专利摘要

本发明公开了一种维生素D受体及其配体在提高免疫细胞抗肿瘤能力中的应用。本发明中发现维生素D受体及其依赖的配体能有效下调免疫细胞表面的PD‑1,Tim‑3,TIGIT的表达，此外在免疫细胞中抑制维生素D受体可导致细胞因子分泌下调，基因过表达维生素D受体在TCR激活下可增强细胞因子的有效释放，进而上调T细胞对肿瘤的敏感性和促进T细胞对肿瘤的杀伤能力，即维生素D受体及其配体可以改善免疫细胞的功能，提高免疫细胞的敏感性，且具有毒副作用小，耐受范围大，安全性能高的特点，因此，可将其用于应用于免疫检验点联合治疗、细胞回输治疗方面。

权利要求

1.维生素D受体及其配体在制备抑制免疫细胞免疫检验点表达的产品中的应用，其特征在于：

所述的免疫检验点为Tim-3和TIGIT中的至少一种；

所述的抑制免疫细胞免疫检验点表达为通过在免疫细胞中过表达维生素D受体的基因，或通过维生素D受体的配体激活免疫细胞中维生素D受体的方式实现；

所述的免疫细胞为γδT细胞。

2.根据权利要求1所述的维生素D受体及其配体在制备抑制免疫细胞免疫检验点表达的产品中的应用，其特征在于：

所述的维生素D受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的维生素D受体的配体为维生素D3，25(OH)D3和1α,25(OH)2D3中的至少一种。

3.根据权利要求1～2任一项所述的维生素D受体及其配体在制备抑制免疫细胞免疫检验点表达的产品中的应用，其特征在于：

所述的抑制免疫检验点表达的产品为免疫检验点抑制剂。

4.根据权利要求3所述的维生素D受体及其配体在制备抑制免疫细胞免疫检验点表达的产品中的应用，其特征在于：

所述的免疫检验点抑制剂还包括白细胞介素2。

5.根据权利要求4所述的维生素D受体及其配体在制备抑制免疫细胞免疫检验点表达的产品中的应用，其特征在于：

所述的免疫检验点抑制剂中维生素D受体的配体的使用浓度为10～1000nmol/L；

所述的IL-2的使用浓度为2～100ng/mL。

6.维生素D受体在制备调控免疫细胞中的细胞因子分泌的产品中的应用，其特征在于，维生素D受体调控免疫细胞中的细胞因子的分泌为通过如下任一种方式实现：

(1)在免疫细胞中过表达维生素D受体的基因，维生素D受体在抗原的刺激下促进细胞因子的分泌；

(2)抑制免疫细胞中维生素D受体的表达，减少免疫细胞杀伤性因子的分泌；

方式(1)中，所述的抗原为αCD3和CD28；

所述的αCD3的有效浓度为5μg/mL，CD28的的有效浓度为1μg/mL；

方式(2)中，所述的抑制免疫细胞中维生素D受体的表达为通过在免疫细胞中加入维生素D受体的配体以及酮康唑的方式实现；

所述的维生素D受体的配体为25(OH)D3；

所述的酮康唑的有效浓度为1μg/mL；

所述的免疫细胞为γδT细胞；

所述的细胞因子为TNF-α和IFN-γ。

说明书

技术领域

本发明属于抗肿瘤免疫治疗的生物医学技术领域，涉及一种维生素D受体及其配体在提高免疫细胞抗肿瘤能力中的应用，特别涉及一种维生素D受体及其配体在制备抑制免疫检验点表达的产品中的应用。

