专利摘要

专利摘要

本发明涉及新型博来霉素类似物及其制备方法和用途。具体地说，本发明涉及式I化合物或其药学可接受的盐，本发明化合物具有良好的抗肿瘤活性。 CGMCCNo.5295 2011.09.28

权利要求

1.式I化合物或其药学可接受的盐：

2.根据权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中所述的盐是与无机酸或者有机酸形成的盐。

3.根据权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中所述药学可接受的盐是盐酸盐。

4.制备权利要求1至3任一项所述化合物或其药学可接受的盐的方法，其包括以下步骤：

(a)使轮枝链霉菌发酵，发酵液以草酸酸化，过滤，将滤液用碱液中和；

(b)使步骤(a)所得液料经[H⁺]型树脂吸附，蒸馏水冲洗后，用稀酸水溶液洗脱，将活性部分合并，调至pH呈中性；

(c)加入适量硫酸铜，用大孔吸附性树脂脱盐，然后用[NH₄⁺]型柱进行柱层析，用NH₄Cl溶液反复洗脱，分离得到式I化合物的含铜品洗脱液；

(d)使上述含铜品洗脱液经大孔吸附性树脂脱盐，干燥，得到式I化合物的含铜品纯品；

(e)使含铜品纯品经双硫腙脱铜，干燥，得到式I化合物；以及，任选地

(f)将步骤(e)所得式I化合物进行纯化。

5.根据权利要求4的方法，其中步骤(a)中，所述轮枝链霉菌是轮枝链霉菌平阳新种(Streptomyces verticillus var.pingyangeusis n.sp.NC1101)。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1至3任一项所述化合物或其药学可接受的盐以及药学可接受的载体或赋形剂。

7.权利要求1至3任一项所述化合物或其药学可接受的盐在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

8.根据权利要求7的用途，其中所述肿瘤选自乳腺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新颖的糖肽类抗生素及其药学可接受的盐，还涉及该化合物的制备方法以及其在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

现有的从轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的发酵培养基中发现的博来霉素(又称博莱霉素)族化合物，是一类糖肽类抗肿瘤抗生素(Pittillo RF，Woolley C，Rice LS.Bleomycin，an Antitumor Antibiotic：Improved Microbiological Assay and Tissue Distribution Studies in Normal Mice[J].Appl Microbiol，1971，22(4)：564)。本发明的发明人在轮枝链霉菌平阳新种(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var.)发酵培养基中曾相继纯化得到平阳霉素即博来霉素A5(许鸿章，张鹤镛.平阳霉素的分离和鉴别[J].药学学报，1980；15(10)：609)、博安霉素即博来霉素A6(许鸿章，戴丽华，张鹤镛.争光霉素A 6和它在争光霉素复合物中的地位[J].药学学报，1988，23(9)：667)、博宁霉素(Z-893)(CN1231340A；许鸿章，于雷，张秀荣，王世镛.博宁霉素(Z-893)的分离纯化和结构测定[J].中国抗生素杂志2003，28(8)：465)、NC0604(CN101628931A)。

博来霉素族抗生素具有下式所示的结构：

其中某些化合物的R基团分别为：

博来霉素A₁：-NH(CH₂)₃S(O)CH₃，

博来霉素A₂：-NH(CH₂)₃S(CH₃)₂，

博来霉素A₅：-NH(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH₂，又称为平阳霉素，

博来霉素A₆：-NH(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NH₂，又称为博安霉素，

博来霉素B₁：-NH₂，

博来霉素B₂：-NH(CH₂)₄NHC(＝NH)NH₂，

Z-893：-NH(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCOCH₃，又称为博宁霉素，

NC0604：-NH(CH₂)₃NH(CH₂)₄NHCH₂CH₂CONH₂。

尽管有诸多博来霉素族化合物显示具有有效的抗肿瘤活性甚至尝试用于动物甚至人体治疗，然而本领域仍然期待提供具有例如更高生物学活性的化合物例如博来霉素族化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有例如更高生物学活性的化合物例如博来霉素族化合物。本发明人从轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)发酵液中分离纯化得到一种具有新颖结构的化合物，在本文中可称为NC1101，发现此化合物具有更高的抗肿瘤活性。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了以下式I化合物或其药学可接受的盐：

