专利摘要
本发明涉及一种柠檬苦素化合物及其二聚体。具体地，本发明公开一种结构如式(I)所示的柠檬苦素化合物和结构如(IIa)或(IIb)所示的柠檬苦素二聚体，式中各个基团的定义详见说明书。本发明还公开了它们的制备方法和用途。
权利要求
1.一种柠檬苦素化合物，其结构如式(I)所示：
式中，R
2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：从红树植物Xylocarpus moluccensis的种子中提取得到所述化合物。
3.一种柠檬苦素二聚体，其结构如式(IIa)或(IIb)所示：
各式中，R
4.一种如权利要求3所述的柠檬苦素二聚体的制备方法，其特征在于，包括步骤：在惰性溶剂中，在氧化剂存在下，将化合物(I)进行聚合反应，从而形成化合物(IIa)和化合物(IIb)；
各式中，R
所述惰性溶剂选自下组：CH
所述氧化剂选自下组：MnO
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂和化合物(I)的当量比为1：1～1：2。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚合反应的温度为室温。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚合反应的时间为1-12小时。
8.如权利要求1所述的柠檬苦素化合物或如权利要求3所述的柠檬苦素二聚体的用途，其特征在于，用于制备治疗癌症或抑制癌症细胞生长的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症选自下组：黑色素瘤、胃癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、及其组合。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症细胞选自下组：A375、AGS、HCT-8、HCT-8/T、A549、MDA-MB-231、SKBR3、MB453、MCF-7、MCF-7/ADR，及其组合。
说明书
技术领域
本发明属于天然产物领域。具体地，本发明涉及一种柠檬苦素化合物及其二聚体，还涉及其制备方法和应用。
背景技术
红树植物是一类生长在热带、亚热带海洋潮间带的耐盐植物群落。全球现有红树植物84种，可分为真红树和半红树两大类。其中真红树植物70种，半红树植物14种[1]。全球属于楝科的红树植物仅有真红树植物木果楝一属。据文献报道，木果楝属红树植物的主要次生代谢产物为柠檬苦素。柠檬苦素是一类高度氧化的四降三萜类化合物，主要存在于楝科、芸香科、苦木科和叶柄花科等植物中。该类化合物是由具有4,4,8-三甲基-17-呋喃甾体骨架的前体经过一系列的氧化重排衍生而来的。柠檬苦素主要有拒食、杀虫、抗菌、抗疟和抗癌等多种生物活性。
柠檬苦素类化合物是高度氧化的萜类化合物，结构复杂多变，通过有机合成的方法获得十分困难，因此，现发现的柠檬苦素化合物多为天然产物。同时，柠檬苦素类化合物的分离鉴定工作起步也较晚，自1960年，David A.H.Taylor等人对安哥拉非洲楝(Entandrophragma angolense C.DC)的柠檬苦素类化合物的研究起，人们对楝科植物来源的柠檬苦素的研究才开始兴起。同大多数次生代谢产物一样，柠檬苦素在植物中含量通常较低，要得到大量的，同时具较好生物活性的柠檬苦素化合物需大量的付出。
发明内容
本发明的目的是提供一种柠檬苦素化合物，及其制备方法和用途。
本发明的另一目的是提供一种柠檬苦素二聚体，及其制备方法和用途。
本发明第一方面提供了一种柠檬苦素化合物，其结构如式(I)所示：
式中，R
在另一优选例中，R
在另一优选例中，R
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的化合物的制备方法，包括步骤：从红树植物Xylocarpus moluccensis的种子中提取得到所述化合物。
本发明第三方面提供了一种柠檬苦素二聚体，其结构如式(IIa)或(IIb)所示：
各式中，R
在另一优选例中，R
在另一优选例中，R
本发明第四方面提供了本发明第三方面所述的柠檬苦素二聚体的制备方法，包括步骤：在惰性溶剂中，在氧化剂存在下，将化合物(I)进行聚合反应，从而形成化合物(IIa)和化合物(IIb)；
各式中，R
在另一优选例中，所述惰性溶剂选自下组：CH2Cl2、CH3CN、MeOH，EtOH、CHCl3、CH3COCH3、AcOH、CH3COOCH2CH3、H2O、DMSO，及其组合。
