专利摘要

专利摘要

本发明公开3个核糖体因子基因及其突变基因以及在制备维生素B12中的应用。在苜蓿中华根瘤菌中过表达所述基因，可以有效提高维生素B12的产量，具有较大的应用推广价值，并且对于研究产维生素B12菌种的基因调控也有重要意义。

权利要求

1.一种核糖体结合因子A的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQ ID No.2所示的基础上，第70位氨基酸替换为H。

2.一种核糖体翻译延伸因子Ts的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQ ID No.4所示的基础上，第211位氨基酸替换为L。

3.一种核糖体翻译延伸因子NusA的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQ ID No.6所示的基础上，第173位氨基酸替换为S。

4.如权利要求1至3任一项所述的突变体的编码基因。

5.核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts或核糖体翻译延伸因子NusA编码基因在制备维生素B₁₂中的应用，其中，所述核糖体结合因子A编码基因编码具有如SEQ ID No.2、或SEQ ID No.34所示氨基酸序列的多肽；所述核糖体翻译延伸因子Ts编码基因编码具有如SEQ ID No.4、或SEQ ID No.36所示氨基酸序列的多肽；所述或核糖体翻译延伸因子NusA编码基因编码具有如SEQ ID No.6、或SEQ ID No.38所示氨基酸序列的多肽。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.33、SEQ ID No.3、SEQ ID No.35、SEQ ID No.5、或SEQ ID No.37所示。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。

8.如权利要求7所述的应用，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及核糖体因子的突变体, 以及所述核糖体因子和其突变体在制备维生素B₁₂中的应用。

背景技术

维生素 B₁₂ (VB₁₂)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基（R基团）种类不同，维生素B₁₂可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B₁₂参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素B₁₂分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B₁₂的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素B₁₂生产菌生物合成维生素B₁₂的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb 基因来增加细胞生产维生素B₁₂的能力（程立芳等, 不同来源的尿卟啉原 III转甲基酶在脱氮假单胞菌 中的表达及其对生产维生素 B12 的影响. 工业微生物，2017，第 47 卷 第 3期）。

转录延伸因子是能够使基因转录不断进行的因子，如激活RNA聚合酶活性的蛋白质。核糖体循环因子RRF由frr编码，其在核糖体循环利用方面有重要作用。在Streptomycescoelicolor中过量表达RRF可以增强生长后期的蛋白合成，进而过量生产天然产物（HosakaT, Xu J, Ochi K (2006) Increased expression of ribosome recycling factor isresponsible for the enhanced protein synthesis during the late growth phasein an antibiotic-overproducing Streptomyces coelicolor ribosomal rpsL mutant.Mol Microbiol 61(4):883–897）。在Streptomyces avermitilis中过表达frr会增加阿维菌素的产量(.Li L, Guo J, Wen Y, Chen Z, Song Y, Li J (2010) Overexpression ofribosome recycling factor causes increased production of avermectin inStreptomyces avermitilis strains. J Ind Microbiol Biotechnol 37(7):673–679)，在Streptomyces diastatochromogenes 中过表达frr会增加丰加霉素的产量(Ma Z, TaoL, Bechthold A, Shentu X, Bian Y, Yu X (2014) Overexpression of ribosomerecycling factor is responsible for improvement of nucleotide antibiotic-toyocamycin in Streptomyces diastatochromogenes 1628. Appl MicrobiolBiotechnol 98(11): 5051–5058)。在Corynebacterium glutamicum中过表达fusA（编码核糖体延伸因子G）和/或frr 会增加异亮氨酸的产量(Zhao J1, Hu X, Li Y, Wang X（2015），Overexpression of ribosome elongation factor G and recycling factorincreases L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum. ApplMicrobiol Biotechnol. 99(11):4795-805.)。然而，影响维生素B₁₂产量的核糖体因子尚未见到报道。

发明内容

本发明人前期筛选出了一株高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），可发酵生产维生素B₁₂。通过对其进行诱变，获得产维生素B₁₂能力提高的诱变菌株，发明人对其核糖体因子进行了挖掘分析，包括9个不同的核糖体因子，通过对其评价，发现在苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中过表达核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts或核糖体翻译延伸因子NusA可以提高维生素B₁₂的产量。经进一步研究，最终完成本发明，而提供三个核糖体因子和其突变体，及其在产维生素B₁₂中的应用。