根据本发明第一方面的化合物或其药学可接受的盐，其中所述的盐是与无机酸或者有机酸形成的盐。在一个实施方案中，所述的无机酸包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸、硝酸等。在一个实施方案中，所述的有机酸包括但不限于乙酸、丙酸、枸橼酸、酒石酸等。在一个实施方案中，所述药学可接受的盐是盐酸盐。

本发明第二方面提供了制备本发明第一方面所述化合物或其药学可接受的盐的方法，其包括以下步骤：

(a)使轮枝链霉菌(例如其平阳新种)发酵，发酵液以草酸酸化，过滤，将滤液用碱液中和；

(b)使步骤(a)所得液料经[H⁺]型树脂吸附，蒸馏水冲洗后，用稀酸水溶液洗脱，将活性部分合并，调至pH呈中性；

(c)加入适量硫酸铜，用大孔吸附性树脂脱盐，然后用[NH₄⁺]型柱进行柱层析，用NH₄Cl溶液反复洗脱，分离得到式I化合物的含铜品洗脱液；

(d)使上述含铜品洗脱液经大孔吸附性树脂脱盐，干燥，得到式I化合物的含铜品纯品；

(e)使含铜品纯品经双硫腙脱铜，干燥，得到式I化合物；以及，任选地

(f)将步骤(e)所得式I化合物进行纯化。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a)中，所述轮枝链霉菌是轮枝链霉菌平阳新种(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.sp.NC1101)。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a)中，所述草酸酸化至pH约为2。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，所述[H⁺]型树脂是[H⁺]型122型树脂。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(c)中，所述大孔吸附性树脂是大孔吸附性树脂X-5。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(c)中，所述[NH₄⁺]型柱是[NH₄⁺]型CM-Sephadex C-25型柱。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，所述大孔吸附性树脂是大孔吸附性树脂X-5。

根据本发明第二方面的方法，其基本上包括以下步骤：(a)轮枝链霉菌平阳新种经发酵后，发酵液以草酸调至pH约为2，过滤，滤液调至pH约为7；(b)经122树脂[H⁺]吸附，蒸馏水冲洗后，用约0.3M HCl洗脱，将活性部分合并，调至pH约为7；(c)加入适量硫酸铜，用大孔吸附性树脂X-5脱盐后，进行CM-Sephadex C-25[NH₄⁺]柱层析，用NH₄Cl溶液反复洗脱分离得到式I化合物的含铜品洗脱液；(d)再经大孔吸附性树脂X-5脱盐、干燥后得到式I化合物的含铜品纯品；(e)再经双硫腙脱铜、干燥，得到式I化合物；以及，任选地(f)将步骤(e)所得式I化合物进行纯化。

本发明第三方面提供了一种药物组合物或其药学可接受的盐，其包含本发明第一方面所述化合物以及药学可接受的载体或赋形剂。基于本发明式I化合物的生物学活性，本发明的药物组合物可用作抗肿瘤药物。

本发明第四方面提供了本发明第一方面所述化合物或其药学可接受的盐在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

本发明第五方面提供了在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括给所述受试者施用治疗有效量的本发明第一方面所述化合物或其药学可接受的盐。

本发明第六方面提供了用于治疗肿瘤的药物，其包含本发明第一方面所述化合物或其药学可接受的盐，以及任选的药学可接受的载体或赋形剂。

根据本发明，所述肿瘤包括各种良性和恶性肿瘤以及癌症，包括但不限于乳腺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明人付出大量努力，从轮枝链霉菌平阳新种(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var.)发酵液中分离纯化新型活性产物NC1101，鉴定其结构，并测定其抗肿瘤活性。利用大孔吸附树脂、离子交换树脂等方法对NC1101进行分离纯化，利用UV、MS及NMR对新化合物结构进行鉴定，利用MTT法测定化合物对几株人类肿瘤细胞的细胞毒性。结果表明，从发酵液中分离纯化得到化合物NC1101，经结构确证其为新型化合物，并对几株肿瘤细胞表现出良好的生长抑制作用。

本发明化合物(包括游离型的式I化合物以及它们药学可接受的盐)的结构总体上包括以下I、II、III、IV、V、VI、G、M、R九个基团部分，并且R部分的各个碳原子的编号可以如a、b、c、d、e、f、g、h、i、j所示标注，具体如下：

通过采用轮枝链霉菌属的微生物发酵、培养、分离、纯化等过程可以得到本发明化合物，这些方法可以参考本领域技术人员已知的一些方法，例如CN1231340A或CN101628931A中记载的方法。

