专利摘要

本发明公开了一种滇重楼偏诺皂苷Pb的快速和高效制备方法。该方法包括乙醇提取、大孔树脂富集总皂苷以及柱层析分离等三个步骤获得滇重楼中偏诺皂苷Pb，获得重楼皂苷Pb的纯度95％以上。本方法采用乙醇作为提取剂，提取充分；大孔树脂富集总皂苷完全；通过硅胶柱和YMC柱子，有效获得单一偏诺皂苷Pb。该方法采用的提取溶剂毒性小，工艺简便可行，成本低廉，操作步骤简单，易于放大，非常适合规模化生产。

权利要求

1.一种滇重楼偏诺皂苷Pb的制备方法，其特征在于该方法包括乙醇提取、大孔树脂富集总皂苷、柱层析分离步骤，该方法包括下述步骤：

（1）取干燥的滇重楼药材，粉碎为粗粉，加入重量为滇重楼药材重量1~2倍，体积百分浓度为80%的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3h，提取温度为80~85℃，提取液经过滤，合并提取液，然后真空浓缩成含醇5%~10%溶液，滤过，得滤液；

（2）将上述得到的滤液上大孔树脂柱，先用重量为滇重楼药材重量10~20倍，纯水洗脱，弃去洗脱液；再用重量为滇重楼药材重量5~10倍，体积百分浓度为85%的乙醇洗脱，将85%的乙醇洗脱液合并，浓缩，得富含重楼皂苷Pb的粗提取物；

（3）将上述得到的粗提取物与重量为粗提取物1~2倍的100~200目硅胶拌样后，上200~300目硅胶柱，进行硅胶柱层析，采用乙酸乙酯：乙醇=6:1进行洗脱，将含有重楼皂苷Pb成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干，得到重楼皂苷Pb粗品；

（4）将上述得到的偏诺皂苷Pb粗品用60%甲醇溶解，然后上YMC反相硅胶填料柱，先用60%甲醇洗脱，弃去洗脱液，再用70%甲醇洗脱，收集洗脱液，采用旋转蒸仪50℃减压浓缩至近干；

（5）将上述得到的沉淀用甲醇洗涤3次，所得沉淀部分真空干燥箱干燥处理，干燥温度为40-50℃，干燥时间为2-4h，得含量大于95%的偏诺皂苷Pb。

说明书

技术领域

本发明属于植物活性成份的提取技术领域，具体涉及一种从重楼药材中提取分离偏诺皂苷Pb的方法，特别是涉及一种采用大孔树脂富集和柱层析联用快速提取制备滇重楼偏诺皂苷Pb的方法。

背景技术

重楼为延龄草科(Triliaceae)重楼属(paris L.)的多年生草本植物，全世界共有27种，我国有25种，其中有19种分布于我国西南地区，多以根茎入药，是我国常用的传统中药，被历年版《中国药典》收载，《中国药典》2015年版收载重楼品种为七叶一枝花Parispolyphylla Smith Var.chinensis(Franch.)Hara和云南重楼Paris polyphylla Smithvar.yunnanensis(Franch.)Hand.－Mazz.的干燥根茎。重楼，味苦，性微寒，归肝经，有小毒，具有消肿止痛，清热解毒，息风定惊等功效，可用于跌打损伤，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，惊风抽搐等症。

重楼药材中主要含有甾体皂苷类化合物，目前已报道了百余个，根据结构类型主要分为偏诺甾体皂苷(pennogenin saponins)和薯蓣甾体皂苷(diosgenin saponins)，以及C－22内酯甾体皂苷、孕甾烷皂苷(pregnane saponins)和呋甾烷型甾体皂苷(furostanolsaponins)等，大多数甾体皂苷具有较强的药理和生理活性，具有抗肿瘤、止血、抗菌、消炎、镇痛、镇静、抑制血管生成、免疫调节、抗氧化、保护肝脏与肾脏等功效，临床方面重楼皂苷广泛应用于治疗肿瘤、泌尿系统感染和妇科血症等各类疾病的治疗。

近年来，许多学者对重楼皂苷的药理活性和临床应用进行深入而广泛的研究，为重楼皂苷的综合开发和利用开辟更广阔的前景。但由于重楼药材生产年限长和重楼资源减少，影响了重楼皂苷的综合开发和利用。

偏诺皂苷Pb是重楼皂苷的主要有效成分之一，也是重楼药材和含重楼药材制剂质量主要控制的有效成分之一，具有较好的止血活性，对妇科血症有较好的疗效。

偏诺皂苷Pb的分离、制备主要来自于重楼药材化学成分分离和鉴定。目前主要采用半制备方法，以氯仿、甲醇或乙腈等溶剂为洗脱剂，最后通过多次甲醇结晶得到，所得最终产品易存在甲醇等有机溶剂残留。另外，由于氯仿和乙腈溶剂毒性都比较大，易挥发，长时间使用对人体伤害也比较大，且对环境污染也比较严重，限制了其在工业上的大量使用，目前只适用于少量偏诺皂苷Pb样品制备，不适宜规模化生产、制备偏诺皂苷Pb。

