专利摘要
本发明公开了一种胆固醇‑Biotin分子探针及其制备与应用，以胆固醇分子探针(Azide‑probe)为原料，经羟基保护、还原、与Biotin缩合、脱保护反应后，得到如式(1)所示的胆固醇‑Biotin分子探针。本发明的制备方法，具有反应条件温和、合成方法简便特点。本发明还公开了所述胆固醇‑Biotin分子探针在鉴定胆固醇结合蛋白的应用。
权利要求
1.一种胆固醇-Biotin分子探针，其特征在于，其结构如式(1)所示：
2.一种胆固醇-Biotin分子探针的制备方法，其特征在于，以式(a)胆固醇分子探针为原料，经羟基保护反应、还原反应、缩合、脱保护反应，得到所述胆固醇-Biotin分子探针，其结构如式(1)所示；反应过程如路线(1)所示：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述羟基保护反应所用的试剂包括叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑；所述还原反应所用的试剂为三苯基膦；所述缩合反应所用的试剂为Biotin-OSu、三乙胺；所述脱保护反应所用试剂为盐酸四氢呋喃溶液、盐酸乙酸乙酯或盐酸乙醇溶液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，羟基保护反应中，式(a)胆固醇分子探针Azide-probe与叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑的摩尔比为1:3:5；还原反应中，式A1与三苯基膦PPh3和水的摩尔比为1:1.5:20；缩合反应中，式A2与式(b)Biotin-OSu、三乙胺的摩尔比为1:1.5:2。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，如权利要求2或3所述的方法制备得到的式(1)所示的胆固醇-Biotin分子探针。
6.如权利要求1所述的胆固醇分子探针在鉴定胆固醇结合蛋白中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述鉴定胆固醇结合蛋白的过程包括：
i)包被的Avidin beads
式(1)胆固醇-Biotin分子探针和Avidin beads孵育，得到式(1)胆固醇-Biotin分子探针包被的Avidin beads；
ii)结合蛋白：
蛋白和式(1)胆固醇-Biotin分子探针包被的Avidin beads结合，得到式(1)胆固醇-Biotin分子探针结合蛋白。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤i)中，所述孵育的温度为4℃。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤ii)中，所述蛋白和式(1)胆固醇-Biotin分子探针包被的Avidin beads结合的条件为4℃，孵育6小时。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋白为Smoothened蛋白。
说明书
技术领域
本发明属于生物、医药及其制备和应用的技术领域，具体涉及一种胆固醇-Biotin分子探针及其制备、以及其在鉴定胆固醇结合蛋白过程中的应用。
背景技术
胆固醇是一种环戊烷多氢菲的衍生物具有双极性的特点。胆固醇作为重要的营养物质，其具有组成细胞膜，调节细胞膜流动性，合成激素等生理作用，并且胆固醇的衍生物具有调控信号通路的功能。胆固醇结合蛋白功能发生紊乱，会导致多种疾病。研究胆固醇结合对蛋白活性的影响以及鉴定新的胆固醇结合蛋白对完善信号通路过程的理解以及对胆固醇结合蛋白调控相关疾病的治疗具有重要意义。但由于胆固醇分子的双极性分子特征，一直没有好的鉴定胆固醇结合蛋白的方法报道。本发明开发的胆固醇‐Biotin探针用来鉴定胆固醇结合蛋白是一条可行路线，并且具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于鉴定胆固醇结合蛋白的胆固醇分子探针。
本发明提出的胆固醇-Biotin分子探针(胆固醇-生物素分子探针)，其结构式如式(1)所示，
本发明还提出了该胆固醇-Biotin分子探针的制备方法，以式(a)胆固醇分子探针(Azide-probe)为原料，经羟基保护反应、还原反应、与Biotin缩合反应、脱保护反应，得到如式(1)所示的胆固醇-Biotin分子探针，反应过程如路线(1)所示：
具体包括：
(1)羟基保护反应
所述羟基保护所用试剂包括叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、咪唑，反应溶剂为DMF，反应温度为室温25℃。
在室温25℃条件下，在DMF中，式(a)胆固醇分子探针(Azide-probe)与叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑发生羟基保护反应，得到式A1化合物。