背景技术

根据最新文献报道，全球癌症发病率和死亡率正在迅速增长，到2018年，全球有1810万新发癌症病例和960万例癌症死亡病例。在两性中，发病率最高的癌症是肺癌，女性乳腺癌，前列腺癌和结直肠癌(Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,Siegel RL,Torre LA,Jemal A.Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence andmortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.CA:a cancer journal forclinicians 2018,68(6):394-424.)。目前化疗和放疗的抗癌治疗手段效果有限，并且面临严重的副作用。最新的免疫治疗手段主要包括免疫检验点阻断治疗(PD-1,PD-L1,CTLA-4,Tim-3,TIGIT)和免疫细胞治疗(CAR-T)，该疗法的有效性，持续性，安全性引起了公众的极大关注。免疫检验点阻断治疗中以PD-1和PD-L1治疗效果最为突出，其他免疫检验点Tim-3,TIGIT也积极应用于临床。该疗法有效的延长患者的生存期，并且副作用相对较小(BrahmerJR,Tykodi SS,Chow LQ,Hwu WJ,Topalian SL,Hwu P,et al.Safety and activity ofanti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer.The New England journalof medicine 2012,366(26):2455-2465.1；Hodi FS,O'Day SJ,McDermott DF,Weber RW,Sosman JA,Haanen JB,et al.Improved survival with ipilimumab in patients withmetastatic melanoma.The New England journal of medicine 2010,363(8):711-723；El-Khoueiry AB,Sangro B,Yau T,Crocenzi TS,Kudo M,Hsu C,et al.Nivolumab inpatients with advanced hepatocellular carcinoma(CheckMate 040):an open-label,non-comparative,phase 1/2 dose escalation and expansion trial.Lancet 2017,389(10088):2492-2502；Sakuishi K,Apetoh L,Sullivan JM,Blazar BR,Kuchroo VK,Anderson AC.Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustionand restore anti-tumor immunity(vol 207,pg 2187,2010).Journal Of ExperimentalMedicine 2011,208(6):1331-1331；Anderson AC,Joller N,Kuchroo VK.Lag-3,Tim-3,and TIGIT:Co-inhibitory Receptors with Specialized Functions in ImmuneRegulation.Immunity 2016,44(5):989-1004.)。但该治疗方法高度依赖患者体内的免疫类细胞或者肿瘤组织高表达PD-1和PD-L1，并且响应率大约只有20％。此外，越来越多的临床数据表明PD-1和PD-L1阻断疗法会导致不良事件，尤其以心肌炎最为突出(Wang DY,Salem JE,Cohen JV,Chandra S,Menzer C,Ye F,et al.Fatal Toxic EffectsAssociated With Immune Checkpoint Inhibitors:A Systematic Review and Meta-analysis.JAMA oncology 2018,4(12):1721-1728.)。人工改造的CAR-T(ChimericAntigen Receptor T-Cell Immunotherapy)细胞免疫疗法以其精确识别肿瘤并达到最终消灭肿瘤而著称。CAR-T免疫治疗主要应用于急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗(Stirrups R.CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.LancetOncol 2018,19(1):E19-E19；Maude SL,Laetsch TW,Buechner J,Rives S,Boyer M,Bittencourt H,et al.Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-CellLymphoblastic Leukemia.The New England journal of medicine 2018,378(5):439-448；June CH,O'Connor RS,Kawalekar OU,Ghassemi S,Milone MC.CAR T cellimmunotherapy for human cancer.Science 2018,359(6382):1361-1365.)，该疗法通过人工改造的肿瘤嵌合抗原受体(CAR)和协同共刺激分子(CD28,4-1BB)以促进精确识别肿瘤和释放多种细胞因子，从而达到治疗肿瘤的目的。但不足的是该疗法会促使炎症因子大量释放即细胞因子释放综合征(CRS)，从而导致严重的副作用(Neelapu SS,Tummala S,Kebriaei P,Wierda W,Gutierrez C,Locke FL,et al.Chimeric antigen receptor T-cell therapy-assessment and management of toxicities.Nature reviews Clinicaloncology 2018,15(1):47-62.)。

维生素D受体(vitamin D receptor)是一种核激素受体，基因位于人类12号染色体上，该受体包含DNA结合区域(aa 24-90,91-115)，核定位区域(aa 49-55,79-105)，激素配体结合区域(227-244,268-316,396-422)，转录激活区域(aa 246,416-422)和发生二聚化(aa 37,91-92,244-263,317-395)功能的区域(Deeb KK,Trump DL,Johnson CS.VitaminD signalling pathways in cancer:potential for anticancer therapeutics.Nat RevCancer 2007,7(9):684-700.)。维生素D受体广泛分布于机体各组织中，由于其独特的结构特征，可以发挥转录激活和抑制作用并且这一过程依赖于配体。在肿瘤细胞中，维生素D受体及其配体可以抑制其增殖进而导致肿瘤的凋亡，以达到抗肿瘤的效果(Palmer HG,Larriba MJ,Garcia JM,Ordonez-Moran P,Pena C,Peiro S,et al.The transcriptionfactor SNAIL represses vitamin D receptor expression and responsiveness inhuman colon cancer.Nature medicine 2004,10(9):917-919.)。但该受体(VDR)在调控免疫细胞的免疫检验点、细胞因子产生和抗肿瘤效果方面尚未见报道。此外，由于PD-1/PD-L1单抗和CAR-T疗法极其昂贵，并且伴随严重的副作用，因此针对维生素D受体开发相关抑制剂或者用以改造免疫T细胞，以促进免疫T细胞的抗肿瘤活性具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种维生素D受体及其配体在制备抑制免疫检验点表达的产品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