首先本发明提供一种核糖体结合因子A的突变体，其氨基酸序列在SEQ ID No.2所示的基础上，第70位氨基酸替换为H。具体地，其氨基酸序列如SEQ ID No.34所示。

本发明还提供一种核糖体翻译延伸因子Ts的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQ ID No.4所示的基础上，第211位氨基酸替换为L。具体地，其氨基酸序列如SEQ IDNo.36所示。

本发明还提供一种核糖体翻译延伸因子NusA的突变体，其氨基酸序列在SEQ IDNo.6所示的基础上，第173位氨基酸替换为S。具体地，其氨基酸序列如SEQ ID No.38所示。

其次，本发明提供如上述的突变体的编码基因，具体地核糖体结合因子A编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；核糖体翻译延伸因子Ts编码基因核苷酸序列如SEQ IDNo.35所示；核糖体转录延伸因子NusA编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.37所示。

第三方面，本发明提供核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts或核糖体翻译延伸因子NusA的编码基因在制备产维生素B₁₂中的应用。所述核糖体结合因子A编码基因编码具有如SEQ ID No.2、或SEQ ID No.34所示氨基酸序列的多肽；所述核糖体翻译延伸因子Ts编码基因编码具有如SEQ ID No.4、或SEQ ID No.36所示氨基酸序列的多肽；所述或核糖体翻译延伸因子NusA编码基因编码具有如SEQ ID No.4、或SEQ ID No.36所示氨基酸序列的多肽。

在一个具体实施方式中，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。进一步地，该基因或突变基因位于质粒或染色体中。

优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。

通过对6个核糖体因子的筛选研究，表明其中核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts和核糖体翻译延伸因子NusA 及其突变体基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，不仅对基因工程菌生物安全（在菌内过表达未对菌体的生长造成影响），同时可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B₁₂的能力。实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts和核糖体翻译延伸因子NusA编码过表达提高苜蓿中华根瘤菌产维生素B₁₂的能力，尤其是它们的突变体基因过表达能更进一步提高产维生素B₁₂的能力。而过表达其他三种核糖体因子（frr，ysxC，greA）时，生产维生素B₁₂的能力有不同程度的降低。

附图说明

图1：质粒载体pBBR-P21-rbfA的图谱。

图2：质粒载体pBBR-P21-tsf的图谱。

图3：质粒载体pBBR-P21-nusA的图谱。

图4：质粒载体pBBR-P21-frr的图谱。

图5：质粒载体pBBR-P21-ysxC的图谱。

图6：质粒载体pBBR-P21-greA的图谱。

图7：维生素B₁₂的标准曲线图。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

培养基配方：

LB 培养基（g/L）：氯化钠 10 ，胰蛋白胨10 ，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。

种子培养基（g/L）：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH₄)₂SO₄ 1，(NH₄)₂HPO₄ 2，MnSO₄·H₂O 0.8，CoCl₂·6H₂O 0.02，MgO 0.3，DMBI 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.01，CaCO₃ 1.5,pH通过NaOH控制在7.0～7.4。

发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH₄)₂SO₄ 2，MgSO₄1.5, K₂HPO₄0.75，CoCl₂·6H₂O 0.14, DMBI 0.075，ZnSO₄·7H₂O 0.08，CaCO₃ 1，pH通过NaOH控制在7.0～7.4。

检测方法

(1) 样品预处理

取1 mL发酵液，加入8%的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40 min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜(⌀= 0.22µm)过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl 2%的NaCN (w / v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。

（2）标准品的制备

配置梯度维生素B₁₂标准品(20 mg/L，50 mg/L，100mg/L，150 mg/L)。

（3）HPLC检测条件

C18-250A柱（Agilent，4.6 mmid 9×250 mm，5µm）。流动相为70%有机相（乙腈）和 30%无机相（乙酸钠水溶液），吸收波长为361 nm，柱温为35℃，流速0.8 mL/min，进样量20 µL。

（4）维生素B₁₂标准曲线的绘制

将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB₁₂浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B₁₂质量浓度C（mg/L）记为横坐标，绘制维生素B₁₂标准曲线。见图7，得回归方程y=19.846x-80.857，R²=0. 999，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素B₁₂标准曲线计算样品产量。

