专利摘要

本发明公开了受体类分子靶向显像剂及其制备方法和应用，该显像剂具有一个聚乙二醇短链，通过“点击”反应与靶向雌激素受体的17α‑炔雌醇相连接，该显像剂具体结构通式如下：其中，17α‑炔雌醇作为靶向基团，聚乙二醇作为亲水基团，18F为放射性基团。该受体类分子靶向显像剂具有优良的生物性能，在雌激素受体阳性的乳腺癌肿瘤中具有较高的摄取,可以区分雌激素阳性受体和雌激素阴性受体，具有较强特异性，满足用作乳腺癌受体显像剂的条件。

权利要求

1.受体类分子靶向显像剂，其特征在于：该显像剂具有雌激素靶向基团和聚乙二醇短链，具体结构通式如下：

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2.如权利要求1所述的一种受体类分子靶向显像剂的合成与标记方法，包括如下步骤：

1）将化合物1和对甲基苯磺酰氯以摩尔比（1-5）：（2.5-15）的比例混合，在三乙胺作用下，得到化合物2；

2）将化合物2与叠氮化钠以摩尔比（1-5）：（5-1）的比例混合，得到化合物3；

3）将化合物3标记¹⁸F，得到化合物4；

4）将化合物4与17α-炔雌醇发生“点击”反应，得到目标标记产物化合物5；

其中，化合物1至5结构如下所示：

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说明书

技术领域

本发明属于医学影像技术领域，具体涉及一类受体靶向显像剂及其制备方法。

背景技术

乳腺癌严重威胁着女性的健康与生命，据2015年癌症统计数据表明，乳腺癌发病率居于女性恶性肿瘤首位。早期诊断是治疗乳腺癌的关键。1978年，Lippman等人通过实验得出大约70％-80％的乳腺癌患者会过度表达雌激素受体的结论。而今，雌激素受体的分布和水平是乳腺癌预后因素关键的项目之一，临床上根据雌激素受体的状况来决定病人使用抗雌激素类药物的用量。

目前，临床上主要应用病理学的方法来检测和定量乳腺癌受体类型。这种病理切片的方法需要有创操作来获取组织，给病人带来了极大的痛苦，并且很难获取转移灶和复发灶的组织，更不能动态检测肿瘤标志物的表达情况。

在过去的20多年里，随着分子影像技术的不断发展，PET显像技术在检测癌症中的应用日益增多。PET显像技术具有实时动态，多元精准，在体无创，快速便捷等优势，因此PET显像技术是实现乳腺癌早期诊断的理想途径。

分子影像探针作为PET显像技术的核心，决定着PET显像技术的发展。1984年，Kiesewetter等人合成并标记了16α-¹⁸F-17β-雌二醇(¹⁸F-FES)，¹⁸F-FES是以对雌激素受体具有亲和力的雌二醇分子为骨架，在其C-17位标记¹⁸F得到的。1984年，Kiesewetter等人发表了¹⁸F-FES的制备方法，并证明了¹⁸F-FES对雌激素受体蛋白具有很好的相对结合能力(RBA)，之后又对未成熟的大鼠做了生物分布实验，发现大鼠雌激素受体丰富的子宫的摄取明显高于其他组织和器官。1988年，Mintun等人第一次尝试对¹⁸F-FES进行临床研究，13位患者通过¹⁸F-FES-PET显像的方式确诊为乳腺癌，最重要的是，从显像图中可以清晰观察到转移灶的情况。到目前为止，¹⁸F-FES已经成为最成功的雌激素受体显像剂，并已进入临床II期实验。但是，¹⁸F-FES也有一些局限性，即由于¹⁸F-FES脂溶性高，主要经肝代谢，经肾脏排出体外，代谢速率很快，所以很难有效富集于靶组织和器官。