在另一优选例中，所述氧化剂选自下组：MnO2、Ag2O、FeCl3·6H2O、硝酸铈(IV)铵(CAN)以及2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(DDQ)；和/或所述氧化剂和化合物(I)的当量比为1：1～1：2(较佳地，为1：1～1：1.2)。
在另一优选例中，所述聚合反应的温度为室温；和/或所述聚合反应的时间为1-12小时(较佳地，为2-6小时；更佳地，为3-4小时)。
本发明第五方面提供了本发明第一方面所述的柠檬苦素化合物或本发明第三方面所述的柠檬苦素二聚体的用途，用于制备治疗癌症或抑制癌症细胞生长的药物组合物。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：黑色素瘤、胃癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、及其组合。
在另一优选例中，所述癌症细胞选自下组：A375、AGS、HCT-8、HCT-8/T、A549、MDA-MB-231、SKBR3、MB453、MCF-7、MCF-7/ADR，及其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为化合物1的HR-ESI。
图2A为化合物1的HNMR(氘代氯仿，400MHz)。
图2B为化合物1的HNMR(氘代DMSO，400MHz)。
图3A为化合物1的CNMR(氘代氯仿，100MHz)。
图3B为化合物1的CNMR(氘代DMSO，100MHz)。
图4为化合物2a的HR-ESI。
图5为化合物2a的HNMR(氘代氯仿，400MHz)。
图6为化合物2a的CNMR(氘代氯仿，100MHz)。
图7为化合物2b的HR-ESI。
图8为化合物2b的HNMR(氘代氯仿，400MHz)。
图9为化合物2b的CNMR(氘代氯仿，100MHz)。
图10为化合物1的HMBC(氘代DMSO，400MHz)。
图11为化合物1的HMBC(氘代氯仿，400MHz)。
图12为化合物2a的HMBC(氘代氯仿，400MHz)。
图13为化合物2b的HMBC(氘代氯仿，400MHz)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地从红树植物中提取到一种具有良好抗癌活性的柠檬苦素化合物，并进一步通过人工合成的方法制得了一种具有特定旋转构型的且具有良好抗癌活性的柠檬苦素二聚体。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“C1-C10烷基”是指具有1-10个碳原子的支链或直链的烷基，术语“C1-C6烷基”是指具有1-6个碳原子的支链或直链的烷基，术语“C1-C5烷基”是指具有1-5个碳原子的支链或直链的烷基。具体例子可以包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、己基等类似基团。
如本文所用，术语“C6-C10芳基”是指具有6-10个碳原子的芳基，具体例子可以包括苯基、萘基等类似基团。
如本文所用，术语“C2-C5烯基”是指具有2-5个碳原子的支链或直链的烯基，具体例子可以为乙烯基、丙烯基、丁烯基、甲基丙烯基、异戊烯基等类似基团。
如本文所用，术语“C2-C5烷基酰基”是指具有2-5个碳原子的支链或直链的烷基酰基，具体例子可以为乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基等类似基团。
如本文所用，术语“C2-C5烯基酰基”是指具有2-5个碳原子的支链或直链的烯基酰基，具体例子可以为甲基丙烯酰基、巴豆酰基等类似基团；
如本文所用，所述“被选自氯、溴、三氟甲基的取代基所取代的苯甲酰基”可以为2’-氯苯甲酰基、2’-溴苯甲酰基、2’-三氟甲基苯甲酰基、4’-氯苯甲酰基、4’-溴苯甲酰基、4’-三氟甲基苯甲酰基。
柠檬苦素化合物及其制备方法
本发明的柠檬苦素化合物，其结构如式(I)所示：
式中，R
在另一优选例中，R
在另一优选例中，R
在另一优选例中，所述取代基选自下组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、异戊烯基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、甲基丙烯酰基、巴豆酰基、苯甲酰基、2’-氯苯甲酰基、2’-溴苯甲酰基、2’-三氟甲基苯甲酰基、4’-氯苯甲酰基、4’-溴苯甲酰基、4’-三氟甲基苯甲酰基。
所述的化合物可由以下方法制备得到。
例如，包括步骤：从红树植物Xylocarpus moluccensis的种子中提取得到所述化合物。
具体地，例如包括步骤：
