专利摘要

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法：首先以N,N‑双(丙烯酰基)胱胺和含疏水基团的氨基酸通过迈克尔加成方法进行共加聚反应，再经过酯化和酰肼化反应，合成得到三元共聚物，最后在选择性溶剂中通过自组装形成聚两性离子纳米胶束。由于共聚物链段中含有双硫键和两性离子，因而纳米胶束具有还原敏感性，以及优异的抗蛋白质非特异性吸附性能；该纳米胶束可共价负载阿霉素药物。本发明的纳米胶束生物相容性好，可在体内完全降解，有望用作抗癌药物载体。

权利要求

1.一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，依次包括以下步骤：

1)将赖氨酸、N,N-双(丙烯酰基)胱胺和含疏水基团的氨基酸三种单体在碱催化下，在水与极性有机溶剂的混合溶剂中通过迈克尔加成反应得到三元共聚物；

2)将此三元共聚物经过酯化、再与水合肼反应得到含酰肼基团的共聚物溶液；

3)共聚物溶液经过透析纯化、冷冻干燥后得到固体粉末，将粉末溶解在二甲亚砜中，持续搅拌下向三元共聚物溶液中缓慢滴加超纯水；

4)滴水结束后，搅拌一段时间将溶液转入透析袋中，透析处理得到纳米胶束。

2.根据权利要求1所述的一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，在所述步骤1)中，含疏水基团的氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和对羟基苯丙氨酸。

3.根据权利要求1所述的一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，在所述步骤1)中，N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸和含疏水基团的氨基酸三种单体的摩尔比为1:0.9:0.1、1:0.8:0.2、1:0.7:0.3、1:0.6:0.4、1:0.5:0.5、1:0.4:0.6、1:0.3:0.7、1:0.2:0.8或1:0.1:0.9。

4.根据权利要求1所述的一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，在所述步骤1)中，迈克尔加成反应所选溶剂为极性有机溶剂与去离子水的混合液，体积比为2:1，极性有机溶剂包括二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醇或甲醇。

5.根据权利要求1所述的一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，在所述步骤1)中，迈克尔加成所选催化剂为0.1Wt％氢氧化钠水溶液，调节pH在10.5～12.0范围内。

6.根据权利要求1所述的一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，在所述步骤2)中，酯化反应用甲醇为酯化试剂，以对甲基苯磺酸为催化剂，加热到60℃，反应4.5小时。

7.根据权利要求1所述的一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，在所述步骤2)中，水合肼的浓度为10Wt％,其摩尔数是赖氨酸与含疏水基团氨基酸的摩尔数之和的2～3倍，在65℃温度下回流反应8小时。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，根据世界卫生组织的报道，癌症是全球一个主要死亡原因。目前治疗癌症的方法主要包括外科手术切除、化学药物治疗(化疗)和辐射治疗。这些治疗手段都存在很大缺陷，例如药物产生毒副作用，损伤正常组织器官，对于患者而言都是极大的痛苦。

为了克服药物直接输送所带来的严重弊端，20世纪80年代兴起的纳米技术与聚合物材料的结合，产生了一系列新型的纳米给药系统：聚合物胶束、囊泡、脂质体以及微球，将药物物理包覆进载体或与载体化学结合，可有效降低药物对正常组织的毒副作用；通过赋予载体特殊的生理刺激响应性，可改善药物在体内的分布，直达组织病变区，并在病变区差异性的温度、pH以及氧化还原剂的作用下释放出药物，从而提高了药物的生物利用度。

以纳米粒子为基础的生物技术已经成为药物输送以及其他医学领域的发展前沿，但作为药物输送系统，目前一个很大的障碍是纳米粒子在体内的非特异性蛋白吸附，这会导致载体与血液蛋白相互作用导致聚集以及免疫反应，这些问题严重的限制了载药纳米粒子在临床上的应用。

为了保证纳米粒子的循环稳定性，PEG经常被用来修饰载体外层。PEG优越的亲水性能，可以减少蛋白吸附，避免载体被网状内皮系统清除。然而有相关报道指出，PEG在氧气和过渡金属离子存在下会发生自然氧化，即PEG末端的羟基在体内乙醇脱氢酶的作用下被氧化成醛基，从而使其失去抗蛋白吸附性能。此外，PEG自身的“隐身”屏蔽作用同样会使癌细胞对其识别困难，使癌细胞对载体的摄取率大大降低。

