专利摘要
本发明公开了一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，与现有技术相比，本发明通过甲基化的DNA修饰到电极上，从而使耦联了二茂铁-抗甲基化抗体修饰到电极上，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。本发明提供的检测方法对DNA转甲基酶的检测具有灵敏度高、检测限低、选择性好的特点。
权利要求
1.一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备二茂铁-抗甲基化抗体；
(2)制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；
(3)将发夹DNA1甲基化；
(4)制备发夹DNA2修饰的金电极；
(5)构建得到电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入含有二羧基二茂铁的PBS缓冲溶液中，反应物在室温下震荡1～2小时，将得到的产物重新分散在含有抗5-甲基胞嘧啶抗体的PBS缓冲溶液中，室温下震荡反应，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中发夹DNA1序列为:5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATACCCGG-3′；发夹DNA2序列为:
5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTCTACCCGG-MB-3’。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括以下步骤：将发夹DNA2缓冲溶液滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应，超纯水清洗后，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有6-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲溶液中，以封闭剩余的空穴；得到发夹DNA2修饰的金电极。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)为：将甲基化的发夹DNA1滴加到发夹DNA2修饰的金电极上，室温下培养后得到修饰的金电极，将步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面，室温下培养，清洗，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换。
7.一种检测DNA甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
a、制备二茂铁-抗甲基化抗体；
b、制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；
c、将发夹DNA1甲基化；
d、制备发夹DNA2修饰的金电极；
e、构建电化学生物传感器，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测检测DNA甲基转移酶活性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤c具体为：将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和不同浓度的M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤e具体为：将5μL步骤(3)制备的甲基化的发夹DNA1滴加到步骤(4)制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNA1和发夹DNA2实现碱基互补配对，室温下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5μL步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养1h，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1MPBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。
说明书
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，可以实现对DNA甲基转移酶活性的灵敏检测。
背景技术
肿瘤表观遗传学是一门新兴的学科,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质修饰、基因组印记和非编码RNA调控等几个方面。其中,DNA甲基化与肿瘤的关系是研究的热点。近年来，诸多研究表明DNA甲基化在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用，与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关。随着胚胎学和肿瘤学基础研究的迅速发展，DNA甲基化受到越来越多的关注。
对于DNA甲基化的研究，目前有很多方法，大致可以分为两类：一类是从DNA甲基转移酶的角度，另一类是从DNA甲基化水平的角度进行研究；后者又分为总体DNA甲基化水平和特异基因序列DNA甲基化水平的检测。
已有研究表明，胚胎发育过程中的DNA甲基化模式的改变是个体发生的关键，其与印迹的清除和重建、x染色体的失活、种系分化等等都有密切关系。经过近半个世纪的研究，DNA甲基化水平的变化目前已是人类癌症的一种典型改变，并伴随着恶性肿瘤细胞的产生、发展而变化。
因此，快速有效的检测DNA甲基化水平的变化对肿瘤的诊断、发生、发展都至关重要。目前检测DNA甲基化的方法费力，费时，灵敏度低和不够精确。因此，探讨甲基化形成与改变的可能机制，建立准确性好，灵敏度高，操作简单的DNA甲基化检测方法意义重大。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，利用DNA序列之间碱基的互补配对作用，甲基化后的发夹DNA1与电极上的发夹DNA2形成双链，发夹DNA2上修饰的亚甲蓝分子远离电极表面，加入二茂铁-抗甲基化抗体后修饰到发夹DNA1上的甲基化位点，从而构建了一个信号转换的电化学生物传感器，通过甲基化前后检测到的信号转换检测DNA甲基转移酶活性，实现了对DNA甲基转移酶的灵敏性、特异性、稳定性的检测。
本发明提供的一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备二茂铁-抗甲基化抗体；
(2)制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；
(3)将发夹DNA1甲基化；
(4)制备发夹DNA2修饰的金电极；
(5)构建得到电化学生物传感器。
步骤(1)包括以下步骤：将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入含有二羧基二茂铁的PBS缓冲溶液中，反应物在室温下震荡1～2小时，将得到的产物重新分散在含有抗5-甲基胞嘧啶抗体的PBS缓冲溶液中，室温下震荡反应，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
进一步的，步骤(1)具体为：将0.03834g20mM的碳二亚胺和0.03702g32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的10mL0.1M的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，,在室温下震荡1～2小时，活化二羧基二茂铁的羧基之后，将2mL得到的产物重新分散在含有10μL10mg/mL抗5-甲基胞嘧啶抗体的4mLPBS缓冲溶液中，将此溶液在室温下震荡2小时，之后，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
步骤(2)包括以下步骤：将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到发夹DNA1缓冲溶液和发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；
进一步的，步骤(2)中发夹DNA1序列为:
5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATACCCGG-3′；发夹DNA2序列为:5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTCTACCCGG-MB-3’。