实施例1：常压室温等离子体（ARTP）诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得

（1）致死率的测定

为了获得一个比较广的突变体库，我们对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638进行了常压室温等离子体（ARTP）诱变。首先，对等离子诱变条件下CGMCCNO.9638的致死率进行测定。将种子用LB培养基培养至对数中期的CGMCCNO.9638细胞(OD₆₀₀=1) 用0.85% NaCl溶液冲洗两遍，然后用0.85% NaCl溶液稀释成10⁸个细胞/mL的悬液。取10uL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0 s、5 s、10 s、15 s、20 s、25 s，每个诱变时间点2个重复，每个时间点的涂板3个重复。诱变后将带有细胞的铁片置于1 mL无菌水中漩涡震荡洗下细胞，将细胞悬液10倍梯度稀释至10^-3，取稀释后的细胞悬液100 μL涂LB培养基平板，30℃培养72 h后统计菌落数。根据下列公式计算不同诱变时间下的致死率，以诱变时间为横坐标，不同诱变时间下的致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率的计算公式为：致死率(％)＝[(诱变0s菌落数－诱变Ns菌落数)/诱变0s菌落数]×100％，其中N=5、10、15、20、25。

从表1中可知，诱变10s时的致死率为82.2％，诱变15s时的致死率达到95％以上，致死率为80％-90％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择10s作为最终构建突变体库的诱变时间。

（2）突变体库的构建及筛选

取浓度为10⁸个/mL的细胞悬液10 uL涂布于铁片上进行ARTP诱变，诱变时间为10 s，共对3个铁片上的细胞进行诱变处理，诱变结束后，将这3个铁片上的细胞在含有1mL LB培养基的1.5 mL离心管中涡旋振荡重悬。将细胞悬液10倍梯度稀释至10^-3，取稀释后的细胞悬液100 μL涂LB培养基平板，30℃培养72h，长出270个单菌落。

（3）突变株96深孔板发酵初筛

分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500uL的种子培养基的96深孔板中（每个孔板上包含6株对照菌株CGMCC NO.9638），30℃、800rpm、80%湿度振荡培养36h后，按10%（v/v）接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80%湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

（4）突变株96深孔板发酵复筛

将步骤（3）中产量排前30的株菌的单菌落（包含一个对照菌株CGMCC NO.9638）接种于含有500uL种子培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80%湿度振荡培养36h后，按10%（v/v）接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中（每株菌3个平行），30℃、800rpm、80%湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

重复步骤（3）和（4）三次，最后获得一株高产维生素B₁₂的菌种SM*，96孔板中产量从50 mg/L提高到80 mg/L，是底盘菌株产量的1.6倍。

实施例2：突变菌株与出发菌株进行比较基因组分析

将菌种SM*和出发菌株CGMCC NO.9638送金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序。通过比较两个菌株的全基因组序列发现有3个核糖体因子发生了点突变，见表2。为了验证突变位点对维生素B₁₂产量的影响，我们将突变后的转录调控因子基因在出发菌种CGMCCNO.9638中进行了过量表达。同时，根据文献报道和基因组数据选取了其他3种未发生突变的核糖体因子编码基因（frr，ysxC，greA）进行验证。

实施例3：质粒载体的构建

1、pBBR-P21-rbfA的构建：

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R1，以Ensifer adhaerens Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-1片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-1片段。P21启动子序列如SEQ ID No.7所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。

分别利用表3的引物对rbfA-F和rbfA-EcoRI-R，以苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638基因组为模板，通过PCR 扩增，引入EcoRI酶切位点，得到rbfA片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的rbfA片段。rbfA基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和rbfA-EcoRI-R，以纯化的P21-1片段和rbfA片段为模板，通过融合PCR，得到P21-rbfA片段（含XbaI和EcoRI酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-rbfA片段。

将上述纯化的P21-rbfA片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和EcoRI进行双酶切，将P21-rbfA片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-rbfA。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-rbfA备用，质粒图谱如图1所示。

、pBBR-P21-rbfA (T208C)

以菌种SM*基因组为模板用于获得rbfA（T208C）片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示），按照pBBR-P21-rbfA的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pBBR-P21-rbfA（T208C）。

、pBBR-P21-tsf的构建：

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R2，以苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-2片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-2片段。

