专利摘要
本发明提供一种抗耐药菌活性物质青霉碱醚A，是一个结构新颖的海洋天然活性物质，利用已知的一株海洋灰黄青霉菌株ZZ380，通过特定分离培养方法获得，并首次证明了该化合物具有强烈抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的活性，效果特别显著，本发明克服现有抗生素药物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染耐药的不足，所述青霉碱醚A在制备抗耐药菌药物方面具有更加广泛的应用前景，可为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的有效治疗提供一种新的药物分子。所述的青霉碱醚A的化学结构式为：
权利要求
1.一种抗耐药菌活性物质青霉碱醚A，所述的青霉碱醚A的化学结构式为：
2.权利要求1所述抗耐药菌活性物质青霉碱醚A的制备方法，其特征在于，通过以下步骤获得：
(1)灰黄青霉的分离培养
取粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)在75％的乙醇中浸泡10秒除去表面微生物,然后用无菌水清洗三次后匀浆,离心后取上层液配制成不同浓度的悬浮液，取不同浓度的悬浮液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下培养后，将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下继续培养，最后将生长良好的单一菌落接种到斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用；固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂，室温条件为：温度22～28℃，培养时间为5～15天；
(2)灰黄青霉的菌种鉴定
上述步骤(1)分离培养所获得的菌株用目前实验室普遍使用的ITS rDNA序列分析方法鉴定其种类，确定为灰黄青霉，分类命名为Penicillium griseofulvum ZZ380，已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号:CCTCC M 2018344，保藏日：2018.6.4；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；
(3)灰黄青霉发酵菌液的制备
将灰黄青霉的菌种接种到含有菌种培养基的大三角烧瓶中，将含有ZZ380菌种的培养液在室温条件下振荡培养后得到菌种液，最后将菌种液转入含有液体培养基的大三角烧瓶中，经特定温度静置培养后，得到含有活性物质青霉碱醚A的发酵菌液；
(4)青霉碱醚A的提取分离纯化
菌株ZZ380的发酵菌液离心后分成发酵菌丝体和发酵液两部分，菌丝体用甲醇提取得到甲醇提取物，发酵液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，将甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物合并得到总提取物，总提取物先用十八烷基硅烷键合硅胶柱层析分离,分别用40％、60％、80％和100％的甲醇洗脱，得到组分I～IV，组分IV再用制备型高效液相色谱仪分离纯化，得到纯化合物青霉碱醚A；
(5)青霉碱醚A的结构鉴定
青霉碱醚A的结构是根据它的紫外光谱、一维和二维核磁共振谱、高分辨质谱数据以及单晶X-射线衍射等方法相结合而确定。
3.根据权利要求2所述抗耐药菌活性物质青霉碱醚A的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的菌种培养基和液体培养基均为马铃薯-葡萄糖肉汤液体培养基，所述的用量为250mL；特定温度为28℃，培养时间为30天。
4.根据权利要求2所述抗耐药菌活性物质青霉碱醚A的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述柱层析的用量与上柱的样品量比例是30～50g：1.0g；所述的高效液相分离条件是:岛津LC-20AP高效液相色谱仪，富士C18CT-30色谱柱280×30mm，10μm，甲醇和水为流动相体积比91/9，检测波长210nm，流速为15.0mL/min。
5.根据权利要求1所述的抗耐药菌活性物质青霉碱醚A在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物中的应用。
说明书
技术领域
本发明属医药领域,涉及抗耐药菌海洋活性化合物青霉碱醚A(Penicipyrroether A)及该化合物的制备和在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物方面的应用。
背景技术
抗生素滥用引起的致病菌对抗生素的耐药性不断增强,耐药突变菌株的种类和数量不断增多已成为威胁人类健康的一个重大难题。在金黄色葡萄球菌感染的病例中,被称为超级细菌的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染所占比例已高达60％,其中30％的病例对万古霉素产生了耐药性并且呈逐年上升的趋势。一直以来万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的金标药物,然而由于万古霉素在临床上频繁使用而导致MRSA对其耐药性不断增强。另一方面,微生物出现耐药性变种的速率已经远远超过人类开发新型抗生素的速度,如何对抗耐药菌株尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已成为世界性难题。
海洋特殊的物理化学环境以及生物多样性和复杂性,迫使海洋微生物具有与陆地微生物不同的新陈代谢途径、生存繁殖方式和适应机制,因而产生许多陆地微生物无法产生的化学结构新颖和生物活性独特的代谢产物,是发现新型抗耐药菌株活性物质的重要资源。