所述式(a)胆固醇分子探针(Azide-probe)与叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑的摩尔比为1：3：5。
(2)还原反应
还原反应试剂三苯基膦(PPh3)和H2O(水参与反应过程)，溶剂为THF，反应温度为室温25℃；
在室温25℃条件下，在THF和H2O中，式A1化合物与三苯基膦发生还原反应，得到式A2化合物。
所述式A1化合物与三苯基膦和水的摩尔比为1：1.5：20。
(3)缩合反应
所述缩合反应试剂为式(b)(+)-生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Biotin-OSu)、三乙胺(Et3N)，溶剂为DMF，反应温度为室温25℃；
在室温25℃条件下，在DMF中，式A2化合物与式(b)Biotin-OSu、三乙胺，发生缩合反应，得到式A3化合物。
所述式A2化合物与式(b)Biotin-OSu、三乙胺的摩尔比为1:1.5:2。
(4)脱保护反应
所述脱保护反应所用试剂包括盐酸四氢呋喃溶液、盐酸乙酸乙酯、盐酸乙醇溶液，反应温度为室温25℃。
在室温25℃条件下，在DMF中，式A3化合物在盐酸四氢呋喃溶液、盐酸乙酸乙酯或盐酸乙醇溶液中，发生脱保护反应，得到式(1)胆固醇-Biotin分子探针。
本发明制备方法中，以上反应通常用薄板层析法来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后采用的后处理方法包括浓缩、萃取、柱层析分离等，最终产物通过核磁共振谱来验证。
本发明还提出了由所述方法制备得到的胆固醇-Biotin分子探针，其结构如式(1)所示。
本发明还提出了式(1)所示的胆固醇-Biotin分子探针在鉴定胆固醇结合蛋白中的应用，本发明所述的胆固醇结合蛋白可以是任意的胆固醇结合蛋白，如Smoothened蛋白。
所述式(1)胆固醇-Biotin分子探针在鉴定胆固醇结合蛋白中的应用，包括以下步骤：
i)包被的Avidin beads
式(1)胆固醇-Biotin分子探针和Avidin beads孵育，得到式(1)胆固醇-Biotin分子探针包被的Avidin beads。
ii)结合蛋白：
蛋白和式(1)胆固醇-Biotin分子探针包被的Avidin beads结合，得到式(1)胆固醇-Biotin分子探针结合蛋白。
其中，步骤i)中，
所述孵育的温度为4℃。所述孵育的时间为3～6小时；优选地，为4小时。
其中，步骤ii)中，
所述蛋白和式(1)胆固醇-Biotin分子探针包被的Avidin beads结合的条件为4℃，孵育6小时。
其中，结合蛋白步骤前还可以包括浓缩蛋白的步骤：
在细胞中转染蛋白后，对细胞进行培养后，培养后收集细胞，对收集的细胞进行裂解，然后采用特异性免疫沉淀法沉淀蛋白，并特异性洗脱蛋白，得到浓缩的Smoothened蛋白。
向细胞中转染蛋白的方法为用opti-MEM分别稀释质粒和转染试剂PEI，两者用量比为1:3。将两者混合后，混匀，室温放置15min，加入细胞培养液中。由于转染试剂PEI对细胞有轻微毒性，所以转染后6小时，更换新鲜培养液。
所述细胞包括但不限于真核表达纯化蛋白常用的人肾上皮细胞系，优选地，为293T细胞。
所述蛋白为任何已知或未知的胆固醇结合蛋白，如Smoothened蛋白。
所述培养细胞的条件为：37℃条件下培养48小时。
所述裂解细胞的条件为：用10mM HEPES pH＝7.5，300mM NaCl和1.3％(质量/体积)n-dodecyl-β-d-maltopyranoside(DDM,Anatrace)裂解细胞。
采用Flag beads特异性免疫沉淀Smoothened蛋白，4℃3小时，再用150μg/ml的3xFlag多肽特异性洗脱Smoothened蛋白，最后用10K的浓缩柱对上述洗脱上清进行浓缩，得到浓缩的蛋白。
本发明中，所述Avidin Beads蛋白是指购自Thermo公司的NeutrAvidinTMAgarose，货号：29204。
具体地，式(1)胆固醇-Biotin分子探针在鉴定胆固醇结合蛋白过程中的应用，包括：
本发明胆固醇-Biotin分子探针制备方法的有益效果，反应条件温和、合成步骤简单。制备的式(1)胆固醇-Biotin分子探针可以模拟正常胆固醇活性，在体外结合胆固醇结合蛋白，并且可以进行特异性富集，可以进一步用来鉴定smoothened蛋白的胆固醇结合。开发一种胆固醇探针用来鉴定胆固醇结合蛋白将是一条可行路线，并且具有重要意义。
附图说明
图1为胆固醇-Biotin分子探针结合smoothened蛋白的Western Blot图；图1中Smo-3xFlag代表：C端3xFlag tag融合的Smoothened蛋白。1、2分别代表Western Blot的不同泳道。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
下述实施例中，化合物结构由核磁共振仪测定；试剂主要由上海国药化学试剂公司提供；产品纯化主要通过柱色谱，硅胶(200-300)由青岛海洋化工厂生产。
