活力的种子液。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种能够准备反映黑曲霉种子生长指标和移种时机的黑曲霉种子培养方法。

在本领域中，除细胞浓度外，产物生成、底物消耗、以及关键酶的产量等也通常作为微生物种子生长规律的参考依据。发明人在研究中发现酸生成曲线、葡萄糖消耗曲线、糖化酶活力变化曲线等指标在反映黑曲霉种子生长状态也可以起到重要的作用。

经过大量实验发明人发现产酸速率、耗葡萄糖速率以及糖化酶活力在种子生长过程中分别呈现如下特点：

1）首先，产酸速率、耗葡萄糖速率以及糖化酶活力为0；

2）接着，三项指标迅速增加；

3）然后，三项指标达到最大值；

4）之后，三项指标逐渐下降；

5）最后，三项指标重新降至0。

由此可见，产酸速率、耗葡萄糖速率和糖化酶活力的变化能够间接反映黑曲霉种子生长规律，并且产酸速率、耗葡萄糖速率和糖化酶活力达最大值的时间处于相同的时间段；产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力达最大值的时间可以作为种子进入移种时期的判断依据。

一种黑曲霉种子培养方法，其中，该方法包括：将黑曲霉孢子悬液接种至培养基中进行培养，所述培养过程中适时测量产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力中的至少一种，当所述产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力达到最大值后进行移种。

产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力，这三个指标可以仅测量其中的任意一个作为判断的标准，也可以测量多项结果后进行结合判断。本发明中产酸速率的测定是通过测定种子罐酸度，再计算出产酸速率的；耗葡萄糖速率是采用生物传感分析仪进行测定的；糖化酶活力采用GB 8275-2009中方法测定的。

发明人经过大量实验和生产应用发现，以产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力变化来反映黑曲霉种子生长状态和指导移种，能取得较好的效果，由此制备的种子不同批次间的差异性小，并且种子活性高，发酵指标稳定，转化率高、发酵周期短。

同时，在可选的三个指标中，相对于葡萄糖和糖化酶活力的测定，酸度的测定更简单便捷，时效性更好，且需要的设备仪器少，消耗低，以产酸速率来反映黑曲霉种子生长状态和指导移种是最佳选择；也可以选择多项指标，或与传统方法相结合来判断。

优选地，所述移种在产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力达到最大值后1～5h内进行。相对于其他时间段移种，当产酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力达最大值后1～5h内移种，对应的发酵指标稳定，转化率高、发酵周期更短。

优选地，所述培养过程中还包括对溶氧浓度的控制，在发酵过程中控制溶氧浓度不低于初始浓度的20%。

本发明人发现，在黑曲霉种子培养过程中，上述三项指标受种子罐溶氧浓度影响较大，特别是溶氧浓度低于初始浓度的20%时，产酸速率和耗葡萄糖速率会受到严重影响，从而破坏种子生长规律，对种子生长状态和移种标准判断形成干扰。因此，在种子罐培养中，通过溶氧浓度与搅拌转速或风量偶联的反馈控制，将溶氧浓度控制在20%以上。

进一步地，所述溶氧深度通过反馈控制，将溶氧浓度与搅拌转速或风量偶联，当溶氧浓度低于20%时，提高搅拌转速或风量，或同时增加转速、风量、罐压来增加溶氧浓度。

优选地，所述产酸速率是通过在线或离线方式测定的。在线方式是通过连接高效液相色谱进行测定；离线方式是采用GB1987-2007中氢氧化钠滴定法进行测定。

优选地，所述培养基所选用的氮源包括无机氮源和有机氮源中的一种或多种；无机氮源为硫酸铵、硝酸铵或尿素；有机氮源可选择豆粕粉、棉粕粉、蛋白胨、酵母膏等。

优选地，所述培养基总糖最适浓度为8～12%，总氮最适浓度为0.15～0.4%。

优选地，本发明中黑曲霉孢子悬液接种后浓度为10～80万个/毫升种子液。

进一步地，黑曲霉孢子悬液接种后最优范围为20～40万个/毫升种子液。

上述培养方法培养的黑曲霉种子在柠檬酸发酵生产中的应用。

本发明中种子培养条件除对溶氧浓度有较高要求外，其他培养条件均是本领域所熟知的，培养温度最适范围为35～38℃，罐压为0.05～0.12 Mpa，通风比例和搅拌转速根据罐体大小、径高比、桨叶大小和形状等因素设置合适范围，通常罐体越大需要的通风比例和搅拌转速越小。

本发明的培养方法通过理化指标反映种子生长状态并以此指导移种，发酵结果标准差更小，批次间更稳定，发酵转化率提高，发酵周期明显缩短。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出详细描述，以使本领域技术人员可以更好地理解本发明，从而对本发明要求保护的范围作出更清楚的限定。