分别利用表3的引物对tsf-F和tsf-EcoRI-R，以苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638基因组为模板，通过PCR 扩增，引入EcoRI酶切位点，得到tsf片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的tsf片段。tsf基因序列如SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和tsf-EcoRI-R，以纯化的P21-2片段和tsf片段为模板，通过融合PCR，得到P21-tsf片段（含XbaI和EcoRI酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-tsf片段。

将上述纯化的P21-tsf片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和EcoRI进行双酶切，将P21-tsf片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-tsf。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-tsf备用，质粒图谱如图2所示。

、pBBR-P21-tsf (T631C)

以菌种SM*基因组为模板用于获得tsf (T631C)片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示），按照pBBR-P21-tsf的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pBBR-P21- tsf (T631C)。

、pBBR-P21-nusA的构建：

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R3，以Ensifer adhaerens Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-3片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-3片段。

分别利用表3的引物对nusA -F和nusA-HindIII-R，以苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638基因组为模板，通过PCR 扩增，引入HindIII酶切位点，得到nusA片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的nusA片段。nusA基因序列如SEQ ID No.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和nusA-HindIII-R，以纯化的P21-3片段和nusA片段为模板，通过融合PCR，得到P21-nusA片段（含XbaI和HindIII酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-nusA片段。

将上述纯化的P21-nusA片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和HindIII进行双酶切，将P21-nusA片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-nusA。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-nusA备用，质粒图谱如图3所示。

、pBBR-P21-nusA (C517T)

以菌种SM*基因组为模板用于获得nusA (C517T)片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：37所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示），按照pBBR-P21-nusA的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pBBR-P21- nusA (C517T)。

、pBBR-P21-frr

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R4，以Ensifer adhaerens Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-4片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-4片段。

分别利用表3的引物对frr -F和frr-HindIII-R，以苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638基因组为模板，通过PCR 扩增，引入HindIII酶切位点，得到frr片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的frr片段。frr基因序列如SEQ ID No.8所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和frr-HindIII-R，以纯化的P21-4片段和frr片段为模板，通过融合PCR，得到P21-frr片段（含XbaI和HindIII酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-frr片段。

将上述纯化的P21-frr片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和HindIII进行双酶切，将P21-frr片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-frr。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-frr备用，质粒图谱如图4所示。

、pBBR-P21-ysxC

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R5，以Ensifer adhaerens Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-5片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-5片段。

分别利用表3的引物对ysxC -F和ysxC-HindIII-R，以苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638基因组为模板，通过PCR 扩增，引入HindIII酶切位点，得到ysxC片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的ysxC片段。ysxC基因序列如SEQ ID No.10所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和ysxC-HindIII-R，以纯化的P21-5片段和ysxC片段为模板，通过融合PCR，得到P21-ysxC片段（含XbaI和HindIII酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-ysxC片段。

将上述纯化的P21-ysxC片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和HindIII进行双酶切，将P21-ysxC片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-ysxC。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-ysxC备用，质粒图谱如图5所示。

、pBBR-P21-greA

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R6，以Ensifer adhaerens Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-6片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-6片段。

分别利用表3的引物对greA -F和greA-HindIII-R，以苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638基因组为模板，通过PCR 扩增，引入HindIII酶切位点，得到greA片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的greA片段。greA基因序列如SEQ ID No.12所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和greA-HindIII-R，以纯化的P21-6片段和greA片段为模板，通过融合PCR，得到P21-greA片段（含XbaI和HindIII酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-greA片段。

将上述纯化的P21-greA片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和HindIII进行双酶切，将P21-greA片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-greA。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-greA备用，质粒图谱如图6所示。

实施例4：含质粒载体菌株的构建

将实施例3中的10个质粒按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中：

（1）接种新活化的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638、大肠杆菌（含有相应的质粒）以及辅助载体MT616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到OD值为1.0左右；

（2）无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638的菌液、MT616和大肠杆菌的菌液各500 μL转移至1.5mL无菌EP管中并在4 ℃，12,000 rpm条件下离心1 min。

（3）在无菌条件下弃掉上清液，并用1mL 0.85%的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。

（4）再次在4℃，12,000 rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。

（5）分别采用500μL新鲜的LB液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和MT616的沉淀进行悬浮。

（6）分别取各2μL的三种菌液，滴在不添加抗性的LB固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。