基于对细胞膜结构的仿生学研究，发现细胞膜表面磷酰胆碱的两性离子结构具有优异的抗蛋白吸附功效。常见的两性离子结构有羧基甜菜碱类(CBMA)、磺酸基甜菜碱类(SBMA)、磷酰胆碱类(MPC)以及氨基酸类，这些结构通过离子键作用形成致密的水合层，在抗蛋白吸附的同时，可稳定药物载体，因此两性离子聚合物可替代PEG用来修饰纳米粒子的表面。

谷胱甘肽(GSH)是一种含有巯基的三肽，是生物化学反应中一类重要的还原剂，能够还原双硫键。还原型谷胱甘肽在细胞质中较为丰富，浓度为1-10mM，但在血液中含量较少，一般浓度为2μΜ；较正常组织而言，GSH在肿瘤细胞中的浓度大约高达4～10倍。利用这一特点，可以设计含双硫键的药物载体，使其对于肿瘤细胞内的GSH产生响应，有目标的在细胞内释放抗癌药物。

聚两性离子纳米胶束负载药物时通常有两种方式：一是通过聚合物连段与药物分子的疏水相互作用；二是通过药物载体中的带电荷离子与药物中的异性离子相互作用。但是这两种方式容易带来药物泄露和难以条件控制释放问题。

发明内容

根据上述原因，本发明的目的是提供一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法。首先由N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸和其他疏水性氨基酸三种单体通过迈克尔加成合成三元共聚物，然后将共聚物中疏水性氨基酸的羧基经过甲酯化，再与水合肼反应得到聚(赖氨酸-co-N,N-双(丙烯酰基)胱胺-co-α-氨基苯丙酰肼)三元共聚物，最后在水溶液中通过自组装形成可共价载药的还原敏感性纳米胶束。

本发明中迈克尔加成反应所选溶剂除了水之外，还需加入可溶解疏水组分的极性有机溶剂，如二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲醇或乙醇等；反应温度控制在50℃左右，该温度有助于仲胺与双键反应，从而顺利形分子量较大的共聚物。三种单体单元在纳米胶束中具有各自的功能作用：1)N,N-双(丙烯酰基)胱胺分子中含有双硫键，使载体具有还原响应性，可在谷胱甘肽作用下断链，使载体遭到破坏；2)赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，分子中同时含有羧基和氨基，形成聚两性离子，赋予药物载体抗蛋白质非特异性吸附性能以及pH敏感性；3)氨基酸是人体内源性物质，其疏水性基团为聚合物的自组装和载药性能奠定基础；而氨基酸中的羧基经过甲酯化后可与水合肼反应生成酰肼，便于与阿霉素以腙键共价结合，在酸性条件下腙键断裂可控制药物释放。

本发明中合成的第一步是迈克尔加成共聚，采用的原料是N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸和疏水性氨基酸，为了得到高聚物，在加料时控制N,N-双(丙烯酰基)胱胺的摩尔数与氨基酸的摩尔数之和相等。

具体在所述合成步骤1)中，迈克尔加成反应所选溶剂为极性有机溶剂与去离子水的混合液，体积比为2:1，极性有机溶剂包括二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醇或甲醇；所选催化剂为0.1Wt％氢氧化钠水溶液，调节pH在10.5～12.0范围内，利于增加氨基的亲核性；

当迈克尔加成反应完成后，在所述合成步骤2)中，将氨基酸中的羧基甲酯化，以对甲基苯磺酸为催化剂，加热到60℃，反应4.5小时，然后酯键与水合肼反应生成酰肼结构；水合肼的浓度为10Wt％,其摩尔数是氨基酸摩尔数之和的2～3倍，在65℃温度下回流反应8小时。

本发明还提供一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束在制备药物载体中的应用方法，在DMF溶剂中，加入纳米胶束干粉与盐酸阿霉素，在三乙胺共存下，室温反应24小时；然后用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析，最后冷冻干燥。

