专利摘要

本发明公开了榆黄菇蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。该应用是榆黄菇蛋白质提取物在制备抗肿瘤产品或抗肿瘤细胞产品中的应用，所述榆黄菇蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：1）将榆黄菇子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到榆黄菇水溶性提取物；2）对所述榆黄菇水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述榆黄菇蛋白质提取物。该榆黄菇蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，IC50值分别为1.0μg/mL,0.45μg/mL,1.15μg/mL，并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加。

权利要求

1.榆黄菇蛋白质提取物在制备抗肿瘤产品或抗肿瘤细胞产品中的应用，所述榆黄菇蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1)将榆黄菇子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到榆黄菇水溶性提取物；

2)对所述榆黄菇水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述榆黄菇蛋白质提取物；

所述肿瘤为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述肿瘤细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞；

所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行；所述步骤2)中，在4℃对所述榆黄菇水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀。

2.榆黄菇蛋白质提取物在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用，所述榆黄菇蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1)将榆黄菇子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到榆黄菇水溶性提取物；

2)对所述榆黄菇水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述榆黄菇蛋白质提取物；

所述肿瘤细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞；

所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行；所述步骤2)中，在4℃对所述榆黄菇水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀。

说明书

技术领域

本发明涉及榆黄菇蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。

背景技术

目前，据世界卫生组织(WHO)统计,每年世界上有1000万人患上癌症,而死于癌症的人数约6万,占全球死亡人数的12%。我国每年新增癌症患者180万,死亡140万,平均每3分钟就有1.3人死于癌症,而且癌症的发病率呈急剧上升趋势，去年癌症新增病例人数约为139万，占世界癌症发病总数的17%，基本接近1/5。其中，肺癌是世界范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，其发病率增长速度亦高居各恶性肿瘤之首，肝癌在我国成年人群中发病率较高，是消化系统肿瘤中常见的一类恶性肿瘤，其发现时间通常较晚，治疗效果差，死亡率高，而乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，我国发病率呈明显上升趋势，尽管在临床上对早期乳腺癌有多种有效的治疗方案，但仍有约30%的患者会出现复发转移。对于癌症的治疗，选择高效低毒的药物、制订个体化方案、预测治疗效果等方面都需要进行深入研究。目前的癌症治疗方法主要有手术、化疗和放疗，化学药物一般直接作用于靶向器官，见效快，但副作用较多，最严重的副作用是骨髓抑制，患者最感痛苦的是恶心、呕吐等消化道症状，同时化疗药物可降低机体免疫力，使白细胞急剧下降。生物类药物具有安全低毒的特性，受到深入的研究，生物药物以天然的生物材料为主，其主要来源于微生物、动植物以及一些代谢产物等，主要功能成分有蛋白质、核酸、糖类、脂类等，这些物质不仅对人体无害而且还是重要的营养物质，具有应用于癌症的预防、治疗和诊断的广阔前景。

榆黄菇（PleurotusCirtinopileatus）又名金顶侧耳，属担子菌门，层菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属，是食药兼用的珍稀蕈菌。榆黄菇子实体可药用，有滋补强壮的功能，治疗肾虚阳痿症、痢疾，长期食用，有降低血压、降低胆固醇含量的功能，其富含蛋白质，氨基酸和维生素等多种营养成份，含有17种氨基酸，富含人体必须的8种氨基酸，尤其是谷氨酸含量与菇类含量最高的草菇相同，并含有丰富的钾、钠、钙、铁、锌，以及维生素C、烟酸、泛酸等，是具有潜在应用价值的食用菌。目前关于榆黄菇的研究主要以培养条件优化、优质菌筛选和提取物功能活性等为主。研究表明，利用中药渣栽培食用菌是解决培养料资源缺乏的一种有效途径，为此，刘正鲁等试验进行了中药渣栽培榆黄菇配方研究。结果表明，随着栽培料组分药渣含量的提高，榆黄菇菌丝发菌速度和鲜菇产量降低。为进一步提高其商品性及菇农栽培榆黄菇的经济效益，许庆国进行不同菌株对比试验，筛选出一些优质高产的菌株。榆黄菇高产的一个重要技术措施就是覆土栽培，张秋胜等选用3种覆土栽培模式进行比较分析，认为榆黄菇林地仿野生栽培模式所产子实体形态好，生物学效率和经济效益最高。诱变育种也是选育优良菌株的一种方法，在食药用真菌新菌株选育中也进行过一些尝试，王艳杰采用尖端菌丝⁶⁰Co-γ射线辐照诱变方法，加快遗传突变，结果表明：在辐照剂量为600Gy、辐照剂量率为43.5Gy/h的条件下，能获得生长优良的诱变菌株，其菌丝生长速度快于出发菌株，且具有遗传稳定性。然而目前从榆黄菇子实体中分离纯化蛋白及其对小鼠的抑瘤和免疫活性的研究尚属空白。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供具有抗肿瘤活性的榆黄菇蛋白质提取物。