(1)对红树植物Xylocarpus moluccensis的种子(优选干燥的)用乙醇(如95％的乙醇)进行浸泡、提取，提取液合并并浓缩，从而得到第一粗浸膏；
(2)将第一粗浸膏与水混和后，用乙酸乙酯萃取，有机相合并并浓缩，从而得到第二粗浸膏；
(3)用硅胶(优选100-200目)柱层析分离纯化第二粗浸膏，得到所述化合物。
在步骤(1)中，所述浸泡、提取在室温下进行。
在步骤(1)中，所述浸泡每次20-60小时(优选24-50小时；更佳地为48小时)。
在步骤(1)中，所述浸泡、提取进行3-8次(优选4-6次)。
在步骤(2)中，所述萃取进行3-8次(优选4-6次)。
在步骤(3)中，所述柱层析用氯仿-甲醇体系梯度洗脱；较佳地，所述梯度为100:0-5:1(氯仿:甲醇)。
所述化合物还可以经过重结晶。例如，用丙酮和甲醇重结晶。其中，丙酮和甲醇的用量比例为2：1。
柠檬苦素二聚体及其制备方法
本发明的柠檬苦素二聚体，其结构如式(IIa)或(IIb)所示：
各式中，R
所述的柠檬苦素二聚体可通过如下方法制备得到，
例如，包括步骤：在惰性溶剂中，在氧化剂存在下，将化合物(I)进行聚合反应，从而形成化合物(IIa)和化合物(IIb)。
所述惰性溶剂可选自下组：CH2Cl2、CH3CN、MeOH，EtOH、CHCl3、CH3COCH3、AcOH、CH3COOCH2CH3、H2O、DMSO，及其组合。
所述氧化剂可选自下组：MnO2、Ag2O、FeCl3·6H2O、硝酸铈(IV)铵(CAN)以及2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(DDQ)。
所述氧化剂和化合物(I)的当量比为1：1～1：2(较佳地，为1：1～1：1.2)。
所述聚合反应的温度为室温。
所述聚合反应的时间为1-12小时(较佳地，为2-6小时；更佳地，为3-4小时)。
所述聚合反应可以在氮气保护下进行，也可以不用氮气保护。
所述聚合反应也可以在助剂(如TFA等)存在下进行，当然也可以不添加助剂。
活性成分
如本文所用，术语“本发明化合物”指式(I)、式(IIa)或(IIb)所示的化合物。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的抗癌活性，因此本发明化合物以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于抑制癌症细胞生长以及用于治疗、预防以及缓解癌症。所述癌症选自下组：黑色素瘤、胃癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌或其组合。所述癌症细胞选自下组：A375、AGS、HCT-8、HCT-8/T、A549、MDA-MB-231、SKBR3、MB453、MCF-7、MCF-7/ADR，或其组合。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.5-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有1-500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如 )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、十二指肠、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.5～2000mg，优选1～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的优点主要包括：
1.本发明提供了一种柠檬苦素化合物，其具有良好的抗癌活性。
2.本发明提供了上述柠檬苦素化合物的分离纯化方法，该方法操作简便、且产品收率高。
2.本发明通过上述柠檬苦素化合物进一步合成得到了一种具有良好抗癌活性的柠檬苦素二聚体。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。
实施例1化合物1的制备
1仪器与材料
Waters 2535Q半制备高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters 2489双通道紫外可见光检测器(美国Waters公司)，Bruker AVANCEⅢ400型核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)，amaZon SL离子阱电喷雾质谱仪(德国Bruker Daltonics公司)。正相硅胶(100～200目)为青岛海洋化工厂产品，反相硅胶(C18)为日本YMC公司产品，乙腈、甲醇为色谱纯(德国Merck公司),其他试剂均为分析纯。