维生素D受体及其配体在制备抑制免疫检验点表达的产品中的应用，

当为维生素D受体(VDR)时，所述的免疫检验点包括PD-1，Tim-3和TIGIT中的至少一种；

当为维生素D受体(VDR)的配体时，所述的免疫检验点包括Tim-3和TIGIT中的至少一种。

所述的维生素D受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该受体是一种增强免疫应答的受体，在抗原激活下可以有效增强T细胞分泌细胞因子而促进杀伤功能(抑制维生素D受体(VDR)水平在TCR激活下细胞因子下降，过表达维生素D受体在TCR激活下细胞因子分泌增加)；所述维生素D受体可以通过基因工程方法合成或者应用配体激活免疫细胞维生素D受体转化而成。

所述的维生素D受体抑制免疫检验点表达为通过在免疫细胞中过表达维生素D受体的基因，或通过维生素D受体的配体激活免疫细胞中维生素D受体的方式实现。

所述的过表达维生素D受体的基因通过基因工程的方式实现，包括通过慢病毒技术等在免疫细胞中过表达。

所述的免疫细胞为T细胞；优选为CD8T细胞、CD4T细胞和γδT细胞中的至少一种。

所述的维生素D受体的配体为维生素D₃(vitamin D₃，VD₃)，25(OH)D₃(中等活性)和1α,25(OH)₂D₃(高等活性)中的至少一种。

所述的抑制免疫检验点表达的产品包括抑制免疫检验点的表达的药物，抑制剂等。

所述的产品还可以含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体。

所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。

所述的产品可采用本领域的常规方法制成各种剂型，包括注射剂和口服制剂等。

一种免疫检验点抑制剂，包括白细胞介素2(IL-2)，和维生素D受体及其配体中的至少一种；IL-2用于维持免疫细胞的活化与增殖，核心成分维生素D受体及其配体用于降低免疫细胞免疫抑制分子PD-1,Tim-3,TIGIT的表达，以增强免疫应答；

当为维生素D受体，或维生素D受体和维生素D受体的配体时，所述的免疫检验点包括PD-1，Tim-3和TIGIT中的至少一种；

当为维生素D受体的配体时，所述的免疫检验点包括Tim-3和TIGIT中的至少一种。

所述的维生素D受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的维生素D受体抑制免疫检验点表达为通过在免疫细胞中过表达维生素D受体的基因的方式实现，在免疫细胞中过表达维生素D受体的基因可以下调免疫检验点(PD-1,Tim-3,TIGIT)的表达。

所述的免疫细胞为T细胞；优选为CD8T细胞、CD4T细胞和γδT细胞中的至少一种。

所述的维生素D受体的配体为维生素D₃(vitamin D₃，VD₃)，25(OH)D₃和1α,25(OH)₂D₃中的至少一种；优选为1α,25(OH)₂D₃。

所述的免疫检验点抑制剂中维生素D受体的配体的使用浓度为10～1000nmol/L；优选为50～500nmol/L；更优选为50～100nmol/L。

所述的IL-2的使用浓度为2～100ng/mL；优选为10～40ng/mL；

所述的IL-2优选为重组人白细胞介素2(rhIL-2)。

所述的免疫检验点抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物通过维生素D受体及其配体下调免疫检验点(PD-1、Tim-3、TIGIT)的表达，和/或维生素D受体增强免疫细胞中的细胞因子分泌来实现抗肿瘤的目的。

所述的抗肿瘤药物为肿瘤免疫治疗药物，肿瘤放射性治疗药物，或者肿瘤化学性治疗药物。

所述的免疫治疗包括抗体药物治疗，CAR-T，TCR-T，CIK细胞和γδT细胞治疗。

所述的肿瘤包括肺癌，胃癌，结肠癌，食管癌，喉癌，肝癌，肾癌，结直肠癌，淋巴瘤，黑色素瘤，乳腺癌，神经母细胞瘤，膀胱癌，胰腺癌和头颈癌等所有肿瘤类型。

维生素D受体在制备抗肿瘤药物中的应用；其中，所述的维生素D受体通过抑制免疫检验点的表达，以及增强免疫细胞因子分泌；所述的维生素D受体抑制免疫检验点表达为通过在免疫细胞中过表达维生素D受体的基因，或通过维生素D受体的配体激活免疫细胞中维生素D受体的方式实现。