本发明优选使用的轮枝链霉菌属的微生物是轮枝链霉菌平阳新种(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.sp.NC1101)，其已于2011年9月28日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.5295，参椐的微生物(株)为：Streptomyces verticillus var. pingyangensis，建议的分类命名为：Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.sp.NC1101。

从上述菌种的发酵液中分离含有本发明化合物的粗提物，再从粗提物中分离纯化得到本发明化合物。

本发明化合物的制备方法，包括发酵培养、分离、提取和精制，发酵培养所述轮枝链霉菌属的微生物。

用于培养所述微生物的培养基中，采用可被其利用的营养源即碳源、氮源、无机盐、有机盐和能被其利用的痕量营养物，这些成分可预先一次性地加入培养基中，或者间歇或者连续地加入培养基中。

对本发明所用的较好的微生物来说，可采用如下培养基(按重量计)：葡萄糖0.4～0.6％；豆饼粉3～4％；玉米浆0.4～0.6％；NaCl 4～5％；玉米粉1～3％；淀粉2.0～3.0％；KH₂PO₄0.01～0.02％；ZnSO₄0.04～0.06％；CuSO₄0.08～0.12％；玉米油0.3～0.5％，其余为水，调pH值为6.0～6.5。

培养的方式可采用静态培养、摇床培养、搅拌培养、浸没培养或其它方式，但对大量生产来说，优选为浸没培养。

培养条件(时间、温度、pH等)随菌种不同而变，也随培养基成分的变化有所不同，本领域技术人员按照培养工艺能够根据具体情况而选择。

在发酵产生本发明化合物的过程中，可加入也可不加入本发明化合物的前体物质或者通过微生物代谢能够产生本发明化合物侧链(R基团)的物质。

当本发明化合物在培养基中积累达到最大浓度时终止培养，从发酵液中分离含有化合物的粗品，可采用发酵产物的一般提取分离方法进行。例如，可使用吸附、离子交换、冷干等方法，亦可在每一分离步骤中将二种或以上的方法结合使用。更详细地说，按照常规方法，首先进行过滤或离心，分离出固形的菌丝和培养滤液，本发明的化合物主要存在于培养滤液中，将培养滤液用大孔树脂进行层析、浓缩，收集活性成分，减压蒸馏除去有机溶剂，减压冷冻干燥，即得到本发明化合物的粗品。

为了从粗品中进一步精制，可进一步采用大孔吸附树脂吸附层析、离子交换、葡聚糖凝胶层析等。如果有必要进一步精制时，可重复采用上述方法以制得高纯度的本发明化合物。本发明化合物可以游离的形式得到分离，也可以药学上可接受的盐的形式(如盐酸盐、硫酸盐、其它无机酸盐或有机酸盐，尤其是盐酸盐的形式)得到分离。如果需要，可以用本领域常规方法将本发明化合物的盐的形式转化成游离形式，或将游离形式转化成药学上可接受的盐如盐酸盐、硫酸盐、其它无机酸盐或有机酸盐中的一种。

含铜品的脱铜方法可以是八羟基喹啉法、H₂S法、Na₂S法、二苯磺卡贝松法、EDTA法。

对分离、提取及精制过程中本发明化合物的确认，可使用本本发明化合物对其有抑制作用的微生物，如枯草杆菌(Bacillus subtilis)的生物检测法或凝胶法或高效液相法，二者或三者并用更好。本发明所用的微生物发酵方法采用本领域熟知的轮枝链霉菌发酵条件，工艺简单。

本发明所述的化合物及其在药学上可接受的盐具有较好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。

在本发明制备式I化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。

本发明的式I化合物可以与其它活性成分组合使用，只要它不产生其他不利作用，例如过敏反应。

本发明式I所示的活性化合物可作为唯一的抗肿瘤药物使用，或者可以与一种或多种其他抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。

本文所用的术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。在本发明中，术语“组合物”可以与“药物组合物”互换使用。

本发明的化合物可以以衍生自无机酸或有机酸的药学可接受的盐的形式使用。词语“药学可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge，et al.，J.Pharmaceutical Sciences，1977，66：1中对药学可接受的盐进行了详细描述。所述盐可通过使本发明化合物的游离碱官能度与合适的有机酸反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备或者单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(异硫代硫酸盐，isothionate)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。同样，碱性含氮基团可用以下物质季铵化：低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物如苄基溴和苯乙基溴及其他。因此得到可溶于或分散于水或油的产品。可用来形成药学可接受的酸加成盐的酸实例包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。