为了改善¹⁸F-FES在体内的代谢情况，使其更好的作用于靶向部位，人们合成并标记了许多种17β-雌二醇衍生物，作为雌激素受体显像剂。1990年，Katzenellenbogen等人合成了一系列C-11位C-17被炔基取代的雌二醇类似物，分别是17α-炔基-雌二醇，17β- 炔基-雌二醇，11β-甲氧基-雌二醇和11β-乙基-雌二醇。通过对各探针进行大鼠生物分布实验，并与¹⁸F-FES的实验结果进行对比得出取代基的引入可以增强17β-雌二醇体内摄取的选择性。2013年，Michel等人提出4-氟-11β-甲氧基-16α-[¹⁸F]氟化雌二醇(4FMFES)在对雌激素受体阳性鼠源乳腺癌(MC7-L1和MC4-L2)肿瘤PET显像的肿瘤摄取要高于¹⁸F-FES。对¹⁸F-FES进行构型改造的例子有很多，但是这些改造都没有真正的降低 ¹⁸F-FES的脂溶性，有的甚至使其脂溶性增加，这些性质限制了该类探针的发展。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一类具有优良显像性能的雌激素受体靶向显像剂。

本发明的另有目的在于提供上述受体靶向显像剂的合成和标记方法。

本发明的再一目的是提供上述受体靶向显像剂在肿瘤显像中的应用。

本发明的具体技术方案如下：

一类受体靶向显像剂，其特征在于：该探针具有一个聚乙二醇短链，通过“点击”反应与靶向雌激素受体的17α-炔雌醇相连接，该显像剂具体结构通式如下：

一类上述受体靶向显像剂的制备方法，包括如下步骤：

1)将化合物1和对甲基苯磺酰氯以摩尔比(1-5)：(2.5-15)的比例混合，在三乙胺作用下，得到化合物2；

2)将化合物2与叠氮化钠以摩尔比(1-5)：(5-1)的比例混合，得到化合物3；

3)将化合物3标记¹⁸F，得到化合物4；

4)将化合物4与17α-炔雌醇发生“点击”反应，得到目标标记产物化合物5。

其合成与标记路线为：

在本发明中，¹⁸F为放射性显影作用，¹⁸F也可以替换为其它常规用于显象剂的放射性元素，此应视为本发明的等同替换。

本发明将PEG链一端标记上¹⁸F，并通过“点击”反应与对雌激素受体有高亲和力的炔雌醇相连接，得到一个新型的雌激素受体靶向显象剂化合物5。从理论上讲，这种结构修饰即对雌激素本身改变不大，又降低其脂溶性，从而降低了肝代谢速率，提高了肿瘤对放射性药物的摄取。初步研究结果表明，雌激素受体靶向显象剂化合物5具有优良的生物性能，包括：对未成熟大鼠生物分布实验时，子宫和卵巢对化合物5的摄取要明显高于其他组织和器官对化合物5的摄取；对雌激素受体阳性的人源乳腺癌(MCF-7)肿瘤PET显像时，肿瘤摄取明显高于肌肉，并且这种摄取可以被抑制；雌激素受体阴性的人源乳腺癌(MDA-MB-231)肿瘤PET显像时，发现MDA-MB-231肿瘤摄取明显低于MCF-7肿瘤，这些实验都充分说明化合物5对雌激素受体具有很高的特异性。另外，化合物5的制备方法简单、成本低，有望在临床上得以推广应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的雌激素受体靶向显像剂，具有雌二醇骨架，同时具有良好的化学稳定性和生物分布性质，比活度高，靶向性强，制备方法简便易行，可用于进行雌激素受体阳性肿瘤PET显像。

(2)本发明受体靶向显像剂具有优良的生物性能。在雌激素受体阳性肿瘤中具有较高的摄取，且摄取具有特异性，满足用作雌激素受体显像剂的条件，靶与非靶比值高，明显优于已有的¹⁸F-FES。另外，较低的非靶脏器摄取能够减少不必要的放射性损伤。

附图说明

图1化合物5(下)及其标准品(上)的高效液相色谱(HPLC)分析图；

图2化合物5的细胞饱和结合曲线(A)；在5-90min内，MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞对化合物5的摄取实验以及在30-90min内，被抑制剂抑制后的MCF-7细胞对化合物5的摄取(B)；MCF-7细胞被抑制前后对化合物5的摄取对比(C)；MCF-7细胞与MDA-MB-231细胞对化合物5摄取的对比(D)。