本发明的方法对种子培养基适用范围较广，只要能适合黑曲霉种子生长的培养基即可。以下实施例中的种子培养基选用本领域熟知的玉米液化液和氮源配制而成；其中，氮源包括无机氮源和有机氮源中的一种或多种；无机氮源为硫酸铵、硝酸铵或尿素；有机氮源可选择豆粕粉、棉粕粉、蛋白胨、酵母膏等。种子培养基总糖最适浓度为8～12%，总氮最适浓度为0.15～0.4%。采用的菌种为中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏的黑霉CICC40021。

实施例1

玉米进行粉碎后，过80目筛；所得玉米粉与自来水，按1:3料水比混合均匀，将浆料pH调节至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高温α-淀粉酶；所得粉浆经过两次喷射，碘试呈浅棕色后得到合格液化液。

液化液用自来水稀释，加入硫酸铵配制成总糖为10%，总氮为0.2%的种子培养基。121℃灭菌20min后降温至37℃后，接入黑曲霉 CICC 40021孢子悬液（菌株来源：CICC 保藏菌株），使接种后孢子浓度为30万个/毫升。

种子培养条件为：温度37℃，溶氧浓度与搅拌转速偶联反馈控制，通过调整搅拌转速将溶氧溶度控制在初始浓度20%以上。

培养过程中间隔一定时间进行取样，离线测定种子液酸度，根据酸度变化计算产酸速率，并与上一时间点产酸速率比较，当产酸速率达到最大值后，1h内将种子液移种至发酵罐内培养，当发酵罐还原糖0.5%以下时结束发酵，计算周期和转化率。

实施例2

玉米进行粉碎后，过80目筛；所得玉米粉与自来水，按1:3料水比混合均匀，将浆料pH调节至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高温α-淀粉酶；所得粉浆经过两次喷射，碘试呈浅棕色后得到合格液化液。

液化液用自来水稀释，加入硫酸铵配制成总糖为10%，总氮为0.2%的种子培养基。121℃灭菌20min后降温至37℃后，接入黑曲霉 CICC 40021孢子悬液（菌株来源：CICC 保藏菌株），使接种后孢子浓度为30万个/毫升。

种子培养条件为：温度37℃，溶氧浓度与风量偶联反馈控制，通过调整风量和罐压将溶氧溶度控制在初始浓度20%以上。

培养过程中间隔一定时间进行取样，离线测定种子液酸度，根据酸度变化计算产酸速率，并与上一时间点产酸速率比较，当产酸速率达到最大值后，3h内将种子液移种至发酵罐内培养，当发酵罐还原糖0.5%以下时结束发酵，计算周期和转化率。

实施例3

玉米进行粉碎后，过80目筛；所得玉米粉与自来水，按1:3料水比混合均匀，将浆料pH调节至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高温α-淀粉酶；所得粉浆经过两次喷射，碘试呈浅棕色后得到合格液化液。

液化液用自来水稀释，加入硫酸铵配制成总糖为12%，总氮为0.4%的种子培养基。121℃灭菌20min后降温至38℃后，接入黑曲霉 CICC 40021孢子悬液（菌株来源：CICC 保藏菌株），使接种后孢子浓度为40万个/毫升。

种子培养条件为：温度38℃，溶氧浓度与搅拌转速偶联反馈控制，通过调整搅拌转速将溶氧溶度控制在初始浓度20%以上。

种子罐安装在线微量取样器，在培养过程中连续流出样品，高效液相色谱通过自动进样器对流出样品柠檬酸浓度进行连续测定，根据酸度变化计算产酸速率，并与上一时间点产酸速率比较，当产酸速率达到最大值后，5h内将种子液移种至发酵罐内培养，当发酵罐还原糖0.5%以下时结束发酵，计算周期和转化率。

实施例4

玉米进行粉碎后，过80目筛；所得玉米粉与自来水，按1:3料水比混合均匀，将浆料pH调节至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高温α-淀粉酶；所得粉浆经过两次喷射，碘试呈浅棕色后得到合格液化液。

液化液用自来水稀释，加入硫酸铵配制成总糖为10%，总氮为0.2%的种子培养基。121℃灭菌20min后降温至37℃后，接入黑曲霉 CICC 40021孢子悬液（菌株来源：CICC 保藏菌株），使接种后孢子浓度为30万个/毫升。

种子培养条件为：温度37℃，溶氧浓度与风量偶联反馈控制，通过调整风量和罐压将溶氧溶度控制在初始浓度20%以上。

种子罐安装在线微量取样器，在培养过程中连续流出样品，高效液相色谱通过自动进样器对流出样品柠檬酸浓度进行连续测定，根据酸度变化计算产酸速率，并与上一时间点产酸速率比较，当产酸速率达到最大值后，2h内将种子液移种至发酵罐内培养，当发酵罐还原糖0.5%以下时结束发酵，计算周期和转化率。