（7）待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。

（8）挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。

（9）从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落PCR验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌:SM/pBBR (对照菌)、SM/pBBR-P21-rbfA（简写为SM1）、SM/ pBBR-P21-rbfA (T208C)（简写为SM2）、SM/pBBR-P21-tsf（简写为SM3）、SM/pBBR-P21-tsf(T631C)（简写为SM4）、SM/pBBR-P21-nusA （简写为SM5）、SM/ pBBR-P21-nusA (C517T) （简写为SM6）、SM/ pBBR-P21- frr（简写为SM7）、SM/ pBBR-P21- ysxC（简写为SM8）、SM/ pBBR-P21- greA（简写为SM9）。

实施例5：不同菌株评价

1、苜蓿中华根瘤菌的培养条件：

将对照菌、SM1、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6、SM7、SM8和SM9菌株在无菌条件下用接种针在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，30℃恒温静置48 h培养，获得单菌落。用接种针挑取单菌落于装有5 mL含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基的试管中，30℃，200 rpm培养36h。将种子培养基按照10%比例接种至含有100mg/L卡那霉素的30mL发酵培养基中（250ml摇瓶）。30℃震荡（220 r/min）培养144 h后收集菌体并检测产量。摇瓶发酵每个实验做3个平行。

、不同苜蓿中华根瘤菌菌株产VB₁₂能力和生物量的比较

SM1、SM2、SM3、SM4、SM5和SM6菌株与对照菌相比生产维生素B₁₂的能力均得到提高。结果如表4所示。

由上述可知，其中SM1提高4.8%，SM2提高8.4%，SM3提高25.3%，SM4提高32.5%，SM5提高20.5%，SM6提高27.7%。而SM6、SM7和SM8生产维生素B₁₂的能力有不同程度的降低。各菌株生物量变化不大，说明各核糖体因子基因的过表达未对菌体的生长造成影响。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>核糖体因子和其突变体及其在制备维生素B12中的应用