本发明式I化合物还包括其异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物、和酯，本发明式I化合物以及它的异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物、和酯还可以形成溶剂合物，例如水合物、醇合物等。上述化合物还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术。一般来说，对于本发明的目的，与药学可接受的溶剂如水、乙醇等的溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。

可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

当用于上述治疗和/或预防或其他治疗和/或预防时，治疗和/或预防有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语“治疗和/或预防有效量”的本发明化合物指以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明式I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001～1000mg/kg体重/天，例如介于0.01～100mg/kg体重/天，例如介于0.01～10mg/kg体重/天。

运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明化合物的药物组合物。因此本发明还提供包含与一种或多种无毒药物可接受载体配制在一起的本发明化合物的药物组合物。所述药物组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服给药、供胃肠外注射或供直肠给药。

所述的药物组合物可配制成许多剂型，便于给药，例如，口服制剂(如片剂、胶囊剂、溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射水可立即使用)。所述的药物组合物中载体包括：口服制剂使用的粘合剂(如淀粉，通常是玉米、小麦或米淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)，稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素，和/或甘油)，润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，通常是硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，还含有崩解剂，如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐，通常是藻酸钠，和/或泡腾混合物，助溶剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等，可注射的制剂使用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可以将其配制成肠衣片剂。

更具体地说，本发明的药物组合物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本文所用术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给药方式。

适合于胃肠外注射的组合物可包括生理上可接受的无菌含水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂，及供重构成无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌散剂。合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯如油酸乙酯及它们的合适混合物。

这些组合物也可含有辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，可确保防止微生物的作用。还期望包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，可达到可注射药物形式的延长吸收。

混悬剂中除活性化合物外还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或者这些物质的混合物等。

在一些情况下，为延长药物的作用，期望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬剂来实现。这样，药物的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速度又可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外给药的药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解于或悬浮于油媒介物中来实现。

可注射贮库制剂形式可通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯(polylactide-polyglycolide)中形成药物的微胶囊基质来制备。可根据药物与聚合物之比和所采用的具体聚合物的性质，对药物释放速度加以控制。其他生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯类(poly(orthoesters))和聚酐类(poly(anhydrides))。可注射贮库制剂也可通过将药物包埋于能与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

可注射制剂可例如通过用滤菌器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述固体组合物可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质。

本发明化合物或其组合物可用口服方法或非胃肠道给药方式。口服给药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，肠道外用药制剂有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟悉的方法制备的。为了制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的辅料，例如淀粉、明胶、阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂如水、乙醇、丙二醇、植物油(如玉米油、花生油、橄榄油等)。含有本发明化合物的制剂中还有其它辅料，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂和色素等。在片剂、胶囊剂、包衣剂、注射剂和栓剂中含有本发明式I化合物的剂量是以单元剂型中存在的化合物量计算的。在单元剂型中本发明式I化合物一般含量为0.01-5000mg，优选的单元剂型含有0.1-500mg，更优选的单元剂型含有1-300mg。具体地说，本发明可以提供的供口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的药物可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物使用赋形剂例如乳糖及高分子量聚乙二醇等，也可用作软胶囊和硬胶囊中的填充物。

片剂、糖衣丸剂(dragees)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可与包衣和壳料如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其他衣材一起制备。这些固体剂型可任选含有遮光剂，且其组成还可使其只是或优先地在肠道的某个部位任选以延迟方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括高分子物质和蜡类。如果适合，活性化合物也可与一种或多种上述赋形剂配成微囊形式。

供口服给药的液体剂型包括药学可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性化合物外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇(tetrahydrofurfuryl alcohol)、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。口服组合物除包含惰性稀释剂外还可包含辅料，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂。

供直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂。栓剂可通过将本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，它们在室温下为固体，但在体温下则为液体，因此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。

本发明的化合物及其组合物还考虑用于局部给药。供局部给予本发明化合物的剂量形式包括散剂、喷雾剂、软膏剂和吸入剂。在无菌条件下将活性化合物与药学可接受的载体和任何所需的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被考虑在本发明范围内。