维生素D受体在制备调控免疫细胞中的细胞因子分泌的产品中的应用。

维生素D受体调控免疫细胞中的细胞因子的分泌为通过如下任一种方式实现：

(1)在免疫细胞中过表达维生素D受体的基因，维生素D受体在抗原的刺激下促进细胞因子的分泌；

(2)抑制免疫细胞中维生素D受体的表达，减少免疫细胞杀伤性因子的分泌。

方式(1)中，

所述的抗原为αCD3和CD28。

所述的αCD3的有效浓度为5μg/mL，CD28的的有效浓度为1μg/mL。

方式(2)中，

所述的抑制免疫细胞中维生素D受体的表达为通过在免疫细胞中加入维生素D受体的配体以及酮康唑(Ketoconazole)的方式实现。

所述的酮康唑的有效浓度为1μg/mL。

所述的免疫细胞为T细胞；优选为Vδ2 T细胞。

所述的细胞因子优选为TNF-α和IFN-γ。

所述的调控免疫细胞中的细胞因子分泌的产品包括药物、抑制剂等。

本发明研究发现：核心成分维生素D受体及其依赖的配体(25(OH)D₃,1α,25(OH)₂D₃)下调免疫细胞(CD8 T和γδT)表面的PD-1,Tim-3,TIGIT的表达，此外在免疫细胞中抑制维生素D受体可导致细胞因子分泌下调，基因过表达维生素D受体在TCR激活下可增强细胞因子的有效释放，进而上调T细胞对肿瘤的敏感性和促进T细胞对肿瘤的杀伤能力。维生素D受体及其配体是免疫细胞所必须的，其毒副作用小，耐受范围大，在安全剂量内可以口服、注射维生素D受体的配体以激活受体下调免疫检验点PD-1,Tim-3,TIGIT的表达以及通过慢病毒转导维生素D受体进入免疫细胞过表达以提升免疫细胞的杀伤功能。在CAR-T,TCR-T,CIK,γδT细胞中联用维生素D受体及其配体或者联用疫检验点治疗将有效改善现有的免疫疗法，不会导致严重的细胞因子释放综合征，并且有效的恢复免疫细胞的正常杀伤功能。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明中维生素D受体及其配体可以改善免疫细胞的功能，能有效下调免疫细胞(CD8T、CD4T和γδT细胞)PD-1,Tim-3,TIGIT的表达水平并且增强T细胞的活性与抗肿瘤功能。免疫细胞特别是细胞毒性T细胞中过表达的维生素D受体，在TCR或肿瘤抗原的刺激下可以有效的增强免疫应答，即T细胞中过表达维生素D受体后在TCR信号通路的激活下可以有效的促进细胞因子的分泌，进而增强T细胞的杀伤能力，且不会造成细胞因子风暴。

2、本发明可以联用各种促进免疫细胞功能的细胞因子，以增强维生素D受体改造的T细胞或者配体激活过的T细胞功能。

3、本发明中维生素D受体广泛分布在机体各组织中，特别是在免疫细胞中也表达，所以通过基因工程化改造的维生素D受体过表达T细胞回输治疗具有良好的安全性能，人体具有良好的耐受性。

4本发明中通过基因工程过表达维生素D受体在免疫细胞中，再通过其配体激活可以有效的降低免疫检验点的表达水平并且不依于病人自身免疫检验点的水平，从而有效的恢复耗竭T细胞的功能，并且在配体的激活下进一步下调免疫检验点的水平，从而增强免疫系统的抗肿瘤能力，拯救免疫细胞的耗竭状态以改善免疫功能。

5、现有的免疫疗法，包括CAT-T,TCR-T，CIK等存在明显的缺陷，比如：过度激活免疫反应，引起严重的细胞因子释放综合释；或由于肿瘤微环境的抑制作用，很容易被肿瘤细胞驯化，丧失其抗肿瘤功能。相比较于CAR-T细胞疗法，本发明方法着力改善免疫细胞的功能，提高免疫细胞的敏感性，有效的降低炎症因子风暴，大大提高细胞疗法的安全性和有效性。