中国专利(申请号:2018107457853)公开了抗耐药菌活性化合物灰黄青霉碱双醚A的制备和用途,该化合物是海洋灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380)在BMPM培养基中产生的代谢产物,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长具有好的抑制作用,其MIC(最低抑菌浓度)为5.0μg/mL。本发明从同一菌株(P.griseofulvum ZZ380)的不同培养基(PDB)的发酵菌液中分离得到另一个结构新颖的活性化合物青霉碱醚A(Penicipyrroether A),该化合物抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的活性更强,其MIC为1.7μg/mL。因此青霉碱醚A在制备抗耐药菌药物方面具有好的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种抗耐药菌活性物质青霉碱醚A(Penicipyrroether A)，是一种具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的化合物青霉碱醚A，所述的青霉碱醚A为一新化合，其化学结构式为：
本发明的第二个目的是提供所述的抗耐药菌活性物质青霉碱醚A的制备方法，通过以下步骤分离培养而获得：
(1)灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380)的分离培养
取粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)在75％的乙醇中浸泡10秒除去表面微生物,然后用无菌水清洗三次后匀浆,离心后取上层液配制成不同浓度的悬浮液。取一定量不同浓度的悬浮液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中,在室温条件下培养一定时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中,在室温条件下继续培养一定时间。最后将生长良好的单一菌落(ZZ380)接种到斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用。
所述的粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)是从浙江普陀山海滩的岩石缝中获得；所述悬浮液的浓度为1×10-3～1×10-1(取1mL匀浆后离心所得的上层液体,加入9mL无菌水,配成体积浓度为10-1的样品悬浮液,逐倍稀释得到体积浓度为10-2和10-3的样品悬浮液)；所述的样品悬浮液的取样量为100～300μL；所述培养皿所含的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA,马铃薯粉6g,葡萄糖20g,琼脂20g,氯霉素0.1克,购自杭州微生物试剂有限公司)培养基；所述的斜面培养基为PDA。
所述的室温条件为：培养温度为22～28℃，培养时间为5～15天。
(2)灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380)的菌种鉴定
上述步骤(1)分离培养所获得的菌株ZZ380用目前实验室普遍使用的ITS rDNA序列分析方法鉴定其种类，确定为灰黄青霉，分类命名为Penicillium griseofulvum ZZ380，已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号:CCTCC M 2018344，保藏日：2018.6.4；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
(3)灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380)发酵菌液的制备
将灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380)的菌种接种到含有一定量的菌种培养基的大三角烧瓶中,将含有ZZ380菌种的培养液在室温条件下振荡培养一定时间后得到菌种液。最后将菌种液转入含有一定量的液体培养基的大三角烧瓶中,特定温度静置培养一定时间后,得到含有活性物质青霉碱醚A的发酵菌液。
所述的菌种培养基和液体发酵培养基均为马铃薯-葡萄糖肉汤(PDB,马铃薯100g,葡萄糖10g,海盐35g,水1L)液体培养基,所述的用量为250mL；所述的大三角培养瓶为500mL；所述的培养温度为28℃；所述的培养时间为30天。
(4)青霉碱醚A的提取分离纯化
菌株ZZ380的发酵菌液离心后分成发酵菌丝体和发酵液两部分。菌丝体用甲醇提取得到甲醇提取物,发酵液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物。将甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物合并得到总提取物。总提取物先用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离,分别用40％、60％、80％和100％的甲醇洗脱,得到组分I～IV,组分IV再用制备型高效液相色谱仪分离纯化,得到纯化合物青霉碱醚A。
所述柱层析的ODS用量与上柱的样品量比例是30～50g:1.0g；所述的高效液相分离条件是:岛津LC-20AP高效液相色谱仪,富士C18CT-30色谱柱(280×30mm,10μm),甲醇和水为流动相(91/9,体积比),检测波长210nm,流速为15.0mL/min。
(5)青霉碱醚A的结构鉴定
青霉碱醚A的结构是根据它的紫外光谱、一维和二维核磁共振谱、高分辨质谱数据以及单晶X-射线衍射等方法相结合而确定。
本发明的第三个目的是提供所述的抗耐药菌活性物质青霉碱醚A在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物中的应用，所述的青霉碱醚A在抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长中效果非常显著，可与药学上可接受的载体组成药物，用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染。