<160>38

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211> 372

<212> DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 1

atgctgcgcg tcggcgaaca ggtgcgcgct gccatcaccc aggttctgca acgcggcgag 60

gtccgcgatc cggtgatcga gaagaccgtc atcgcgattt cggaagtgcg catgtcaccg 120

gatctgaaga tcgccacggc ctatgtcacg ccgcttggcg tgcccaacca tgccgaggtc 180

atcgacgcgc tcaaccgcaa tgccaagtac attcgcggcc gcctcggccc gcagctgcga 240

cagatgaaat acatgcccga cgttcgtttc cgcgacgata cgagcttcga caattacaag 300

aagatcgacg agctcttgcg ttcgccggaa gttagccgcg atctcgacca gaccagcgaa 360

gacgaagaat ag 372

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 2

MLRVGEQVRA AITQVLQRGE VRDPVIEKTV IAISEVRMSP DLKIATAYVT PLGVPNHAEV 60

IDALNRNAKY IRGRLGPQLR QMKYMPDVRF RDDTSFDNYK KIDELLRSPE VSRDLDQTSE 120

DEE 123

<210> 3

<211> 906

<212> DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 3

atggtgaagg aactgcgcga aaagaccggc gcaggcatga tggactgcaa gaaggcgctc 60

gccgaaacca acggcgacat ggaagctgcg atcgactggc tgcgcgccaa gggcatcgcc 120

aaggccgaca agaagtcggg ccgcacggct gctgaaggcc tcatcggtat tgtcagcggt 180

ggcgtcaagg ctgtcgtcgt cgaaatcaac tccgagaccg atttcgttgc ccgcaacgaa 240

gccttccagg aactcgtccg cggcgttgcc aacgtagcgc tgaccaccga cggctcggtt 300

gaagccatcg cggctgcaaa ctacccggca accggcaagt cggtcgacga gaccatcaag 360

gacgcgatcg ccaccatcgg cgagaacatg acgcttcgcc gcgcagccct gctcaaggtc 420

gaagacggtg ttgtcgccac ctacatccac aacgctgccg gcgacggcat cggcaagctc 480

ggtgttctcg tcgccctgaa gtcgatcggc gacaaggaag ttctcttctc ggttggccgt 540

cagatcgcca tgcacatcgc tgcgaccaac ccgctcgcga tccgtgcgga cgaagtcgac 600

gccgctgttg ccgagcgcga acgcaacgtc ttcatcgaac agtcgcgcgc ttcgggcaag 660

ccggacaaca tcatcgaaaa gatggtcgaa ggccgcatgc gcaagttctt cgaagaagtc 720

gctctgctgt cgcaggcctt cgtcatgaac ccggaaatca ccgtcggtca ggccgtcaag 780

gacgctgaaa agctcgctgg cgcaccgatc gaagtcaccg gcatggctcg cctgctgctc 840

ggcgaaggtg tcgagaagga agagtccgac ttcgctgcag aagttgcagc cgtcgccaag 900

ggctga 906

<210> 4

<211> 301

<212> PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 4

MVKELREKTG AGMMDCKKAL AETNGDMEAA IDWLRAKGIA KADKKSGRTA AEGLIGIVSG 60

GVKAVVVEIN SETDFVARNE AFQELVRGVA NVALTTDGSV EAIAAANYPA TGKSVDETIK 120

DAIATIGENM TLRRAALLKV EDGVVATYIH NAAGDGIGKL GVLVALKSIG DKEVLFSVGR 180

QIAMHIAATN PLAIRADEVD AAVAERERNV FIEQSRASGK PDNIIEKMVE GRMRKFFEEV 240

ALLSQAFVMN PEITVGQAVK DAEKLAGAPI EVTGMARLLL GEGVEKEESD FAAEVAAVAK 300

G 301

<210> 5

<211> 1620

<212> PRT

<213> Sinorhizobium meliloti

<400> 5

atggcagtca gtgctaaccg gctcgagctt ctgcagatcg cggatgctgt cgcgcgtgaa 60

aaggtgatcg accgcgagat cgttctggcc gcgatggccg acgcgatcca gaaggccgcc 120

cgctcgcgct atgggtcgga atcgaacatc cgcgccgaca tcaactccaa gactggcgaa 180

atccgcctgc agcgtcttct ggaagtggtc gagaaggctg acgactactc cacgcagatc 240

ccgctcgagc ttgctcgcga tcgcaatccg gacgccaagc tcggtgactt catcgccgac 300

ccgctgccgc cgatggattt tggccgcatc gccgcccagt cggccaagca ggtcatagtg 360

cagaaggtgc gtgaagccga gcgcgaccgt cagttcgacg agttcaagga tcgcgtcggc 420

gagatcgtca acggcacggt caagcgcgtc gaatacggca acgtcatcgt cgacctcggc 480

cgtggcgaag gcatcatccg tcgcgacgag atgatcccgc gcgaaaacat gcgctacggc 540

gatcgcgtcc gctccttcgt ctacgacgtt cgccgcgaac agcgcggccc gcagatcttc 600