本发明所提供的榆黄菇蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：

1）将榆黄菇子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到榆黄菇水溶性提取物；

2）对所述榆黄菇水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述榆黄菇蛋白质提取物。

上述步骤1）中，所述用水浸提可为在2-6℃用水浸提10-14小时。所述水可为去离子水。

所述榆黄菇子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。所述干燥的子实体是将新鲜的榆黄菇子实体在常温（如20-25℃）下干燥得到的。

所述新鲜榆黄菇子实体和水的体积比可为1：4-6，如1：4。

上述步骤1）中，可采用离心收集所述水溶性物质。离心收集所述水溶性物质的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。上述步骤2）中，也可采用离心收集所述沉淀。离心收集所述沉淀的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。

上述步骤2）中，在4℃对所述榆黄菇水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀。

上述步骤2）中，所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。

上述制备方法还包括将透析后的半透膜内的液体在3000-9000g（如6000g），离心10-20分钟（如15分钟），收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，制备成榆黄菇蛋白质提取物干粉的步骤。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述榆黄菇蛋白质提取物的用途。

本发明所提供的上述榆黄菇蛋白质提取物的用途，为下述A或B：

A、抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品），其活性成分为上述榆黄菇蛋白质提取物；

B、上述榆黄菇蛋白质提取物在制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品）中的应用。

上述用途中，所述肿瘤可为实体肿瘤。

所述实体肿瘤可为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述肿瘤细胞可为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞。所述肺癌可为肺腺癌，所述肺癌细胞可为肺腺癌细胞。

所述肝癌细胞可为人肝癌细胞，如HepG2细胞；所述乳腺癌细胞可为人乳腺癌细胞，如MCF-7细胞；所述肺癌细胞可为人肺腺癌细胞，如A-549细胞。

上文中，所述榆黄菇具体可为榆黄菇（Pleurotuscitrinopileatus）CFCC89573。

本发明的榆黄菇蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，HepG2、MCF-7、A-549细胞的增殖均明显受到抑制，且IC₅₀值分别为1.0μg/mL,0.45μg/mL,1.15μg/mL，并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加；光镜下可观察细胞凋亡形态的改变。说明榆黄菇蛋白质提取物对HepG2、MCF-7、A-549细胞均有显著的抑制增殖作用，可用于制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品。

附图说明

图1为BCA蛋白定量试剂盒制作标准曲线。

图2为MTT法测定榆黄菇蛋白质提取物处理HepG2细胞72h后细胞凋亡情况。

图3为MTT法测定榆黄菇蛋白质提取物处理MCF-7细胞72h后细胞凋亡情况。

图4为MTT法测定榆黄菇蛋白质提取物处理A-549细胞72h后细胞凋亡情况。

图2-图4中，0、0.3，0.6，0.9，1.2和1.5分别表示0μg/mL组，0.3μg/mL组，0.6μg/mL组，0.9μg/mL组，1.2μg/mL组，1.5μg/mL组；下方的培养板从左至右的列依次为0μg/mL组，0.3μg/mL组，0.6μg/mL组，0.9μg/mL组，1.2μg/mL组，1.5μg/mL组；数据结果以平均数±标准差表示（n=3），经单因素方差分析，其中*表示与0μg/mL组比较具有显著性差异（*P<0.05）的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的榆黄菇（Pleurotuscitrinopileatus）CFCC89573，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心（中国林业微生物菌种保藏管理中心,ChinaForestryCultureCollectionCenter英文缩写CFCC，简称林业微生物中心）获得。