发明内容

本发明在研究滇重楼药效成分的基础上，提供了一种快速制备滇重楼偏诺皂苷Pb的新工艺。以滇重楼为原料，乙醇提取、目的在于提供一种从滇重楼提取分离偏诺皂苷Pb的方法，以解决现有从滇重楼药材中分离制备偏诺皂苷Pb时所用的有机溶剂毒性大、对环境污染严重，无法规模化生产的技术难题。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种滇重楼偏诺皂苷Pb的制备方法，该方法包括乙醇提取、大孔树脂富集总皂苷、柱层析分离步骤。

根据所述的一种从滇重楼中提取分离偏诺皂苷Pb的方法，具体包括以下步骤：

(1)将干燥后的滇重楼药材粉碎为粗粉，加入重量为滇重楼药材重量1￣2倍，体积百分浓度为80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3h，提取温度为80￣85℃，提取液经过滤，合并提取液，然后真空浓缩成含醇量5％￣10％溶液，滤过，得滤液。

(2)将上述得到的滤液上大孔树脂柱，先用重量为重楼药材重量10￣20倍，纯水洗脱，弃去洗脱液；再用重量为重楼药材重量5￣10倍，体积百分浓度为85％的乙醇洗脱，将85％的乙醇洗脱液合并，浓缩，即得富含重楼皂苷Pb的粗提取物。

(3)将上述得到的粗提取物与重量为粗提取物1.5￣2.0倍的100￣200目硅胶拌样后，上200￣300目硅胶柱，进行硅胶柱层析，采用乙酸乙酯：乙醇＝6：1进行洗脱，将含有偏诺皂苷Pb成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干，得到偏诺皂苷Pb粗品。

(4)得到的偏诺皂苷Pb粗品用体积百分浓度为60％的甲醇溶解，然后上YMC柱，先用60％甲醇洗脱，弃去洗脱液，再用70％甲醇洗脱，收集洗脱液，采用旋转蒸仪50℃减压浓缩至近干。

(5)浓缩旋干的固体用少量甲醇3次洗涤，所得沉淀部分真空干燥箱干燥处理，干燥温度为40－50℃，干燥时间为2－4h，即得含量大于98％的重楼皂苷Pb。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：

(1)采用80％乙醇热提取，提取较充分。

(2)采用大孔树脂富集总皂苷，工艺简单，更适合规模化。

(3)硅胶柱与YMC柱结合分离皂苷，避免使用氯仿与乙腈等有毒溶剂引入。

(4)本发明提取分离滇重楼偏诺皂苷Pb时所采用的提取溶剂为乙醇、乙酸乙酯和水，毒性小，工艺简便可行，适用于工业化大生产，且所用溶剂易回收、可反复使用，对环境污染较小，所得的偏诺皂苷Pb纯品为下一步药物的研发和应用奠定了基础。

附图说明

图1为重楼皂苷Pb的质谱图；

图2为重楼皂苷Pb的氢谱图；

图3为重楼皂苷Pb的碳谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

下述实施例中所使用到的仪器与试药为：

仪器：BRUKER AV－500M型核磁共振仪(德国，布鲁克)；安捷伦G6230飞行时间液质联用仪(安捷伦科技有限公司)。

试药与试剂：滇重楼药材(产地：丽江云鑫绿色生物开发有限公司)；乙醇、甲醇、乙酸乙酯为分析纯(泰坦公司)；水为超纯水；大孔树脂D－101(天津市海光化工有限公司)；YMC反相硅胶填料柱(50μm，日本YMC株式会社)。

实施例1

从滇重楼提取分离偏诺皂苷Pb的方法，具体包括以下步骤：

(1)将干燥的滇重楼药材粉碎为粗粉(1.0kg)，加入重量为滇重楼药材重量1￣2倍(约2L)，体积百分浓度为80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3h，提取温度为80－85℃，提取液经过滤，合并提取液，然后真空浓缩成含醇量5％￣10％溶液，滤过，得滤液。

(2)将上述得到的滤液上大孔吸附树脂柱(3kg，柱内径为8.5cm)，先用重量为重楼药材重量15￣20倍(约20L)，纯水洗脱弃去洗脱液；再用重量为滇重楼药材重量10￣20倍，体积百分浓度为85％的乙醇洗脱，将85％的乙醇洗脱液合并，浓缩，即得到偏诺总皂苷，称重为15g。

(3)将上述得到的粗提取物与重量为粗提取物1.0－1.5倍(约22g)的100￣200目硅胶拌样后，上200￣300目硅胶柱(0.5kg；柱内径为4cm)，进行硅胶柱层析，采用乙酸乙酯：乙醇＝6：1进行洗脱，洗脱剂用量约4L，将含有重楼皂苷Pb成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干，得到偏诺皂苷Pb粗品，重量为4.4g，纯度约18－25％。