本发明化合物也可以脂质体形式给药。如本领域所公知，脂质体通常用磷脂或其他脂类物质制得。脂质体由分散于含水介质中的单层或多层水化液晶所形成。任何能够形成脂质体的无毒、生理上可接受和可代谢的脂质均可使用。脂质体形式的本发明组合物除含有本发明化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，它们可单独或者一起使用。形成脂质体的方法是本领域公知的。参见例如Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，p.33。

附图说明

图1为本发明所述化合物NC1101的含铜品的ESI-MS图谱，图中纵坐标“Relative Abundance”表示相对丰度；

图2为本发明所述化合物NC1101的¹³C-NMR谱；

图3为本发明所述化合物NC1101的DEPT谱；

图4为本发明所述化合物NC1101的HMQC谱；

图5为本发明所述化合物NC1101的HMBC谱。

具体实施方式

下面通过具体的制备实施例和生物学试验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和试验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

实施例1、发酵

由葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl 0.5％、琼脂2.0％(pH7.2-7.5)组成的斜面培养基，120℃下灭菌30分钟，制成斜面，置于37℃恒温3天。至表面水分稍干，无杂菌生长时，接种本发明轮枝链霉菌平阳新种，28℃培养7天，外观为白色，气生菌丝丰满呈绒毛状，无染菌时即可收取使用。在多个500ml玻璃瓶中分别装入100ml培养基(培养基成分：淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆饼粉3.5％、KH₂PO₄0.1％、ZnSO₄0.05％、CuSO₄0.01％、pH自然)。加棉塞，与120℃下灭菌30分钟、由斜面挖块接种。28℃在旋转摇床旋转培养48小时后，作为种子。

然后将与种子培养基相同成分的发酵培养基(pH自然)，在500ml的三角瓶中分装100ml，灭菌后加入2％上述培养的种子，29℃旋转培养7天，收取发酵液。

实施例2、NC1101的分离纯化

将实施例1的发酵培养液(100升)用草酸溶液调pH2，过滤，滤液通过122[H⁺]阳离子交换树脂(2升)吸附，后用0.3mol/L HCl洗脱，活性部分调pH至7.0，并加适量CuSO4溶液使其与Cu⁺充分螯合，后用大孔吸附树脂进行脱盐，用含0.01M HCl的20％丙酮溶液洗脱，收集洗脱液并除去丙酮后进行CM-Sephadex C-25[NH4⁺]柱层析，用0.1～1M的NH4Cl梯度洗脱，分离得到NC1101含铜品洗脱液，再经过大孔吸附树脂脱盐，脱盐后的洗脱液经真空浓缩及冷冻干燥即可得到蓝色的NC1101含铜品纯品粉末(0.06g)，将该粉末于酸性甲醇(pH2)中，用二苯磺卡贝松进行脱铜处理，再经丙酮沉淀，将此沉淀溶于水后再进行真空浓缩及冷冻干燥，即可得到NC1101盐酸盐纯品(0.05g)。

实施例3、理化性质及结构鉴定

对实施例1所得NC1101纯品进行测定。

NC1101为白色粉末，无一定熔点，易溶于水、甲醇，不溶于丙酮等低极性溶剂。

胍基反应呈阴性，说明其不含有胍基，可能为博来霉素A族类化合物。

茚三酮反应并不典型。

NC1101的含铜品水溶液紫外光谱具有典型的博来霉素族的紫外吸收特征，243～245nm、292～295nm两个最大吸收，比例为1.23。

观察NC1101含铜品的ESI-MS图谱(见图1)可以发现784.83[M+Cu]²⁺和523.67[M+Cu+H]³⁺分别为NC1101含铜品的双电荷和三电荷分子离子峰，计算出其分子量为1507，m/z为682.42[M+Cu-氨甲酰基甘露糖基(Carbamylmannosyl)+H]²⁺和602.25[M+Cu-氨甲酰基甘露糖基(Carbamylmannosyl)-古洛糖基(Gulosyl)+H]²⁺分别是NC1101脱掉一个糖和两个糖形成的碎片双电荷峰，计算所得的分子量差值与博来霉素族化合物特征的氨甲酰基甘露糖和古洛糖相同。

根据¹³C-NMR谱(见图2)，将NC1101的¹³C-NMR信号与本发明人研究组之前报道(Chen Caixia，Si Shuyi，He Qiyang，et al.Isolation and characterization of antibiotic NC0604，a new analogue of bleomycin[J].J Antibiot，2008，61(12)：747)的博来霉素族化合物NC0604的¹³C-NMR信号进行比对(表1)，并结合NC1101的¹H-¹H COSY、HMBC、HMQC、DEPT谱分析发现，NC1101具有与NC0604相同的博来霉素族母核，两者仅在末端胺体(R)有所区别，我们将NC1101的母核¹³C-NMR信号按照博来霉素族惯用的编号进行了归属，除去母核的碳氢信号，以剩余的信号可以解析出末端胺体(R)的化学结构。