图3化合物5在正常未成熟的大鼠体内1小时时的组织分布情况，不同组织器官摄取值以每克组织百分注射剂量率(％ID/g)的形式表示；

图4 ¹⁸F-FES在正常未成熟的大鼠体内1小时时的组织分布情况，不同组织器官摄取值以每克组织百分注射剂量率(％ID/g)的形式表示；

图5化合物5在荷MCF-7瘤裸鼠体内的PET显像(A)以及肿瘤和肌肉对化合物5摄取的对比(B)；肿瘤和肌肉摄取的比值(C)。

图6化合物5在被雌激素受体抑制剂处理后的MCF-7瘤裸鼠体内的PET显像(A)以及经抑制剂处理和未经处理实验中肿瘤摄取值的对比(B)；

图7化合物5在荷MDA-MB-231瘤裸鼠体内的PET显像(A)以及该实验结果与MCF-7肿瘤对化合物5摄取值的对比(B)。

图8 ¹⁸F-FES在荷MCF-7瘤裸鼠体内的PET显像(A)以及该实验结果与MCF-7肿瘤对化合物5摄取值的对比(B)。

具体实施方式

以下通过化合物5的具体实施方式结合附图为本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

1.化合物5的制备

1)化合物2的合成：

0℃时，将1.5g化合物1和1.7mL三乙胺溶解在10mL二氯甲烷中，加入4.77g对甲基苯磺酰氯，室温反应5小时。反应结束后，用二氯甲烷萃取反应液三次，收集有机相并旋蒸除去溶剂。将产物过硅胶柱，流动相比例为石油醚：乙酸乙酯＝2：1。得到纯白色晶体即为化合物2。

2)化合物3的合成：

将0.65g叠氮化钠完全溶解于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入4.59g化合物2，室温搅拌5小时。反应完成后，用50mL乙酸乙酯溶解，用40mL去离子水洗涤，收集有机相并旋蒸除去溶剂。产物用硅胶柱纯化，流动相比例为石油醚：乙酸乙酯＝2：1。得到浅黄色油状物质即为化合物3。

3)化合物4的标记：

将¹⁸F^-富集到QMA柱上，再将4mg碳酸钾和13mg 4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷溶于1mL溶剂中(乙腈：水＝9；1)，用该溶液将淋洗QMA柱。在100℃时，用氮吹仪将溶剂吹干，并另加三次无水乙腈吹干，保证体系无水。将化合物3溶于0.5mL无水乙腈加到吹干的¹⁸F^-中，20℃反应20min。反应产物用C18柱进行分离，用1mL四氢呋喃淋洗。得到浅黄色液体。

4)化合物5的标记：

将2mg 17α-炔雌醇，2mg二异丙基乙基胺和1mg碘化亚铜分别加入到化合物4的四氢呋喃溶液中，60℃反应20min。通过放射性-HPLC纯化，放射化学纯度大于99％。高效液相色谱仪条件为：C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相A相为水，B相35％乙腈，流速4mL/min。

以上述化合物5显像剂为例，实验结果表明，其基本性能如下：

1.化合物5的细胞实验

A.MCF-7细胞的饱和结合实验

1)将形成单层贴壁细胞的孔板(24孔板)取出，小心吸出所有培养基，然后向每个孔板中加入0.5mL培养基，再吸出以洗去表面死去或脱落的细胞。这时将孔板举起，透过光线从底部观察，可看见孔板底部有一层均匀的细胞膜，以均匀且没有明显脱落的区域为好。

2)取适量HPLC纯化后的化合物5溶液，用培养基稀释，得到1-100nM的化合物5，将不同浓度的化合物加入到细胞中进行培养，加盖室温放置1h。

3)用1mL PBS(pH＝7.4)洗三次，在用1mL氢氧化钠孵育5-10min。然后用移液器吸头轻刮板孔底部，使细胞完全脱离，吸取孔板内所有溶液和细胞于小试管中。用γ计数器检测每管的放射性。