进一步的，步骤(2)具体为：将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在0.1MpH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到浓度为100μM的发夹DNA1缓冲溶液和浓度为100μM发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；
步骤(3)为：将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化；
进一步的，步骤(3)具体为：将1μL100μM的发夹DNA1缓冲溶液加入到200μL缓冲溶液里，得0.5μM发夹DNA1缓冲溶液，加入到含有160μMS-腺苷基甲硫氨酸和200μLM.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃湿润条件下反应2小时，之后，用10mM的Tris–HCl(pH＝7.4)清洗3次，发夹DNA1实现甲基化。
步骤(4)包括以下步骤：将发夹DNA2缓冲溶液滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应，超纯水清洗后，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有6-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲溶液中，以封闭剩余的空穴；得到发夹DNA2修饰的金电极。
步骤(4)具体为：在100μL的100μM发夹DNA2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的发夹DNA2稀释到0.5μM，将5μL0.5μM的发夹DNA2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的10mMTris-HCl(pH＝7.4)以封闭剩余的空穴。
所述抛光处理具体为：金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。
步骤(5)为：将甲基化的发夹DNA1滴加到发夹DNA2修饰的金电极上，室温下培养后得到修饰的金电极，将步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面，室温下培养，清洗，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换。
进一步的，步骤(5)具体为：将5μL步骤(3)制备的甲基化的发夹DNA1滴加到步骤(4)制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNA1和发夹DNA2实现碱基互补配对，室温下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5μL步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养1h，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1MPBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换。
一种检测DNA甲基转移酶活性的方法，包括以下步骤：
a、制备二茂铁-抗甲基化抗体；
b、制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；
c、将发夹DNA1甲基化；
d、制备发夹DNA2修饰的金电极；
e、构建电化学生物传感器，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测检测DNA甲基转移酶活性。
步骤a具体为：将0.03834g20mM的碳二亚胺和0.03702g32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的10mL0.1M的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，在室温下震荡1～2小时，活化二羧基二茂铁的羧基之后，将2mL得到的产物重新分散在含有10μL10mg/mL抗5-甲基胞嘧啶抗体的4mLPBS缓冲溶液中，将此溶液在室温下震荡2小时，之后，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
进一步的，步骤b具体为：
将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在0.1MpH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到浓度为100μM的发夹DNA1缓冲溶液和浓度为100μM发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；
步骤b中发夹DNA1序列为:
5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATACCCGG-3′；发夹DNA2序列为:5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTCTACCCGG-MB-3’。
步骤c具体为：将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和不同浓度的M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化。
M.SssI甲基转移酶存储溶液浓度为：0U/mL、0.25U/mL、0.375U/mL、0.5U/mL,1U/mL、10U/mL、20U/mL、40U/mL。
步骤d具体为：在100μL的100μM发夹DNA2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的发夹DNA2稀释到0.5μM，将5μL0.5μM的发夹DNA2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的10mMTris-HCl(pH＝7.4)以封闭剩余的空穴。
步骤e具体为：将5μL步骤(3)制备的甲基化的发夹DNA1滴加到步骤(4)制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNA1和发夹DNA2实现碱基互补配对，室温下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5μL步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养1h，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1MPBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。
与现有技术相比，本发明通过甲基化的DNA修饰到电极上，从而使耦联了二茂铁-抗甲基化抗体修饰到电极上，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。本发明提供的检测方法对DNA转甲基酶的检测具有灵敏度高、检测限低、选择性好的特点。
附图说明
图1为基于信号转换检测DNA甲基转移酶活性的电化学生物传感器的制备示意图；
图2为制备的电化学生物传感器不同实验条件下的方波伏安法图；其中a为发夹DNA1/发夹DNA2/金电极；b为甲基化的发夹DNA1/发夹DNA2/金电极；c为二茂铁-抗甲基化抗体/发夹DNA1/发夹DNA2/金电极；
图3A为不同修饰电极的电化学阻抗图；
a为裸电极；b为发夹DNA2/金电极；c为发夹DNA1/发夹DNA2/金电极；d为二茂铁-抗甲基化抗体/发夹DNA1/发夹DNA2/金电极；
图3B为不同修饰电极的循环伏安图；
a为裸电极；b为发夹DNA2/金电极；c为发夹DNA1/发夹DNA2/金电极；d为二茂铁-抗甲基化抗体/发夹DNA1/发夹DNA2/金电极；
图4A为实验优化条件图，温度；
图4B为实验优化条件图，培养时间；
图4C为实验优化条件图，pH；
图5A为检测不同浓度的DNA甲基转移酶M.SssI的方波伏安法曲线图；浓度从a到h依次为0U/mL,0.25U/mL,0.375U/mL,0.5U/mL,1U/mL,10U/mL,20U/mL,40U/mL；
图5B为基于对亚甲基蓝IMB的电化学信号与DNA甲基转移酶M.SssI浓度作的图；
图5C为基于对二茂铁IFc的电化学信号与DNA甲基转移酶M.SssI浓度作的图；
图5D为基于IFc/|IMB|的电化学信号与DNA甲基转移酶M.SssI浓度作的图