利用N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸与疏水性氨基酸通过迈克尔加成得到的聚合物同时含有双硫键、氨基以及羧基等多功能响应性基团。在人体内，肿瘤组织与正常组织相比，温度、pH以及氧化还原环境等都有较大的差异，利用这些差异而设计的具有刺激响应性的纳米载体，可以实现药物在靶向部位的释放。在体内循环过程中，载体中的双硫键在细胞外低谷胱甘肽浓度(2μmol·L-1)下能够保持稳定，而一旦进入细胞内，高浓度谷胱甘肽(2～10mM)会使双硫键迅速破坏，促使药物从中释放出来；同时，肿瘤组织的pH(<6.5)比正常组织pH(≈7.4)低，而且肿瘤细胞内溶酶体和内涵体的pH在4.5～6，载体中的胺基在酸性条件下质子化会使载体发生溶胀，从而进一步破坏载体结构，将药物充分释放。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1.利用迈克尔加成合成聚合物，操作简便，反应条件温和，反应较为彻底，无其他副产物生成。

2.由于该聚合物链段中同时含有双硫键、氨基和羧基等结构单元，因而赋予了纳米胶束灵敏的pH和还原响应性，在肿瘤细胞内部弱酸性和还原性环境中，胶束结构被破坏，从而可顺利释放药物。

3.双硫键位于聚合物主链，在癌细胞内部高浓度谷胱甘肽作用下，双硫键的断裂会使整个聚合物降解，无大分子残留，在实际应用中可避免材料残留而引发的副作用。

4.聚合物中的氨基和羧基，不仅可以替代PEG作为稳定胶束的亲水部分，而且胶束表面的电荷赋予胶束优异的抗蛋白吸附功效，可延长载体体内循环时间。

5.含酰肼结构的纳米胶束容易与阿霉素共价结合，增加了载药稳定性和控制释放的可能性。

6.利用氨基酸以及生物碱为原料合成的聚合物，具有良好的生物相容性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1本发明中的纳米胶束负载阿霉素药物的结构示意图；

图2 N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸与苯丙氨酸以摩尔比为：1:0.9:0.1时合成的纳米胶束扫描电镜图；

图3本发明中纳米胶束在pH 7.4下的粒径分布，N1、N2、N3、N4摩尔比标示在表1；

图4本发明中纳米胶束在10mM谷胱甘肽溶液中不同时间下的粒径变化。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1)N,N-双(丙烯酰基)胱胺的合成：

在250mL三口烧瓶中，将5.630g胱胺二盐酸盐溶于25mL去离子水中，置于冰水浴中搅拌。称取4g氢氧化钠溶于10mL去离子水，将溶解好的氢氧化钠溶液加到滴液漏斗中；称取4.526g丙烯酰氯溶于5mL二氯甲烷，后置于恒压滴液漏斗中，将两种溶液同时逐滴滴加到胱胺二盐酸盐水溶液中，保持冰水浴搅拌5小时。反应结束后将溶液过滤，得到的白色固体用去离子水洗三次。然后将清洗后所得物质用乙酸乙酯重结晶，在30℃真空干燥箱中干燥24小时得到产物。

2)聚(赖氨酸-co-N,N-双(丙烯酰基)胱胺-co-α-氨基苯丙酰肼)三元共聚物的合成：

在50mL的三口烧瓶中，将N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸和苯丙氨酸按表1所示配方之一溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和2mL去离子水的混合溶液中，调节溶液的pH值为11，在氮气保护下48℃反应5天；在反应液中添加甲醇2.5mL和0.1g对甲基苯磺酸，加热到60℃，反应4.5小时。再用2wt％的氢氧化钠溶液将pH调节到7，将10W％的水合肼溶液1.5mL添加到上述溶液中，在65℃温度下回流反应8小时。

反应结束后将溶液转入截留分子量为3500的透析袋中，在甲醇和水(V:V＝2:1)的混合透析外液中透析3天，冷冻干燥得到淡黄色粉末产物。N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸和苯丙氨酸在混合溶液中的投料比如表1所示，本发明提供4种三元共聚物合成配方，可根据应用需要，通过三种单体的配比不同调节纳米胶束粒径。

表1迈克尔加成反应合成配方一览表

3)纳米胶束的制备:

将10mg聚(赖氨酸-co-N,N-双(丙烯酰基)胱胺-co-α-氨基苯丙酰肼)三元共聚物溶于1mL二甲基亚砜中，在持续搅拌的过程中向溶液中缓慢滴加8mL超纯水。滴加结束后，溶液继续搅拌3小时，随后将溶液转入截留分子量为3500的透析袋中，透析24小时得到纳米胶束。由扫描电镜图可见，该纳米胶束呈现规整的球形形貌，粒径分布比较均一。