由图2A并经软件计算可知，化合物5的解离常数Kd为26.54nM，最大结合量Bmax为1.12×10⁴/细胞。

B.细胞摄取及抑制实验

步骤1)同上诉MCF-7细胞的饱和结合实验步骤1)

2)取适量HPLC纯化后的化合物5溶液，用培养基稀释，放射性量稀释为3μCi/mL。

3)首先向抑制组孔板中加入10μL雌二醇溶液(1mg/mL)，然后向所有孔板中分别加入100μL稀释好的化合物5，加盖室温放置5-90min。

步骤4)同上诉MCF-7细胞的饱和结合实验步骤3)。

如图2B，2C和2D所示，雌激素受体阳性的MCF-7的摄取要远远高于雌激素受体阴性的MDA-MB-231细胞，并且MCF-7细胞的摄取可以被抑制剂抑制。说明化合物5在体外层面对雌激素受体具有高特异性。

2.化合物5及¹⁸F-FES的正常大鼠生物分布实验

正常大鼠生物分布实验选用3-4周龄的雌性SD大鼠。大鼠尾静脉注射1.85MBq化合物5或者¹⁸F-FES，于注射后1小时进行生物分布实验。各个器官对化合物5的摄取情况如图3A所示，其中富含雌激素受体的器官子宫和卵巢的摄取要明显高于其他组织和器官，并且肝的摄取很低。说明化合物5在体内层面对雌激素受体具有很强的靶向性。对于抑制组，首先用氟维司群处理实验大鼠，然后尾静脉注射化合物5，从图3B可以看出，抑制组子宫的吸收明显低于正常组，说明化合物5对雌激素受体的特异性高。

各个器官对¹⁸F-FES的摄取情况如图4所示，其中子宫和卵巢的摄取略高，肝脏有很高摄取，即非特异性摄取高。相比之下，¹⁸F-FES对富含雌激素受体的器官的亲和性要低于化合物5。

3.化合物5在乳腺癌模型小鼠体内PET显像

选用8周大的Balb/c雌性裸鼠，于右肩种植雌激素受体阳性的MCF-7肿瘤和雌激素受体阴性的MDA-MB-231肿瘤。待肿瘤长至直径为0.5-1cm时进行PET显像，每只裸鼠通过尾静脉注射约5.92MBq化合物5，于注射后0.5h，1h和2h分别用异氟烷进行吸入式麻醉，俯卧固定后进行静态扫描成像。MCF-7模型裸鼠的PET显像结果如图5所示。由显像结果可知，雌激素受体阳性的乳腺癌肿瘤对化合物有很高的摄取，这种摄取随时间的 变化不明显，并且还有很高的靶与非靶比，说明化合物对雌激素受体阳性的肿瘤具有靶向性。

如图6所示为用氟维司群预处理的MCF-7模型裸鼠的PET显像结果，从图像可知，在氟维司群将肿瘤的雌激素受体充分破坏后，MCF-7模型裸鼠的肿瘤几乎不摄取化合物5，由此证明了化合物5对雌激素受体具有特异性。

MDA-MB-231模型裸鼠的PET显像结果如图7所示，从图中可以看出，MDA-MB-231模型裸鼠的肿瘤几乎不摄取化合物5，化合物5只在雌激素受体阳性的肿瘤中有高摄取，而在雌激素受体阴性肿瘤中的摄取量与非靶组织摄取量相近，证明了化合物5对雌激素受体的特异靶向性。

每只裸鼠通过尾静脉注射约5.92MBq¹⁸F-FES，于注射后0.5h，1h和2h分别用异氟烷进行吸入式麻醉，俯卧固定后进行静态扫描成像。MCF-7模型裸鼠的PET显像结果如图8所示。MCF-7肿瘤对¹⁸F-FES的摄取远远低于对化合物5的摄取，说明化合物5对雌激素阳性的肿瘤的靶向性要优于¹⁸F-FES。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

受体类分子靶向显像剂及其制备方法和应用专利购买费用说明

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