实施例5

玉米进行粉碎后，过80目筛；所得玉米粉与自来水，按1:3料水比混合均匀，将浆料pH调节至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高温α-淀粉酶；所得粉浆经过两次喷射，碘试呈浅棕色后得到合格液化液。

液化液用自来水稀释，加入硫酸铵配制成总糖为8%，总氮为0.15%的种子培养基。121℃灭菌20min后降温至35℃后，接入黑曲霉 CICC 40021孢子悬液（菌株来源：CICC 保藏菌株），使接种后孢子浓度为20万个/毫升。

种子培养条件为：温度35℃，溶氧浓度与风量偶联反馈控制，通过调整风量和罐压将溶氧溶度控制在初始浓度20%以上。

培养过程中间隔一定时间进行取样，离线测定种子液葡萄糖浓度，根据葡萄糖变化计算耗葡萄糖速率，并与上一时间点耗葡萄糖速率比较，当耗葡萄糖速率达到最大值后，3h内将种子液移种至发酵罐内培养，当发酵罐还原糖0.5%以下时结束发酵，计算周期和转化率。

实施例6

玉米进行粉碎后，过80目筛；所得玉米粉与自来水，按1:3料水比混合均匀，将浆料pH调节至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高温α-淀粉酶；所得粉浆经过两次喷射，碘试呈浅棕色后得到合格液化液。

液化液用自来水稀释，加入硫酸铵配制成总糖为12%，总氮为0.4%的种子培养基。121℃灭菌20min后降温至38℃后，接入黑曲霉 CICC 40021孢子悬液（菌株来源：CICC 保藏菌株），使接种后孢子浓度为40万个/毫升。

种子培养条件为：温度38℃，溶氧浓度与搅拌转速偶联反馈控制，通过调整搅拌转速将溶氧溶度控制在初始浓度20%以上。

培养过程中间隔一定时间进行取样，离线测定种子液糖化酶活力，根据糖化酶活力变化，当糖化酶活力达到最大值后，4h内将种子液移种至发酵罐内培养，当发酵罐还原糖0.5%以下时结束发酵，计算周期和转化率。

实施例7

玉米进行粉碎后，过80目筛；所得玉米粉与自来水，按1:3料水比混合均匀，将浆料pH调节至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高温α-淀粉酶；所得粉浆经过两次喷射，碘试呈浅棕色后得到合格液化液。

液化液用自来水稀释，加入硫酸铵配制成总糖为10%，总氮为0.2%的种子培养基。121℃灭菌20min后降温至37℃后，接入黑曲霉 CICC 40021孢子悬液（菌株来源：CICC 保藏菌株），使接种后孢子浓度为30万个/毫升。

种子培养条件为：温度37℃，溶氧浓度与风量偶联反馈控制，通过调整风量和罐压将溶氧溶度控制在初始浓度20%以上。

种子罐安装在线微量取样器，在培养过程中连续流出样品，高效液相色谱通过自动进样器对流出样品柠檬酸浓度进行连续测定，根据酸度变化计算产酸速率，并与上一时间点产酸速率比较。另外，培养过程中间隔一定时间进行取样，离线测定种子液葡萄糖浓度和糖化酶活力，并根据葡萄糖变化计算耗葡萄糖速率。当产酸速率、耗葡萄糖速率、糖化酶活力达到最大值后，2h内将种子液移种至发酵罐内培养，当发酵罐还原糖0.5%以下时结束发酵，计算周期和转化率。

对比例1

玉米进行粉碎后，过80目筛；所得玉米粉与自来水，按1:3料水比混合均匀，将浆料pH调节至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高温α-淀粉酶；所得粉浆经过两次喷射，碘试呈浅棕色后得到合格液化液。

液化液用自来水稀释，加入硫酸铵配制成总糖为10%，总氮为0.2%的种子培养基。121℃灭菌20min后降温至37℃后，接入黑曲霉 CICC 40021孢子悬液（菌株来源：CICC 保藏菌株），使接种后孢子浓度为30万个/毫升。

种子培养条件为：温度37℃，固定搅拌转速120r/min、通风比例0.4vvm和罐压0.07Mpa，，溶氧浓度不进行控制。

种子罐培养过程中，观察菌体生长大小及形态，培养20～30h，菌球边缘整齐、伸脚均匀、大小一致后，将种子液移种至发酵罐内培养，当发酵罐还原糖0.5%以下时结束发酵，计算周期和转化率。

按对比例1所述方法重复3批次。

实施例发酵结果与对比例发酵结果如下表1所示，由表可知，通过理化指标反映种子生长状态并以此指导移种，发酵结果标准差更小，批次间更稳定，发酵转化率提高，发酵周期明显缩短。

表1 实施例与对比例发酵结果比较

一种黑曲霉种子培养方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。