实施例1、榆黄菇蛋白质提取物的制备

1、制备榆黄菇子实体

将榆黄菇（Pleurotuscitrinopileatus）CFCC89573斜面菌种接种到一级种培养基中进行活化，25℃恒温培养，待菌丝长满试管后将其接种到二级种培养基中，25℃恒温培养室培养至菌丝长满，将二级种接种到装有栽培培养基的栽培袋中25℃的条件下进行发菌，菌种长满栽培袋后进行搔菌并移入温室大棚，出菇条件保持湿度在90%以上，温度为16℃，收集第一潮子实体，得到榆黄菇（Pleurotuscitrinopileatus）CFCC89573子实体。

其中，该实验所用的培养基如下：

一级种培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，3gKH₂PO₄,10mg维生素B1,5g蛋白胨，1.5gMgSO₄，1000mL蒸馏水，经121℃，30min高压灭菌。

二级种培养基：棉籽壳80%，麸皮18%，石膏1%，糖1%.，料水比为1:1，经121℃，30min高压灭菌。

栽培培养基：棉籽壳78%，麸皮20%，石膏1%，糖1%，料水比为1:1。经121℃，30min高压灭菌。

2、制备榆黄菇水溶性提取物

用4倍体积的去离子水浸泡步骤1的新鲜榆黄菇（Pleurotuscitrinopileatus）CFCC89573子实体2小时，利用组织捣碎机将混合物进行组织破碎至糊状，于4℃浸提（即静置）12h后，12000g离心15min，收集上清溶液，该上清溶液即为榆黄菇水溶性提取物。

3、制备榆黄菇蛋白质提取物

在4℃向步骤2的榆黄菇水溶性提取物中加入(NH₄)₂SO₄至(NH₄)₂SO₄的饱和度为80%，于4℃条件下静置4小时，12000g离心15min，收集沉淀，对该沉淀进行透析。其中，透析采用的半透膜的截留分子量为3kDa，沉淀在半透膜中在流动的自来水中透析5h，再在去离子水中透析12h。将透析后的半透膜内的液体在6000g离心15min，收集上清液，将该上清液置于液氮中冷冻干燥36小时，得到榆黄菇蛋白质提取物，作为抑制肿瘤细胞增殖药物。

实施例2、榆黄菇蛋白质提取物抑制肿瘤细胞增殖实验

1.1供试细胞株

人肝癌HepG2细胞（购自美国ATCC）、人乳腺癌MCF-7细胞（购自美国ATCC）和人肺腺癌A-549细胞（购自美国ATCC）。

1.2实验方法

1.2.1细胞系及细胞培养

人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞按照常规培养方法进行活化和传代。其中，人肝癌HepG2细胞的传代和活化培养基是DMEM-高糖+1%双抗+10%FBS（在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）和胎牛血清（FBS，Hyclone，SV30087.02），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的传代和活化培养基是RPMI1640+1%双抗+10%FBS（在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素、链霉素混合液和胎牛血清（FBS），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。

1.2.2细胞活性检测

采用噻唑蓝比色法（MTT）检测实施例1的榆黄菇蛋白质提取物对人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的抑制活性，具体方法如下：