6、现有的免疫检验点疗法响应率较低，价格昂贵，高度依赖肿瘤病人自身免疫检验点的水平。本发明可以打破传统的免疫检验点阻断治疗，不依赖于肿瘤病人的免疫检验点的水平。过表达的维生素D受体在其配体的刺激下即可下调免疫检验点的水平，恢复T细胞的正常功能，并且过表达维生素D受体的免疫细胞在抗原刺激下即可释放细胞因子，缺失维生素D受体不会导致细胞因子的分泌。

7、本发明中维生素D受体及配体可以和CAR-T、TCR-T、CIK细胞联用，有效提高这2种细胞的性能和安全性。

8、本发明中维生素D受体及配体可以与现有CAR-T、TCR-T、CIK细胞回输和免疫检验点阻断疗法联用，甚至可以单独高表达维生素D受体将其工程化应用于细胞治疗。

9、本发明中由于维生素D受体在免疫细胞中表达，其配体1α,25(OH)₂D₃耐受范围大，毒副作用小，价格低廉，安全性极高，可以有效的应用于免疫检验点联合治疗，细胞回输治疗，因此可用于多种疾病的治疗、干预和预防，包括肿瘤和感染性疾病。

10、本发明可以有效的拓展和丰富现有的免疫疗法，在安全性和有效性方面具有极其广阔的应用前景。

附图说明

图1是不同浓度的VD₃，25(OH)D₃及1α,25(OH)₂D₃对γδT细胞PD-1,Tim-3,TIGIT表达的影响图；其中，A为不同浓度的VD₃，25(OH)D₃及1α,25(OH)₂D₃对γδT细胞PD-1表达的影响；B为不同浓度的VD₃，25(OH)D₃及1α,25(OH)₂D₃对γδT细胞Tim-3表达的影响；C为不同浓度的VD₃，25(OH)D₃及1α,25(OH)₂D₃对γδT细胞TIGIT表达的影响。

图2是敲除VDR受体后通过其配体1α,25(OH)₂D₃的刺激对免疫细胞PD-1,Tim-3,TIGIT表达的影响图；其中，A为对PD-1表达的影响；B为对Tim-3表达的影响；C为对TIGIT表达的影响。

图3是过表达VDR受体后通过其配体1α,25(OH)₂D₃的刺激对免疫细胞PD-1,Tim-3,TIGIT表达的影响图；其中，A为对PD-1表达的影响；B为对Tim-3表达的影响；C为对TIGIT表达的影响。

图4是在25(OH)D₃,1.25(OH)₂D₃分别和Ketoconazole作用下维生素D受体表达情况的蛋白凝胶电泳图。

图5是维生素D受体水平对Vδ2 T细胞的细胞因子分泌的影响图。

图6是维生素D受体在TCR(αCD3/CD28)的激活下对Vδ2 T细胞的细胞因子分泌的影响图。

图7是维生素D激活的T细胞的抗肿瘤效果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

本发明实施例中，所有细胞培养在DMEM或1640培养液中，内含10％(v/v)胎牛血清，100单位/ml，100μg/ml氨苄青霉素。细胞培养环境为37摄氏度，5％(v/v)二氧化碳。

实施例1：维生素D受体的配体结构式如下所示：

上述化合物(vitamin D₃(VD₃)，25(OH)D₃，1α,25(OH)₂D₃)作为维生素D受体的激活剂。该化合物可以从Selleck公司购买获得。

实施例2：CD8T和CD4T细胞分离和培养

CD8T和CD4T细胞来源于外周血单核细胞(PBMCs)，而PBMCs来源于健康人外周血。将1×10⁷个PBMCs细胞每50μL(按照说明书即每50μL的分选磁珠液体，加入1×10⁷个PBMCs即可)的分选磁珠CD8以及CD4(磁珠均购于BD公司)，4℃冰箱孵育25min。加入950μL的PBS重悬于流式管中，放进磁力架5min，去除上清，重复此步骤2次。计数铺板，将分选到的CD8T或者CD4T细胞加入到提前预包板(αCD3,5μg/mL,Biolegend)的48孔中，补加1μg/mL(终浓度)的αCD28(Biolegend)刺激48h，两天后加入rhIL-2(终浓度40ng/mL)至细胞可用(流式细胞仪检测γδT/CD3>90％)。