红树植物Xylocarpus moluccensis(X.moluccensis)的种子于2009年8月采集于印度安德拉邦哥达瓦里河红树林湿地。由Tirumani Satyanandamurty(Government DegreeCollege at Amadala valasa,Srikakulam District,Andhra Pradesh,India)鉴定。
2实验部分
干燥的X.moluccensis种子6.0kg，粉碎后用95％的乙醇室温下浸提五次(5×20L)，每次浸泡48小时。提取液合并减压浓缩得到粗浸膏1100.0g。粗浸膏加水混悬，继而用乙酸乙酯萃取五次，减压浓缩得乙酸乙酯萃取部分520.0g。
乙酸乙酯萃取物(320.0g)经正向硅胶(100-200目)柱层析，氯仿-甲醇体系梯度(100:0-5:1)洗脱，共得到262个流份。流份12-21合并(63.8g)，经丙酮/甲醇(2:1)结晶得化合物1(1.9g)。化合物1的HR-ESI、HNMR、CNMR数据分别如图1-图3B所示；HMBC数据如图10-图11所示。
表1.化合物1的
实施例2化合物1二聚体的制备
1实验部分
DDQ(80.9mg,0.36mmol)添加到化合物1(197mg,0.30mmol)的甲醇溶液(80mL)。反应混合物在室温下搅拌3.5h。然后，浓缩反应混合物并用制备型HPLC纯化(YMC-Pack 250×10mm i.d.)，得到产物2a(58.6mg,MeCN/H2O,70:30),2b(18.9mg,MeCN/H2O,80:20，并含有0.3％AcOH)。
式中，R为异丁酰基。
化合物2a和2b的HR-ESI、HNMR、CNMR数据分别如图4-图9所示；HMBC数据如图12-图13所示。
表2.化合物2a和2b的
2讨论部分
考察了用于化合物1的交叉偶联的不同氧化剂，包括AgO/HNO3、Mn(OAc)3、MnO2、Ag2O、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、FeCl3·6H2O、硝酸铈(IV)铵(CAN)以及2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(DDQ)。意外发现DDQ作为氧化偶联试剂时可以得到产物2a，且该方法同时获得了(M)-构象二聚体结构产物2a和(P)-构象的异构体产物2b。而强氧化剂FeCl3·6H2O、Ag2O和CAN无法得到化合物2a和2b作为主要产物的结果。至于其他三种氧化剂，AgO/HNO3、Mn(OAc)3和mCPBA根本不发生反应。
另外考察了DDQ作为氧化偶联试剂时的化合物1的氧化交叉偶联的溶剂。结果发现：当溶剂为1,4-二氧六环、丙酮、DMSO、CH3NO2、或AcOH时，无法得到期望的产物。当溶剂为CH2Cl2、CH3CN或MeOH时，可以得到化合物2a和2b。最后发现CH3OH是最优的。
在选择CH3OH作为溶剂后，还考察了DDQ的使用量的影响。结果发现：当DDQ少于1.0当量时，反应无法完全完成。然而，当DDQ超过1.2个当量时，无法进一步提高产物产率。因此，采用1.2个当量的DDQ足以使反应完成。
最终该反应是在CH3OH中，DDQ(1.2当量)作为氧化剂，在室温下完成的。
另外，实验人员还在反应体系中添加了助剂(例如CF3CO2H(TFA)，结果发现实验结果基本不变。
另外，实验人员还将反应在氮气保护下进行，结果发现实验结果基本不变。
实施例3 MTT细胞毒性试验
在MTT细胞毒性试验中使用以下人肿瘤细胞系：黑色素瘤A375，胃癌AGS，结肠直肠癌(HCT-8和HCT-8/T)，肺癌A549，乳腺癌(MDA-MB-231，SKBR3，MB453，MCF-7，MCF-7/ADR)进行了测定。
将所有细胞系在37℃，5％CO2的湿润气氛中在具有10％胎牛血清、苄青霉素(50kU/L)和链霉素(50mg/L)的DMEM培养基中在培养瓶中培养为贴壁单层细胞。用胰蛋白酶收集细胞，并以5×10
表3
MCF-7/ADR：耐药株，高表达P-gp；MCF-7：重复
另外，实验人员也对化合物2b进行了实验，结果发现，化合物2b对上述细胞系有一定的作用，但是相对较2a弱。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
柠檬苦素化合物及其二聚体专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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