ctgtcgcgta cccatccgca gttcatggtg aagctcttca ccatggaagt gcctgaaatt 660

tacgacggca tcatccagat caagtcggtt gcccgcgacc cgggttcgcg cgccaagatc 720

gcggtcgtct ccaacgatag ctcgatcgat ccggtcggcg cctgcgtcgg tatgcgcggt 780

tcgcgcgttc aggccgtcgt tggcgagttg cagggcgaaa agatcgacat cattccgtgg 840

tcgcaggatc cggcatcgtt catcgtcaac gcgctgcagc cggccgaagt cgccaaggtc 900

gttctcgacg aagacgccga gcgcatcgaa gtggtcgttc ccgacgagca gctgtcgctc 960

gccatcggcc gacgcggcca gaacgttcgc ctcgcttcgc agctgaccgg ctgggatatc 1020

gacatcctga ccgagcagga agagagcgaa cgccgccaga aggaattcac cgagcgcacc 1080

aacctcttca tggatgcgct cgacgtcgac gaaatggtcg gtcaggtgct ggcttcggaa 1140

ggctttgccg ccgtcgagga gcttgcctat gtcgatctcg acgaaattgc gtcgatcgac 1200

ggtttcgacg acgagaccgc caacgaaatc cagacccgcg ctcgcgagta cctggaccgg 1260

atcgaggcgg aaatggatgc caagcgccgc gaactcggcg ttgccgacga actgcgctca 1320

atcgacggcc tgacgagcca gatgctcgtt gcgctgggcg aagaaggcat caagacggtc 1380

gaggactttg ctggttgcgc cgctgacgat ctcgtcggct ggagcgaacg caaggacggc 1440

gagaccaagc gtttcgaagg caccttctcg aagttcgacg tctcgcgcgc cgaagccgaa 1500

gccatgatcg ttcaggcccg cctcgcagcc ggctggatca cgcaagagga cctggcaagc 1560

gaagaggtcg aaggtgaaga gccgatcgac gttgccgaag gcgccgagca ggacgcttaa 1620

<210> 6

<211> 539

<212> PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 6

MAVSANRLEL LQIADAVARE KVIDREIVLA AMADAIQKAA RSRYGSESNI RADINSKTGE 60

IRLQRLLEVV EKADDYSTQI PLELARDRNP DAKLGDFIAD PLPPMDFGRI AAQSAKQVIV 120

QKVREAERDR QFDEFKDRVG EIVNGTVKRV EYGNVIVDLG RGEGIIRRDE MIPRENMRYG 180

DRVRSFVYDV RREQRGPQIF LSRTHPQFMV KLFTMEVPEI YDGIIQIKSV ARDPGSRAKI 240

AVVSNDSSID PVGACVGMRG SRVQAVVGEL QGEKIDIIPW SQDPASFIVN ALQPAEVAKV 300

VLDEDAERIE VVVPDEQLSL AIGRRGQNVR LASQLTGWDI DILTEQEESE RRQKEFTERT 360

NLFMDALDVD EMVGQVLASE GFAAVEELAY VDLDEIASID GFDDETANEI QTRAREYLDR 420

IEAEMDAKRR ELGVADELRS IDGLTSQMLV ALGEEGIKTV EDFAGCAADD LVGWSERKDG 480

ETKRFEGTFS KFDVSRAEAE AMIVQARLAA GWITQEDLAS EEVEGEEPID VAEGAEQDA 539

<210> 7

<211> 1000

<212> DNA

<213> Ensifer adhaerens

<400> 7

caaacagacc gggatatgcg ggtattcttc cgccgcgccg aggatgaggt ggcgcaggaa 60

cgcgtcaccg gcataggagc gggcgccacg gcttgcctga aggatgaccg ggctgtcggt 120

cgcatcggcg gcgcgcatga cggcctgaat gtattccaga ttgttcacat tgaacgccgg 180

cagcgcgtaa tcgttctccg ccgcatggtc gagcagttgc cgcaatgtga tcaatgccat 240

tcgctatctc cctttggata ctcggtgcaa cctatgcggc gcaccacaaa aacaatccgg 300

ccgttgaacc gcacgaaatg catcgatggc aaagtcgatg gccggctttt tcgtgcggcg 360

tgacggcgcg cgcgaattgg tcgcgcccac cgaagtcagg cgcacaatag ttcatcgaag 420

tggtttgaca accgggcaaa aggcaggttg ccagaggtcg aaactcgctt caatcgattt 480

tactgtggac tggatgcaac accttcagtg tgaagtgttt tcactttctg gtggtgcctg 540

agaggagggg gagtcgaggg cagtggatgc aaccattggg cgctgatttt gtctgttaca 600

ccatcgtggt ggatgccctg tcggaaacag tctgtcgaca ggaggtgaac gtcccgcaag 660

aagattgcgg caacgcccct ctttctttgc gcagattacg taaactgccg ctaaaattca 720

caaactttgc atcgcggatg attcgaggct caatccggcc gacaaaaagc gcggacctaa 780

aacgttgcag tagatttcgc aaaaatgccc tgttcacgtc atatgcccgt cgcaaaggcg 840

acgaaaagaa tcgcaaacaa aatacaacct atgggatagg ccgattcccc tcctatagat 900

aaagatgcag acagccgcag aatccgcctt gcgttcgcga acgatttgcg cttctctcct 960

gcgatcacaa acccaaaaca aggggaagga gagaaacaaa 1000

<210>8

<211> 561