实施例3：重组维生素D受体基因克隆

(1)过表达VDR基因

维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)基因从CD8 T细胞(实施例2获得)中克隆。提取CD8 T细胞中的RNA(Trizol)，经反转录(Takara)得到cDNA文库，设计引物克隆VDR全长片段(上游引物序列为：5’-ATGGAGGCAATGGCGGC-3’，下游引物序列为：5’-TCAGGAGATCTCATTGCCAAACA-3’)，用XbaI和EcoRI(NEB)双酶切，将其克隆到质粒pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-copGFP-F2A-PuroR(TranSheepBio)上，获得质粒pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-copGFP-F2A-PuroR-VDR，再将其转化到大肠杆菌DH5α(Takara)中，经华大基因测序，NCBI数据库比对，所克隆出的基因确是维生素D受体基因，序列如下(SEQ ID NO.1)：

atggaggcaatggcggccagcacttccctgcctgaccctggagactttgaccggaacgtgccccggatctgtggggtgtgtggagaccgagccactggctttcacttcaatgctatgacctgtgaaggctgcaaaggcttcttcaggcgaagcatgaagcggaaggcactattcacctgccccttcaacggggactgccgcatcaccaaggacaaccgacgccactgccaggcctgccggctcaaacgctgtgtggacatcggcatgatgaaggagttcattctgacagatgaggaagtgcagaggaagcgggagatgatcctgaagcggaaggaggaggaggccttgaaggacagtctgcggcccaagctgtctgaggagcagcagcgcatcattgccatactgctggacgcccaccataagacctacgaccccacctactccgacttctgccagttccggcctccagttcgtgtgaatgatggtggagggagccatccttccaggcccaactccagacacactcccagcttctctggggactcctcctcctcctgctcagatcactgtatcacctcttcagacatgatggactcgtccagcttctccaatctggatctgagtgaagaagattcagatgacccttctgtgaccctagagctgtcccagctctccatgctgccccacctggctgacctggtcagttacagcatccaaaaggtcattggctttgctaagatgataccaggattcagagacctcacctctgaggaccagatcgtactgctgaagtcaagtgccattgaggtcatcatgttgcgctccaatgagtccttcaccatggacgacatgtcctggacctgtggcaaccaagactacaagtaccgcgtcagtgacgtgaccaaagccggacacagcctggagctgattgagcccctcatcaagttccaggtgggactgaagaagctgaacttgcatgaggaggagcatgtcctgctcatggccatctgcatcgtctccccagatcgtcctggggtgcaggacgccgcgctgattgaggccatccaggaccgcctgtccaacacactgcagacgtacatccgctgccgccacccgcccccgggcagccacctgctctatgccaagatgatccagaagctagccgacctgcgcagcctcaatgaggagcactccaagcagtaccgctgcctctccttccagcctgagtgcagcatgaagctaacgccccttgtgctcgaagtgtttggcaatgagatctcctga。

(2)敲除VDR基因

构建VDR敲除序列(序列为:Oligo 1:5’-CACCGGATGCGGCAGTCCCCGTTGA-3’，Oligo2:5’-AAACTCAACGGGGACTGCCGCATCC-3’)，将lentiCRISPRv2(购于addgene)进行酶切(BsmBI，购于NEB，37℃酶切30min)，然后将Oligo1与Oligo 2退火连接(T4 LigationBuffer购于NEB，退火条件：37℃30min，从95℃以5℃每分钟降到25℃)，将退火连接后的序列与酶切的lentiCRISPRv2进行连接(2×Quick Ligase Buffer购于NEB)，连接后的载体(lentiCRISPRv2-Cas9-VDR)转入Stbl3感受态细胞(Takara)，大提质粒后，部分质粒送到华大基因测序，保证敲除序列连接成功。

实施例4：慢病毒包装

对实施例3中构建的基因进行慢病毒包装：铺板293T(ATCC)细胞用于转染，观察细胞密度，达到70～80％的汇合率即可进行转染。做脂转复合体系：转染每皿10cm体系如下：pSPAX2(10μg，addgene),PMD2G(5μg,addgene),pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-copGFPF2A-PuroR-VDR(目的，10μg)，pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-copGFP-F2A-PuroR(对照，10μg，购于TranSheepBio)，或者lentiCRISPRv2-Cas9-VDR(目的，10μg)，lentiCRISPRv2-Cas9-NC(对照，10μg，购于addgene),Lipofectamine 3000(70μL,Thermo Fisher)。转染后12h后更换10％胎牛血清完全培养基，48h和72h后分别两次收集病毒液上清。合并收集的病毒液上清离心(2000rpm/min,4℃,10min)以去除细胞碎片。上清液加入病毒浓缩液(体积比4:1)(Clontech,购于Takara)，4冰箱过夜。再次离心(4℃,4000rpm/min,20min)，将浓缩的病毒沉淀用无菌PBS(0.01M磷酸缓冲液，pH 7.2～7.4)重悬，分装保存在-80℃冰箱以备用。

