Gal4温敏型突变体、重组表达载体、温度调控系统及其应用

IPC分类号 : C07K14/395,C12N1/19,C12N15/31,C12N15/81,C12P23/00,C12P5/02,C12R1/865

申请号

CN201711403958.5

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专利摘要

本发明提供Gal4温敏型突变体，及利用其该突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统及其应用。利用Gal4温敏型突变体构建的温度调控操作简单，无需添加诱导剂/抑制剂，实现对代谢流的精细调控。有利于其它对细胞毒性大的物质的生产。

权利要求

1.Gal4温敏型突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列选自以下序列：

序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的Gal4温敏型突变体，其特征在于，编码Gal4温敏型突变体的核苷酸序列选自下列序列：

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

3.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的核苷酸序列。

4.基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求3所述的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。

5.利用如权利要求1所述的Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统的方法，其特征在于，首先敲除酿酒酵母染色体上GAL80基因，使GAL系统不再受半乳糖控制，进一步用HIS3标签敲除GAL4基因；然后将权利要求3所述的重组表达载体整合到酵母染色体中，构建温度敏感的GAL系统。

6.Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建的温度调控系统，其特征在于，所述系统采用权利要求5的方法构建。

7.如权利要求6所述的Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建的温度调控系统在类胡萝卜素合成中的应用。

8.根据权利要求7所述的Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建的温度调控系统在类胡萝卜素合成中的应用，其特征在于，将类胡萝卜素合成途径中的基因置于GAL1-GAL10启动子后，构建产类胡萝卜素的酿酒酵母工程菌株，实现产类胡萝卜素的工程菌株的生长阶段和产物合成阶段的分阶段调控。

9.根据权利要求8所述的Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建的温度调控系统在类胡萝卜素合成中的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素为虾青素或番茄红素。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种定向进化改造酵母转录激活蛋白Gal4，以及利用改造后的Gal4突变蛋白构建温度调控的表达系统及其应用。

背景技术

随着代谢工程和合成生物学的发展，通过在酿酒酵母中表达异源基因来生产一些化学品变得越来越热门。但途径中的蛋白酶过表达以及外源代谢途径的中间产物积累，常常对宿主细胞造成毒害作用从而影响细胞生长。因此开发精确调控外源基因的表达至关重要。

目前半乳糖调节网络是酿酒酵母中被用于基因表达的一个常用有效的系统，在这个系统中Gal4能识别GAL基因启动子的上游激活序列(UASg),激活上述基因的转录。另外这个系统中GAL4的转录受到外界碳源的紧密调节，酵母细胞在没有半乳糖的培养环境中生长时，Gal80可以和Gal4特异性结合，阻止Gal4蛋白与GAL基因启动子区的结合，从而抑制GAL基因的表达。但是由于该诱导剂在发酵过程中会被消耗，需要不时补加，且价格比较昂贵，因此这种策略在大规模发酵中并不经济。有研究通过敲除GAL80，使GAL4的转录仅受到高葡萄糖抑制，低葡萄糖诱导。并成功地利用该系统在酿酒酵母中构建了可控的类异戊二烯高效合成途径。但是，利用葡萄糖进行长途径的表达调控在实际操作中并不严谨，常常会出现泄漏表达。而且在高密度发酵中工艺复杂，基因表达很难实现人为的控制。因此通过蛋白工程手段对Gal4进行进一步的改造，使它变成一种不借助于诱导剂/抑制剂，而是通过感知温度培养因子的变化来实现对代谢途径更加精细的调控，最终使菌体的生长与产物的积累相协调具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是通过定向进化的方法来获得温敏型的Gal4蛋白突变体，以实现在酿酒酵母中构建温度调控系统为目的并将其应用到代谢产品的生产中。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了Gal4温敏型突变体，所述突变体的氨基酸序列选自以下序列：

序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

其中序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列命名Gal4M9，相对于野生型其第69位亮氨酸变成了脯氨酸，第356位丙氨酸变成了苏氨酸；序列表中SEQ ID NO:7的氨基酸序列命名Gal4M61，相对于野生型其第385位缬氨酸变成了天冬氨酸；序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列命名Gal4M63，相对于野生型其第63位精氨酸变成了甘氨酸，第194位天冬酰胺变成了天冬氨酸；序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列命名Gal4M153，相对于野生型其第196位苯丙氨酸变成了亮氨酸，第297位谷氨酸变成了甘氨酸，第361为亮氨酸变成了丝氨酸；序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列命名Gal4M414，相对于野生型其第208位丝氨酸变成了脯氨酸。

进一步，编码Gal4温敏型突变体的核苷酸序列选自下列序列：

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

任何对上述所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸并与上述几个序列在氨基酸水平具有至少70％同源性的序列，且具有温度敏感效果的Gal4，即在30℃活性，低温25℃或者以下活性高的突变体蛋白仍属于本发明的保护范围。

本发明中使用的野生型的GAL4基因来源于酿酒酵母BY4741(ATCC201388)(GenBank：NM_001184062.1)及氨基酸序列的NCBI号为DAA11189.1。采用以番茄红素为颜色指示的高通量筛选方法，实现Gal4定向进化从而获得温敏型突变株。

本发明还提供上述Gal4温敏型突变体的获得方法，具体包括：

首先通过易错PCR技术建立GAL4基因突变体库；

然后利用番茄红素的颜色变化作为指示对GAL4突变库进行筛选：

定向进化的具体方法：将番茄红素合成途径中的基因置于GAL1-10启动子下，使番茄红素的合成量与Gal4转录激活因子密切相关，在敲除酿酒酵母本身GAL4基因后，将无法激活GAL启动子下基因的转录，此时无相关番茄红素合成，当外源表达Gal4时，番茄红素开始合成；