图6为体系对DNA甲基转移酶M.SssI的选择性分析。
具体实施方式
实施例1
一种基于信号转换构建电化学生物传感器检测DNA甲基转移酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)将0.03834g20mM的碳二亚胺和0.03702g32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的10mL0.1M的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，,在室温下震荡1～2小时，活化二羧基二茂铁的羧基之后，将2mL得到的产物重新分散在含有10μL10mg/mL抗5-甲基胞嘧啶抗体的4mLPBS缓冲溶液中，将此溶液在室温下震荡2小时，之后，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
(2)将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在0.1MpH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到浓度为100μM的发夹DNA1缓冲溶液和浓度为100μM发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；发夹DNA1序列为:
5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATACCCGG-3′；发夹DNA2序列为:5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTCTACCCGG-MB-3’；
(3)将1μL100μM的发夹DNA1缓冲溶液加入到200μL缓冲溶液里，得0.5μM发夹DNA1缓冲溶液，加入到含有160μMS-腺苷基甲硫氨酸和0U/mL、0.25U/mL、0.375U/mL、0.5U/mL,1U/mL、10U/mL、20U/mL、40U/mL的200μLM.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃湿润条件下反应2小时，之后，用10mM的Tris–HCl(pH＝7.4)清洗3次，发夹DNA1实现甲基化。
(4)在100μL的100μM发夹DNA2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的发夹DNA2稀释到0.5μM，将5μL0.5μM的发夹DNA2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的10mMTris-HCl(pH＝7.4)以封闭剩余的空穴。
(5)将5μL步骤(3)制备的甲基化的发夹DNA1滴加到步骤(4)制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNA1和发夹DNA2实现碱基互补配对，室温下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5μL步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养1h，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1MPBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。
实施例2
一种基于信号转换构建电化学生物传感器检测DNA甲基转移酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)将0.03834g20mM的碳二亚胺和0.03702g32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的10mL0.1M的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，,在室温下震荡1～2小时，活化二羧基二茂铁的羧基之后，将2mL得到的产物重新分散在含有10μL10mg/mL抗5-甲基胞嘧啶抗体的4mLPBS缓冲溶液中，将此溶液在20℃下震荡2小时，之后，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
(2)将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在0.1MpH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到浓度为100μM的发夹DNA1缓冲溶液和浓度为100μM发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；发夹DNA1序列为:
5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATACCCGG-3′；发夹DNA2序列为:5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTCTACCCGG-MB-3’；
(3)将1μL100μM的发夹DNA1缓冲溶液加入到200μL缓冲溶液里，得0.5μM发夹DNA1缓冲溶液，加入到含有160μMS-腺苷基甲硫氨酸和40U/mL的200μLM.SssI甲基转移酶存储溶液，在室温湿润条件下反应2小时，之后，用10mM的Tris–HCl(pH＝7.4)清洗3次，发夹DNA1实现甲基化。
(4)在100μL的100μM发夹DNA2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，20～44℃下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的发夹DNA2稀释到0.5μM，将5μL0.5μM的发夹DNA2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的10mMTris-HCl(pH＝7.4)以封闭剩余的空穴。
(5)将5μL步骤(3)制备的甲基化的发夹DNA1滴加到步骤(4)制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNA1和发夹DNA2实现碱基互补配对，20℃下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5μL步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养1h，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1MPBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。
实施例3
只改变培养温度从20℃-44℃，依次分别进行实验，其他反应条件同实施例2，得到如图4A所示的温度优化图；
实施例4
只改变步骤(3)中的反应时间，从0.5～3小时依次分别进行实验，，其他反应条件同实施例2，得到如图4B所示的反应时间优化图；
实施例5
只改变缓冲溶液的pH，从6-11依次分别进行实验，其他反应条件同实施例2，得到如图4C所示的pH优化图；
实施例6
只改变步骤(3)中的检测对象，分别为含有160μMS-腺苷基甲硫氨酸和40U/mL的200μLM.SssI甲基转移酶存储溶液、含有160μMS-腺苷基甲硫氨酸和40U/mL的200μLDam甲基转移酶存储溶液、含有160μMS-腺苷基甲硫氨酸和40U/mL的200μLHaeⅢ甲基转移酶存储溶液，依次分别进行实验，其他反应条件同实施例2，得到如图6所示的选择性分析图。
SEQUENCELISTING
<110>安徽师范大学
<120>一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性
<130>1
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>37
<212>DNA
<213>发夹DNA1序列
<400>1
5'-ccgggtagagctcccttcaatccaacatgatacccgg-3'37
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>发夹DNA2序列
<400>2
5'-SH-ccgggtatcatgttggattgaagggagctctacccgg-MB-3'37
一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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