总之，本发明利用已知的一株海洋灰黄青霉菌株ZZ380，通过特定分离培养方法，获得一个结构新颖的海洋天然活性物质青霉碱醚A，并首次证明了该化合物具有强烈抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的活性，效果特别显著，可为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的有效治疗提供一种新的药物分子，克服现有抗生素药物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染耐药的不足，所述青霉碱醚A在制备抗耐药菌药物方面具有更加广泛的应用前景。
附图说明
图1是灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380)的菌落图。
图2是青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的紫外光谱图。
图3是青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的高分辨质谱。
图4～6是青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的氢谱。
图7～9是青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的碳谱。
图10是青霉碱醚A(Penicipyrrodiether A)的1H-1H COSY谱
图11是青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的HSQC谱
图12是青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的HMBC谱。
图13是青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的单晶X-射线衍射结构图。
图14是青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的1H-1H COSY和HMBC相关示意图。
具体实施例
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。但是,本发明不限于这些实施例。
实施例1.灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380)的分离培养
取称重的粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)(20.1克)，在75％的乙醇中浸泡10秒除去表面微生物，然后用无菌水清洗三次后匀浆，离心后取上层液体配制成体积浓度为1×10-1、1×10-2、1×10-3的样品溶液(取1mL匀浆后离心所得的上层液体，加入9mL无菌水，配成体积浓度为10-1的样品溶液，并逐倍稀释得到体积浓度为10-2和10-3的样品溶液)。取各浓度的样品溶液200μL均匀分散到含有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA，马铃薯粉6g,葡萄糖20g,琼脂20g,氯霉素0.1克,购自杭州微生物试剂有限公司)固体培养基的培养皿中,在28℃条件下培养5天后,将不同的菌落分别转移到另一含有PDA固体培养基的培养皿中，在28℃条件下继续培养5天。最后将生长良好的单一菌落(ZZ380)接种到PDA固体斜面培养基培养后,置于4℃冰箱保存备用。
实施例2.灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380)的菌种鉴定
使用ITS rDNA序列分析方法鉴定所获得菌株ZZ380的种类。
2.1实验试剂及仪器
PCR试剂:PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)，引物(Invitrogen合成)，引物序列是：
Marker:DL2000
实验仪器：离心机,电泳仪,PCR仪,ABI 3730XL测序仪。
2.2实验步骤
2.2.1真菌基因组DNA抽提
使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工)，使用前先对真菌进行液氮研磨。
2.2.2真菌基因组DNA浓度及质量检测
使用Nanodrop超微量分光光度计进行DNA浓度及质量检测。
2.2.3 PCR扩增
a.PCR反应体系
b.PCR反应条件
98℃2min
72℃10min
10℃∞
c.电泳检测
1％琼脂糖凝胶电泳150v,22min
上样量:4μl,Loading buffer 2μl,Marker 4μl
d.测序:切胶纯化测序
e.分析结果:拼接序列。
2.3实验结果
拼接后的序列为：
CTTCCGTAGGGGGACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGCCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCCTCGGCGGGCCCCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAGACCTATAACGAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCCAACCTTTAATTATCTCAGGTTGACCTCGGATCAGAGTCAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
以上获得的ITS rDNA序列与美国NIH的NCBI GenBank数据库比较,其结果表明:菌株ZZ380的ITS rDNA序列与GenBank库中的Penicilliumgriseofulvum的ITS rDNA序列有99％的相似性(登录号:KF811439.1)。因此,本发明所获得的海洋菌株ZZ380定为灰黄青霉(Penicillium griseofulvumZZ380)(附图1)。灰黄青霉(Penicillium griseofulvumZZ380)的菌株已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号:CCTCC M 2018344，保藏日：2018.6.4，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
实施例3.灰黄青霉(Penicillium griseofulvumZZ380)发酵菌液的制备