实施例5:γδT细胞的扩增和培养

外周血单核细胞(PBMCs)来源于健康人外周血。用ficoll(GE health)梯度离心分离(600g,25min,升6降2)。第0天3.0×10⁶个细胞/孔铺板，Zol(唑来膦酸，Sigma)20～50μM/孔，本次实施方法使用浓度为50μM，重组人白细胞介素2(rhIL-2，40ng/ml)。三天后换液只加补rhIL-2(10ng/ml)至细胞纯度γδT/CD3>90％(流式细胞仪检测)为止，获得γδT细胞(Vδ2 T)。

实施例6

对实施例5中的γδT细胞(Vδ2 T)每隔两天加入VD₃，25(OH)D₃，1α,25(OH)₂D₃(0,50,150,450nM)，总计两次。γδT细胞PD-1(程序性死亡受体1),Tim-3(T细胞免疫球蛋白-3),TIGIT(T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白)的表面水平用流式细胞仪检测(BDVERSE)。

结果如图1，说明化合物VD₃，25(OH)D₃，1α,25(OH)₂D₃均可以有效下调免疫细胞PD-1,Tim-3,TIGIT的表达。

实施例7

用实施例4中制备的慢病毒液分别对实施例5和2中得到的γδT细胞(Vδ2T)和CD8T细胞进行感染。γδT细胞和CD8 T细胞按5.0×10⁴个/50μL病毒液(病毒液按病毒感染T细胞的复感染指数(MOI)等于100～200加入)进行离心感染(30℃，500g，90min)。24h后再换液(换液即补加含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，购于Invitrogen)，同时补加rhIL-2(40ng/mL)。感染后的T细胞在96h后用1α,25(OH)₂D₃(50nM)刺激两次，细胞表面水平的PD-1,Tim-3,TIGIT，用流式细胞仪检测。敲除VDR受体和过表达VDR受体后再通过其配体1α,25(OH)₂D₃的两次刺激。部分结果分别如图2和图3(图中均为CD8 T细胞的实验结果)。

实施例8

用实施例5获得的γδT细胞及实施例2获得的CD8T和CD4T细胞。在Ketoconazole(酮康唑；0,1μg/mL，5μg/mL)的处理下分别补加25(OH)D₃(500nM；25D₃)及1,α(OH)₂₅D₃(500nM；1.25D₃)培养三天，提取蛋白进行蛋白凝胶电泳。

部分结果如图4所示，图4对应的是γδT细胞的实验结果，在25(OH)D₃(500nM)和Ketoconazole(1μg/mL)作用下有效抑制维生素D受体的表达。

实施例9：

参考实施例2,5,8，用αCD3/CD28(αCD3,5μg/mL；αCD28，1μg/mL)刺激γδT细胞(Vδ2T)4h后，用细胞固定/通透液试剂盒(BD Cytofix/Cytoperm)固定打孔，胞内染色，胞内因子(TNF-α，IFN-γ)的表达通过流式细胞仪检测。

结果如图5所示，结果显示的维生素D受体水平下降导致Vδ2 T细胞的细胞因子分泌不足。

实施例10：

参考实施例7，用实施例4中的慢病毒液(转染有质粒pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-copGFP-F2A-PuroR-VDR及pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-copGFP-F2A-PuroR)对实施例5和2中得到的γδT细胞和CD8 T细胞进行感染。然后将成功感染进维生素D受体的T细胞通过αCD3/CD28(αCD3,5μg/mL；αCD28，1μg/mL)刺激4h后，用细胞固定/通透液试剂盒(BD Cytofix/Cytoperm)固定打孔，胞内因子TNF-α和IFN-γ通过流式细胞仪检测。

部分结果如图6所示，图6对应的是γδT细胞的实验结果，维生素D受体在TCR(αCD3/CD28)的激活下能有效的促进细胞因子的分泌。

实施例11：

参考实施例5和6，重度免疫缺陷小鼠(NOD/scid,维通利华)(共24只，每组6只)皮下种植弥漫性大B淋巴瘤(1.0×10⁶/只，ABC-U2932)七天后，(参考实施例5进行免疫治疗，具体过程为：