根据应用需要不同的纳米胶束尺寸，可以调节三种单体的配比，以得到不同粒径的纳米胶束。

实施例2

同实施例1，但是用色氨酸代替苯丙氨酸，其余反应条件如同实施例1。

实施例3

同实施例1，但是用甲硫氨酸代替苯丙氨酸，其余反应条件如同实施例1。

实施例4

同实施例1，但是用亮氨酸代替苯丙氨酸，其余反应条件如同实施例1。

实施例5

同实施例1，但是用对羟基苯丙氨酸代替苯丙氨酸，其余反应条件如同实施例1。

实施例6

纳米胶束临界胶束浓度(CMC)的测量：

将实施例1中所得纳米胶束溶液稀释成一系列不同浓度，取不同浓度聚合物的纳米胶束溶液4mL，分别加入30μL浓度为1.622×10-5g/mL芘的丙酮溶液，避光放于25℃氮气氛围的恒温震荡箱中，孵育一段时间，待丙酮全部挥发完，用荧光分光光度计测定发射光谱，设定荧光激发波长λ＝333nm，扫描范围λ＝350～500nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，样品池厚1cm。通过测定一系列不同浓度纳米粒子溶液在373nm和383nm(即I1、I3)的荧光强度，并以浓度对数为X轴，I1/I3为Y轴作图，由曲线的突变点求出聚合物纳米胶束的CMC值。结果显示：四种配方的纳米胶束均有较小的CMC值，分别为22.5mg/L、27.3mg/L、33.7mg/L、39.3mg/L，具有较强的抗稀释稳定性。

实施例7

纳米胶束的pH敏感性：

将实施例1中所得纳米胶束置于pH分别为7.4、6.5和5.0的PBS缓冲溶液中，由动态激光光散射系统检测胶束粒径随时间的变化，结果显示胶束具有一定pH敏感性，随着酸性的增强粒径增大。

实施例8

纳米胶束的还原敏感性：

将实施例1中所得纳米胶束置于浓度为10mM谷胱甘肽溶液中，在不同时间用激光光散射仪测试纳米胶束的粒径变化，观察还原响应性。在10mM谷胱甘肽溶液中，12小时后粒径增加，说明位于主链中的双硫键在谷胱甘肽作用下断裂之后，疏水部分会重新组装，随着时间的增加，聚集体的体积增加，导致粒径增加。

实施例9

纳米胶束的抗蛋白非特异性吸附性能：

将实施例1中所得纳米胶束与含有10％胎牛血清的RPMI-1640的培养基混合，或者与4.5wt％、pH 7.4的BSA溶液混合。上述混合溶液在37℃下孵育24h，利用激光光散射仪来检测纳米胶束的粒径变化，观察胶束抗蛋白质非特异性吸附性能。结果显示：纳米胶束溶液在与不同蛋白质接触24小时后，粒径没有明显改变，与其在无蛋白质的缓冲溶液中一样，没有聚集或崩解现象，此结果说明纳米胶束与蛋白质之间无相互吸附作用，可在人体内实现较长时间的循环。

实施例10

纳米胶束的生物相容性：

以实施例1中所得纳米胶束N4为研究对象。采用MTT法对纳米胶束的细胞毒性进行测试，取对数期生长的子宫颈癌细胞(Hela细胞)或小鼠成纤维细胞(3T3细胞)，经0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基对细胞进行吹打，后用培养基将细胞稀释成浓度为1.2×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μL，置于恒温培养箱中培养24h后弃去培养基，实验组分别加入100μL含聚合物浓度梯度为0、80、160、240、320μg/mL的RPMI-1640完全培养基，每组设4个复孔，继续置于恒温培养箱中培养48h，培养结束后每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，继续培养4h后，弃去培养板中的溶液，每孔加入150μLDMSO，震荡摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光度，并计算细胞存活率。结果显示：3T3和Hela两种细胞在不同浓度的纳米胶束溶液中的细胞存活率在96％～100％之间，结合表2可知，纳米胶束的细胞毒性等级为1级，对细胞生长无影响，因而具有良好的生物相容性。

表2细胞相对增值率与细胞毒性的关系

实施例11

载药纳米胶束的制备：

在25毫升小锥形瓶中，加入8毫升DMF溶剂，添加200毫克纳米胶束干粉和50毫克盐酸阿霉素，添加0.5毫升三乙胺，室温反应24小时；将反应液转入截留分子量为3500的透析袋，以去离子水为透析介质，室温下透析3天，每8小时更换透析介质，最后冷冻干燥得到载药纳米胶束。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。