实施例1：化合物A1的制备
将胆固醇分子探针(Azide-probe)(900mg，2.33mmol)溶于无水DMF(30mL)，0℃加入咪唑(0.8g，11.7mmol)和TBSCl(1.05g，7.0mmol)。室温下反应8小时候，TLC检测反应完全后，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，大量水洗，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝20:1)得到白色固体(992mg,82％)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.31(m,1H),3.54–3.40(m,1H),3.30–3.16(m,2H),0.99(s,3H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H),0.88(s,9H),0.67(s,3H),0.05(s,6H)。
实施例2：化合物A2的制备
将A1(900mg，1.8mmol)溶于30ml四氢呋喃中，加入水(0.75g)和PPh3(708mg,2.7mmol)，室温搅拌12小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液(30mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM:MeOH＝10:1)得到白色固体(780mg,91％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.31(m,1H),3.56–3.37(m,1H),2.76–2.55(m,2H),0.99(s,3H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H),0.88(s,9H),0.67(s,3H),0.05(s,6H)
实施例3：化合物A3的制备
将A2(580mg，1.22mmol)和Biotin-OSu(623mg,1.83mmol)溶于无水DMF(20ml)中，加入三乙胺(356uL,2.45mmol)，N2保护下室温搅拌12小时。TLC检测反应完全后，加水、乙酸乙酯萃取，合并有机相，大量水洗，饱和氯化钠溶液(30mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得到白色固体(780mg)，直接进行下一步反应。
实施例4：式(1)胆固醇-Biotin分子探针的制备
将化合物将A3(780mg)溶于2mol/L HCl/MeOH溶液，室温搅拌2小时，TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，硅胶柱层析(DCM:MeOH＝10:1)得到白色固体(561.3mg,86％)。
实施例5：式(1)胆固醇-Biotin分子探针在鉴定胆固醇结合蛋白过程中的应用。
Smoothened蛋白可以在其N端的半胱氨酸富集区域结合胆固醇分子。首先，在4℃条件下，将实施例4制备的式(1)胆固醇-Biotin分子探针和Avidin beads孵育，4小时，将胆固醇-Biotin分子探针包被在Avidin beads上，再将游离的胆固醇-Biotin分子探针洗干净，得到被胆固醇-Biotin分子探针包被的Avidin beads。在293T细胞中转染Smoothened蛋白后，在37℃条件下培养48小时，收集细胞，采用10mM HEPES pH＝7.5,300mM NaCl和1.3％(质量/体积)n-dodecyl-β-d-maltopyranoside(DDM,Anatrace)裂解细胞，采用Flag beads特异性免疫沉淀Smoothened蛋白，4摄氏度3小时，再用150μg/ml的3xFlag多肽特异性洗脱Smoothened蛋白，最后用10K的浓缩柱对上述洗脱上清进行浓缩。浓缩后的Smoothened蛋白在体外和式(1)胆固醇-Biotin分子探针包被的Avidin beads结合，对照组用胆固醇竞争其结合。结果如图1所示，Smoothened蛋白可以结合胆固醇-Biotin分子探针包被的avidin beads，并且胆固醇可以竞争其结合，证明采用上述实验条件，结合胆固醇-Biotin分子探针可以用来鉴定胆固醇结合蛋白。本发明式(1)胆固醇-Biotin分子探针既具有正常胆固醇的结构，又有可以进行免疫沉淀的biotin结构，弥补了正常胆固醇不能用抗体富集和纯化的不足。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
一种胆固醇‑Biotin分子探针及其制备方法和应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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