<212> DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 8

atgagtgaag gtgttgacct gaaggaactg aagcgtcgca tggatggcgc catttccgca 60

ttcaagagcg atatcgcgtc gctccgtacc ggccgcgcgt cggcgaacgt tctcgatccg 120

gtgaccgtcg aagcctatgg ctcacgcgtg ccgctcaacc aggtggcgaa catcacggtt 180

cccgagccgc gcatgctgtc cgtctcggtc tgggacaagc agatggtcgg cgctgtggat 240

cgcggcattc gcgaatcgaa cctcggcctc aatccgatca tcgacggcca gaacctgcgc 300

attccgctgc cggaactcaa cgaagagcgc cgcaagtcgc tcgtcaaagt ggcacatgac 360

tacgccgaaa aggcgaaggt cgccgtgcgc cacgtgcgcc gtgacggcat ggacgacctg 420

aaaaaagccg aaaaggatgg cgacatcggt caggatatca gccgttctca gtccgagcgc 480

gtgcaaaaga tgaccgacga aacgatttcc gatatcgacc gcttgctcgt cgagaaggaa 540

aaggaaatca tgcaggtctg a 561

<210> 9

<211> 186

<212> PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 9

MSEGVDLKEL KRRMDGAISA FKSDIASLRT GRASANVLDP VTVEAYGSRV PLNQVANITV 60

PEPRMLSVSV WDKQMVGAVD RGIRESNLGL NPIIDGQNLR IPLPELNEER RKSLVKVAHD 120

YAEKAKVAVR HVRRDGMDDL KKAEKDGDIG QDISRSQSER VQKMTDETIS DIDRLLVEKE 180

KEIMQV 186

<210>10

<211> 672

<212> DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 10

atgaaggacc gaccgccgat ggccgatacc agacccaaag acgacaagcc gttgttcggc 60

cggccgtgga ttttcattcg cggcgtcccc gccatgaaat tcctgccgcc ggaaggaccg 120

gccgagattg cctttgccgg tcgctcgaac gtcggcaagt cgtcgttgat caacgccctg 180

gtcggccaca agggtctggc aagaacctcc aacaccccgg gccgcacgca ggaactcaac 240

tacttcgtac cggatggatt ttccggcgag gccgacgacc tgccgccgat ggcgctcgtc 300

gacatgcccg gttacggcta tgcccaggcg ccgaaggaac aggtcgatgc ctggacaaaa 360

ctggtcttcg actacctgcg cggccgctcg acgctgaagc gcgtctatgt gctgatcgac 420

agccgccacg gcatcaagaa gaacgacgac gaggtgctcg acctgctcga caaggcagcc 480

gtctcctatc agctcgtgct gaccaagacc gacaagatca aggccgccgg cgtgccgcgg 540

ctgatcgccg agacgctcga aaagatcaag aagcatcccg ccgccttccc ggaagtcctt 600

gcgacttcct cggagaaggg cgaagggctc gacgagctgc gggcggcaat cggcatcgcg 660

atcgcgcgct aa 672

<210> 11

<211> 223

<212> PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 11

MKDRPPMADT RPKDDKPLFG RPWIFIRGVP AMKFLPPEGP AEIAFAGRSN VGKSSLINAL 60

VGHKGLARTS NTPGRTQELN YFVPDGFSGE ADDLPPMALV DMPGYGYAQA PKEQVDAWTK 120

LVFDYLRGRS TLKRVYVLID SRHGIKKNDD EVLDLLDKAA VSYQLVLTKT DKIKAAGVPR 180

LIAETLEKIK KHPAAFPEVL ATSSEKGEGL DELRAAIGIA IAR 223

<210>12

<211> 492

<212> DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 12

atgaaggaca ttgaaatggt cgaaaaagtg ccgatgacac agggcggatt cgtcaacctg 60

caggaggagc tgcgctggcg ccagcaggaa gaacgaccgc gaatcatcga ggcgattgcc 120

gaagcccgtg cacatggcga cctgtcggaa aatgccgagt accacgcggc caaggaagcg 180

cagagccaca acgagggccg gatcaccgag ctcgaagact tgatcgcccg cgcggaagtc 240

attgatctct cgaagatgtc cggctccaag atcaagttcg gcgccaaggt caaactcgtc 300

gacgaagaca ctgaagaaga aaagacctac cagatcgttg gcgaccagga agccgacgtg 360

aaggctggcc gcatttcgat ctcgtcgccg atcgcgcgcg cgctcatcgg caaggaagtc 420

ggcgattcca tcgaagtgaa cgcgcctggc ggttccaagg cctacgaaat tctcgccgtc 480

aactggggct ga 492

<210> 13

<211> 163

<212> PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 13

MKDIEMVEKV PMTQGGFVNL QEELRWRQQE ERPRIIEAIA EARAHGDLSE NAEYHAAKEA 60

QSHNEGRITE LEDLIARAEV IDLSKMSGSK IKFGAKVKLV DEDTEEEKTY

核糖体因子和其突变体及其在制备维生素B12中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。