本实验选用步骤1.2.1的P8代（第8代）细胞，以每孔7×10³个/mL细胞接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，随机选18孔细胞分为6组，一个对照组和5个实验组，分别为0μg/mL组（对照组），0.3μg/mL组，0.6μg/mL组，0.9μg/mL组，1.2μg/mL组，1.5μg/mL组，每组三孔细胞。0μg/mL组的每孔细胞中加入200μL无血清培养液，0.3μg/mL组每孔加入200μL榆黄菇蛋白质提取物浓度为0.3μg/mL的含榆黄菇蛋白质提取物培养液；0.6μg/mL组每孔加入200μL榆黄菇蛋白质提取物浓度为0.6μg/mL的含榆黄菇蛋白质提取物培养液；0.9μg/mL组每孔加入200μL榆黄菇蛋白质提取物浓度为0.9μg/mL的含榆黄菇蛋白质提取物培养液；1.2μg/mL组每孔加入200μl榆黄菇蛋白质提取物浓度为1.2μg/mL的含榆黄菇蛋白质提取物培养液；1.5μg/mL组每孔加入200μL榆黄菇蛋白质提取物浓度为1.5μg/mL的含榆黄菇蛋白质提取物培养液。加完培养液在37℃培养72h后，每孔加入200μLMTT工作液（无菌水配制的5mg/mLMTT溶液：无血清培养液=1:9（体积比）避光继续培养4h，小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加200μLDMSO（二甲基亚砜），震荡孵育10min，使结晶物充分融解。用酶标仪在560nm波长处测吸光度，以对照组的细胞存活率为100%，计算实验组细胞的存活率：实验组细胞存活率=OD（实验组）/OD（对照组）%。各组细胞的凋亡率=100%-各组细胞的存活率。实验重复三次。

试验所有数据采用SPSS12.0（SPSSInc.，USA）统计软件的独立样本t检验处理统计。根据各组细胞的凋亡率计算榆黄菇蛋白质提取物对每种癌细胞的IC50值（使癌细胞的凋亡率为50%的含榆黄菇蛋白质提取物培养液中榆黄菇蛋白质提取物浓度）。

其中，人肝癌HepG2细胞的无血清培养液是DMEM-高糖+1%双抗；0.3μg/mL组，0.6μg/mL组，0.9μg/mL组，1.2μg/mL组和1.5μg/mL组中每孔加入的含榆黄菇蛋白质提取物培养液分别是向DMEM-高糖+1%双抗中加入榆黄菇蛋白质提取物母液得到的榆黄菇蛋白质提取物浓度分别为0.3μg/mL，0.6μg/mL，0.9μg/mL，1.2μg/mL和1.5μg/mL的液体。DMEM-高糖+1%双抗是在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。

人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的无血清培养液是RPMI1640+1%双抗；0.3μg/mL组，0.6μg/mL组，0.9μg/mL组，1.2μg/mL组和1.5μg/mL组中每孔加入的含榆黄菇蛋白质提取物培养液分别是向RPMI1640+1%双抗中加入榆黄菇蛋白质提取物母液得到的榆黄菇蛋白质提取物浓度分别为0.3μg/mL，0.6μg/mL，0.9μg/mL，1.2μg/mL和1.5μg/mL的液体。RPMI1640+1%双抗是在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。

上述榆黄菇蛋白质提取物母液均是用各种细胞的相应无血清培养液溶解实施例1制备的榆黄菇蛋白质提取物，配制成蛋白质含量为10μg/ml的榆黄菇蛋白质提取物水溶液。

其中，榆黄菇蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量的测定方法如下：

1）标准曲线的制作：利用标准样品小牛血清蛋白（BSA）配置成不同浓度的蛋白溶液，采用BCA（北京博迈德科技公司）蛋白定量试剂盒制作标准曲线（图1）。

2）采用BCA蛋白定量试剂盒测定榆黄菇蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量，该蛋白质含量即为榆黄菇蛋白质提取物水溶液中榆黄菇蛋白质提取物浓度。

2实验结果及分析

2.1榆黄菇蛋白质提取物抗肿瘤活性检测结果

MTT法测定结果表明，实施例1的榆黄菇蛋白质提取物对三株癌细胞均有抑制作用，抑制率均表现出剂量依赖性，与对照组相比，随着榆黄菇蛋白质提取物浓度的增加，HepG2细胞、MCF-7细胞和A-549细胞的凋亡率均增高，且IC50值分别为1.0μg/mL，0.45μg/mL，1.15μg/mL；光镜下可观察到细胞凋亡形态的改变。具体抑制效果见表1和图2-4。

表1.榆黄菇蛋白质提取物对三株癌症细胞体外抑制率

榆黄菇蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。