γδT细胞的扩增和培养：外周血单核细胞(PBMCs)来源于健康人外周血。用ficoll(GE health)梯度离心分离(600g,25min,升6降2)。第0天3.0×10⁶个细胞/孔铺板，Zol(唑来膦酸，Sigma)20～50μM/孔，本次实施方法使用浓度为50μM，重组人白细胞介素2(rhIL-2，40ng/ml)。三天后换液只加补rhIL-2(10ng/ml)或者rhIL-2(10ng/ml)+1α,25(OH)₂D₃(50nmol/L)至细胞纯度γδT/CD3>90％。

小鼠随机分为四组：PBS组，IL-2培养的γδT细胞组(IL-2-γδT)，IL-2+1α,25(OH)₂D₃培养的γδT细胞组(IL-2+1α,25(OH)₂D₃-γδT)，和依鲁替尼(Ibrutinib)组；其中，IL-2培养的Vδ2 T细胞和IL-2+1α,25(OH)₂D₃培养的Vδ2 T细胞分别以1.0*10^⁷/200μL进行尾静脉回输到免疫缺陷鼠中，每隔7天回输一次，总计4次；对照组回输等体积的PBS缓冲液；依鲁替尼的注射剂量为25mg/kg(小鼠体重)，每两天尾静脉回输一次，总计10次，每三天记录小鼠肿瘤体积(长和宽)一次，计算公式：V(mm^³)＝(L×W^²)/2(L＝长(mm),W＝宽(mm))。如图7所示，经过1α,25(OH)₂D₃激活的T细胞显示了优越的抗肿瘤效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 维生素D受体及其配体在提高免疫细胞抗肿瘤能力中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 维生素D受体

<400> 1

atggaggcaa tggcggccag cacttccctg cctgaccctg gagactttga ccggaacgtg 60

ccccggatct gtggggtgtg tggagaccga gccactggct ttcacttcaa tgctatgacc 120

tgtgaaggct gcaaaggctt cttcaggcga agcatgaagc ggaaggcact attcacctgc 180

cccttcaacg gggactgccg catcaccaag gacaaccgac gccactgcca ggcctgccgg 240

ctcaaacgct gtgtggacat cggcatgatg aaggagttca ttctgacaga tgaggaagtg 300

cagaggaagc gggagatgat cctgaagcgg aaggaggagg aggccttgaa ggacagtctg 360

cggcccaagc tgtctgagga gcagcagcgc atcattgcca tactgctgga cgcccaccat 420

aagacctacg accccaccta ctccgacttc tgccagttcc ggcctccagt tcgtgtgaat 480

gatggtggag ggagccatcc ttccaggccc aactccagac acactcccag cttctctggg 540

gactcctcct cctcctgctc agatcactgt atcacctctt cagacatgat ggactcgtcc 600

agcttctcca atctggatct gagtgaagaa gattcagatg acccttctgt gaccctagag 660

ctgtcccagc tctccatgct gccccacctg gctgacctgg tcagttacag catccaaaag 720

gtcattggct ttgctaagat gataccagga ttcagagacc tcacctctga ggaccagatc 780

gtactgctga agtcaagtgc cattgaggtc atcatgttgc gctccaatga gtccttcacc 840

atggacgaca tgtcctggac ctgtggcaac caagactaca agtaccgcgt cagtgacgtg 900

accaaagccg gacacagcct ggagctgatt gagcccctca tcaagttcca ggtgggactg 960

aagaagctga acttgcatga ggaggagcat gtcctgctca tggccatctg catcgtctcc 1020

ccagatcgtc ctggggtgca ggacgccgcg ctgattgagg ccatccagga ccgcctgtcc 1080

aacacactgc agacgtacat ccgctgccgc cacccgcccc cgggcagcca cctgctctat 1140

gccaagatga tccagaagct agccgacctg cgcagcctca atgaggagca ctccaagcag 1200

taccgctgcc tctccttcca gcctgagtgc agcatgaagc taacgcccct tgtgctcgaa 1260

gtgtttggca atgagatctc ctga 1284

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上游引物

<400> 2

atggaggcaa tggcggc 17

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 下游引物

<400> 3

tcaggagatc tcattgccaa aca 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Oligo 1

<400> 4

caccggatgc ggcagtcccc gttga 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Oligo 2

<400> 5

aaactcaacg gggactgccg catcc 25

维生素D受体及其配体在提高免疫细胞抗肿瘤能力中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。