挑取PDA固体斜面培养基上的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum ZZ380),接种到含有250mL马铃薯-葡萄糖肉汤(PDB,马铃薯100g,葡萄糖10g,海盐35g,水1L)液体培养基的500mL三角烧瓶中。将含有ZZ380菌种的培养液在28℃条件下旋转(180rpm)振摇培养3天后得到菌种液。将5mL菌种液转入到含有250mL的PDB的500mL三角烧瓶中,在28℃条件下静置培养30天,得到含有活性物质青霉碱醚A的发酵菌液。
实施例4.青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的提取分离纯化
将实验3获得的发酵菌液(55.0升)离心得到菌丝体和菌液。菌丝体用甲醇提取三次得到甲醇提取物,菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物,合并得到总提物(23.0g)。总提物用ODS(900g)柱层析分离,分别用甲醇和水混合溶剂(40/60,60/40,80/20,100/0,体积比)洗脱,总共得到组分I～IV。其中组分IV(0.19g)用半制备型高效液相色谱仪分离(仪器:岛津LC-20AP；色谱柱:富士C18CT-30,280×30mm,10μm；流动相:甲醇/水体系,体积比91/9；检测波长:210nm,流速:15.0mL/min),得到化合物青霉碱醚A(16.1mg,保留时间41.0min)。
实施例5.青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的结构鉴定
青霉碱醚A:无色块状晶体；分子式C32H41NO5； 紫外光谱(附图2)UV(MeOH)λmax(logε)202(4.20),229(3.66),278(2.67)nm；高分辨质谱(HRESIMS)(附图3)为m/z[M+H]+520.3063(计算值C32H42NO5,520.3063)和[M+Na]+542.2877(计算值C32H41NNaO5,542.2882)。通过青霉碱醚A的1H谱(附图4～6)、13C谱(附图7～9)、1H-1H COSY谱(附图10)、HSQC谱(附图11)、HMBC谱(附图12)和X射线单晶衍射(附图13),确定了青霉碱醚A的结构,为一个新化合物,其13C和1H核磁共振信号归属见表一。它的1H-1H COSY和HMBC相关示意图见附图14。
表一、青霉碱醚A的13C和1H NMR数据(溶剂:氘代吡啶)
a说明：δH 7.22的信号与氘代溶剂吡啶的信号重叠。
实施例6.青霉碱醚A(Penicipyrroether A)的抗菌活性
采用营养肉汤稀释法，测定青霉碱醚A抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生长的作用，并同时测定CN201810745785.3提供的灰黄青霉碱双醚A(penicipyrrodiether A)的抗菌活性，具体操作为：
将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)接种于营养琼脂(Nutrient Agar,NA,杭州微生物试剂有限公司)平板上，置于37℃恒温培养箱培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基(Nutrient Broth,NB，杭州微生物试剂有限公司)，37℃恒温振荡(180rpm)培养10h获得菌液。以NB培养基作为参比,在550nm波长下检测菌液的OD值，控制在0.08～0.1范围内。
分别将二个样品用二甲基亚砜配制成一定浓度(1mg/mL，可根据预设检测浓度适当调整)的母液，经0.22μm无菌有机滤头过滤除菌后加入96孔板内，然后加入一定量的NB培养基和2μL上述菌液，使每个孔内的最终体积为200μL，菌液浓度为106CFU/mL，样品浓度为预设检测浓度。以二甲基亚砜和庆大霉素分别作为阴性和阳性对照药,37℃恒温静置培养12h。
将没有变浑浊并且给药浓度最低的孔内的培养物接种于NA平板,37℃恒温静置培养12h,若无可见菌落生长,则此孔对应的浓度为该样品的最低杀菌浓度(MBC),有可见菌落生长，则此孔对应的给药浓度为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。
实验结果显示，青霉碱醚A能够显著抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的生长，其MIC值为1.7μg/mL(3.28μM)，而灰黄青霉碱双醚A抗耐药菌活性的MIC为5.0μg/mL(7.02μM)。实验结果说明青霉碱醚A对耐药菌MRSA的生长具有好的抑制作用,其活性明显强于灰黄青霉碱双醚A，与阳性对照药庆大霉素的MIC值(1.47μM)更为接近。实验结果说明青霉碱醚A对耐药菌MRSA的生长具有更好的抑制作用，在制备抗耐药菌MRSA感染药物方面具有更好的应用前景。
总之，本发明从海洋灰黄青霉(Penicillium griseofulvumZZ380)中分离鉴定了一个新的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性化合物青霉碱醚A。本发明提供了青霉碱醚A的制备方法,发现了青霉碱醚A显著抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的活性。由于青霉碱醚A具有良好的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性，所以青霉碱醚A在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物方面具有应用前景。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 抗耐药菌活性物质青霉碱醚A及制备和用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
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抗耐药菌活性物质青霉碱醚A及制备和用途专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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