(4)将上述得到的偏诺皂苷Pb粗品用YMC拌样，然后上YMC柱(柱内径为26mm，高460mm)，先用60％甲醇1L洗脱，弃去洗脱液，再用70％甲醇1L洗脱，收集洗脱液，采用旋转蒸仪50℃减压浓缩至近干，得到偏诺皂苷Pb。

(5)将上述获得固体用甲醇洗涤3次，每次5ml，所得沉淀部分真空干燥箱干燥处理，干燥温度为40℃，干燥时间为4h，即得含量大于95％的重楼皂苷Pb，产量为0.88g。

实施例2

从滇重楼提取分离重楼皂苷Pb的方法，具体包括以下步骤：

(1)将干燥的滇重楼药材粉碎为粗粉(10kg)，加入重量为滇重楼药材重量4－6倍(约50L)，体积百分浓度为80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3h，提取温度为80－85℃，提取液经过滤，合并提取液，然后真空浓缩成含醇量5％￣10％溶液，滤过，得滤液。

(2)将上述得到的滤液上大孔吸附树脂柱(30kg，柱内径为27cm)，先用重量为滇重楼药材重量15￣20倍(约200L)，纯水洗脱弃去洗脱液；再用重量为滇重楼药材重量10￣20倍，体积百分浓度为85％的乙醇洗脱，将85％的乙醇洗脱液合并，浓缩，即得到偏诺总皂苷，称重为152g。

(3)将上述得到的粗提取物与重量为粗提取物1.0－1.5倍(约220g)的100￣200目硅胶拌样后，上200￣300目硅胶柱(8kg；柱内径为8.5cm)，进行硅胶柱层析，采用乙酸乙酯：乙醇＝6：1进行洗脱，洗脱剂用量约40L，将含有重楼皂苷Pb成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干，得到偏诺皂苷Pb粗品，重量为42g，纯度约18￣25％。

(4)将上述得到的偏诺皂苷Pb粗品用YMC拌样，然后上YMC柱(678g；柱内径为49mm，高460mm)，先用60％甲醇15L洗脱，弃去洗脱液，再用70％甲醇15L洗脱，收集洗脱液，采用旋转蒸仪50℃减压浓缩至近干，得到偏诺皂苷Pb。

(5)将上述获得固体用甲醇洗涤3次，每次100ml，所得沉淀部分真空干燥箱干燥处理，干燥温度为40℃，干燥时间为4h，即得含量大于95％的重楼皂苷Pb，产量为8.5g。

重楼皂苷Pb的结构鉴定，详见图1至图3：

重楼皂苷Pb，白色结晶(甲醇)，分子式为C₄₅H₇₂O₁₇，CAS登记号：55916－52－4；ESI－MSm/z：907[M+Na]⁺。¹H－NMR(CD₃OD，500MHz)δ：0.71(3H，d，J＝5.5Hz，CH3－27)，097(3H，s，CH3－18)，1.09(3H，s，CH3－19)，1.25(3H，d，J＝7.1Hz，CH3－21)，1.77(3H，d，J＝6.1Hz，CH3－Rha)，4.83(1H，d，J＝5.8Hz，Glc－H－1)，5.37(1H，s，Rha－H－l)，5.38(1H，s，Rha－H－1)，5.12(1H，brs，H－6)。¹³C－NMR(CD₃OD，125MHz)δ：37.2(C－1)，30.7(C－2)，78.3(C－3)，38.8(C－4)，141.2(C－5)，122.2(C－6)，32.3(C－7)，32.0(C－8).50.0(C－9)，36.9(C－10)，20.9(C－11)，31.9(C－12)，44.8(C－13)，52.6(C－14)，31.0(C－15)，90.3(C－16)，90.7(C－17)，17.4(C－18)，19.8(C－19)，43.9(C－20)，9.6(C－21)，110.8(C－22)，31.9(C－23)，28.7(C－24)，30.3(C－25)，66.7(C－26)，17.7(C－27)，Glc：100.1(C－1′)，77.3(C－2′)，77.4(C－3′)，76.6(C－4′)，76.9(C－5′)，62.0(C－6′)，Rha：101.9(C－1″)，72.4(C－2″)，73.0(C－3″)，74.0(C－4″)，70.0(C－5″)，19.2(C－6″)，Rha：111.0(C－1″′)，83.2(C－2″′)，78.2(C－3″′)，86.6(C－4″′)，62.3(C－5″′)。其NMR数据与文献[华栋，刘杨，王夏茵，陆云阳，李慧，汤海峰.宽叶重楼化学成分研究[J].东南药学，2015，13(1)：43－46.]中的数据基本一致。

一种滇重楼偏诺皂苷Pb的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。