DEPT谱(见图3)表明剩余的11个碳信号除δ_C155.2为-CH-外，剩余的其他10个碳信号均为-CH₂-，结合¹H-NMR和¹H-¹H COSY表明，末端胺体的十个-CH₂-质子信号为，R-a(δ_H3.56)，R-b(δ_H2.07)，R-c(δ_H3.17)，R-d(δ_H3.13)，R-e(δ_H1.74)，R-f(δ_H1.79)，R-g(δ_H3.51)，R-h(δ_H3.47)，R-i(δ_H2.06)，R-j(δ_H3.37)，一个-CH-信号为R-CH(δ_H7.95)，从NC1101的分子量中扣除博来霉素母核还剩下211个质量数未分配，再除去这十一个信号，还剩下58个质量数未分配，并从质子的化学位移可以判断出，连接这些碳信号的杂原子只可能是NH，NH，N，N。

HMQC谱(见图4)中，R-a(δ_H3.56)与δ_C39.2处信号相关，R-b(δ_H2.07)与δ_C28.7对应，R-c(δ_H3.17)与δ_C48.1相关，R-d(δ_H3.13)与δ_C50.0相关，R-e(δ_H1.74)与δ_C25.4相关，R-f(δ_H1.79)与δ_C26.8相关，R-g(δ_H3.51)与δ_C57.0相关，R-h(δ_H3.47)与δ_C46.2相关，R-i(δ_H2.06)与δ_C20.9相关，R-j(δ_H3.37)与δ_C39.9相关，R-CH(δ_H7.95)与δ_C155.2相关。

HMBC谱(见图5)中，δ_C39.2(R-a)与δ_H2.07(R-b)和δ_H3.17(R-c)相关；δ_C28.7(R-b)与δ_H3.56(R-a)和δ_H3.17(R-c)相关；δ_C48.1(R-c)与δ_H3.56(R-a)，δ_H2.07(R-b)和δ_H3.13(R-d)相关；δ_C50.0(R-d)和δ_H3.17(R-c)相关；δ_C25.4(R-e)与δ_H3.13(R-d)，δ_H1.79(R-f)和δ_H3.51(R-g)相关；δ_C26.8(R-f)与δ_H3.13(R-d)，δ_H1.74(R-e)和δ_H3.51(R-g)相关；δ_C57.0(R-g)与δ_H1.79(R-f)和δ_H3.47(R-h)相关；δ_C46.2(R-h)和δ_H3.51(R-g)，δ_H2.06(R-i)和δ_H3.37(R-j)相关；δ_C20.9(R-i)与δ_H3.47(R-h)和δ_H3.37(R-j)相关；δ_C39.9(R-j)与δ_H3.47(R-h)和δ_H2.06(R-i)相关；R-a(δ_H3.56)与δ_C166.4(VI-CO)相关。另外，由δ_C57.0(R-g)、δ_C46.2(R-h)、δ_C39.9(R-j)同时与δ_H7.95(R-CH)相关，可以确定在这几个原子附近有环状结构存在。根据HMBC的结果最终得出末端胺体(R)的原子排列及HMBC偶合情况，示意如下：

表1、NC1101各基团部分的¹³C-NMR峰归属(ppm，600MHz，D₂O)

实施例4、抗肿瘤活性

对实施例1所得NC1101纯品进行测定，同时使用阳性对照药物博来霉素(BLM，市售品 )。

采用MTT法(例如，参见：Tim Mosmann.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays.Journal of Immunological Methods.1983，65：55-63)测定了NC1101对多药耐药人乳腺癌细胞MCF7/DOX、肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa、人结肠癌细胞HCT116的生长抑制作用，结果如表2。NC1101对所测的四株细胞均表现出了较强的生长抑制活性，并且均优于阳性对照药。

表2、NC1101的抗肿瘤活性(IC50，μM)

从以上结果可见，本发明化合物相对于现有产品显示出明显更优的抗肿瘤活性。

新型博来霉素类似物及其制备方法和用途专利购买费用说明

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A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

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