挑出30℃活性降低或者完全尚失，21℃恢复或部分恢复功能的温敏型Gal4蛋白。

本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码上述的氨基酸序列。本发明一个实施例中包含温敏型Gal4M9蛋白的表达载体通过如下方法构建得到：用ACT1启动子SEQ ID NO:11序列替换酿酒酵母整合型载体PUMRI-15中，得到含有ACT1启动子的酿酒酵母整合型表达质粒PUMRI-PACT1,再将本发明中的SEQ ID NO:3序列插入整合型表达质粒PUMRI-PACT1中，得到PUMRI-PACT1-GAL4M9。

本发明还提供基因工程菌，所述基因工程菌由上述重组表达载体转化至宿主微生物中获得。具体的，本发明的基因工程局为酿酒酵母工程菌。

本发明还提供利用上述的Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统的方法，首先敲除酿酒酵母染色体上GAL80基因，使GAL系统不再受半乳糖控制，进一步用HIS3标签敲除GAL4；然后将表达载体PUMRI-PACT1-GAL4M9整合到酵母染色体中，构建温度敏感的GAL系统。

本发明还提供上述构建的Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建的温度调控系统。

进一步，本发明还给出了Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建的温度调控系统在类胡萝卜素合成中的应用。

将类胡萝卜素合成途径中的基因置于GAL1-GAL10启动子后，构建产类胡萝卜素的酿酒酵母工程菌株，实现产类胡萝卜素的工程菌株的生长阶段和产物合成阶段的分阶段调控。

进一步，所述类胡萝卜素为虾青素或番茄红素。

酵母生长达到稳定期前，将其置于30℃下培养，在这个阶段，酵母细胞的生物量增加，而类胡萝卜素合成的相关基因受到抑制不表达；当达到稳定期后，将酵母置于24℃继续培养，相关基因开始表达。为了尽可能地提高虾青素的产量，本项目温度变化的最佳时间点为对数生长中后期。

本发明专利的有益效果包括：

(1)利用番茄红素作为指示剂实现一种简单有效的高通量筛选方法，获得Gal4温敏型突变体，及利用其该突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统及其应用。利用Gal4温敏型突变体构建的温度调控操作简单，无需添加诱导剂/抑制剂，实现对代谢流的精细调控。有利于其它对细胞毒性大的物质的生产。

(2)针对细胞生长和产物积累之间的矛盾，解决长合成途径代谢调控的问题，使细胞生长和产物积累相协调，为其它长代谢途径的调控提供了理论及方法借鉴。

(3)该调控对温度响应敏感，当温度转到低温，外源基因迅速表达。有利于在高密度发酵中的操作。

附图说明

图1为用于GAL4定向进化的策略图；

图2为pUMRI-PACT1-GALM9质粒图谱；

图3为温敏型的番茄红素菌株的产量图；

图4为温度调控系统敏感性的荧光验证图，其中A为30℃培养72h，B为21℃培养72h；

图5为温度调控系统控制类胡萝卜素生产的代谢调控示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述，但本发明的保护范围并不仅限于此

实施例1获得温敏型GAL4定向进化的基本流程

GAL4的定向进化改造流程如图1所示。利用NotI/SalI将酶切p416XWP-PERG9-GAL4，回收载体骨架备用。以ERG9-F2(GAAGAGCAGAAGCGGAAAAC)和GAL4D-R1(TTGTGAAAACTTGTAAGAGC)为引物，p416XW-PERG9-GAL4为模板对GAL4前部分主要功能域进行易错PCR扩增。由于Mn2+可以增加PCR过程的碱基错配率，在利用Taq酶进行易错PCR时，在体系中加入一定量的MnCl2以增加PCR过程中的基因突变率。易错PCR体系为：

NotI/SacI酶切的p416XW-PERG9-GAL4载体骨架与GAL4的易错PCR产物两端各具有约50bp的同源区段，将其共转化到敲除了GAL80和GAL4及过表达了tHMG1、crtE03M、crtYB11M、crtI的宿主菌中，可以建立GAL4的突变体库。当突变体Gal4有活性时，可以激活沉默的番茄红素途径，菌株在平板上曾现红色，当Gal4无活性或者活性低的时候，菌落曾现白色或者浅色。因此利用菌株番茄红素的颜色变化作为指示对GAL4突变库进行筛选。挑出30℃无功能，菌落曾现白色的，然后转至21℃恢复激活功能，颜色加深的菌落即为所需的温敏型的菌落，为了验证进一步验证确认Gal4突变型的温敏性，需要将酵母中的质粒抽提，转化到大肠杆菌中扩增，测序，并重新整合到新的酿酒酵母细胞进行进一步的验证。

实施例2温敏型Gal4突变体的获得

通过实施例1的方法获得了5株温敏型的Gal4突变体。从5株温敏型酵母中进行质粒抽提，转化到大肠杆菌中扩增，测序。突变体的序列分析如下表1：

表1突变图的序列分析表

实施例3包含温敏型GAL4突变体的酿酒酵母表达载体的构建

用PACT1F(TTATCGGATCCTCAAAACCCTTAAAAAC)和PACT1R(CCCGAATTCTGTTAATTCAGTAAATTTTCGATCT)从酿酒酵母BY4741(ATCC201388)基因组中PCR扩增出ACT1启动子，然后用BamHI和EcoRI双酶切，得到的酶切后的片段与同样双酶切的PUMRI-15质粒(Zhou etal.2015)连接做转化构建出PUMRI-PACT1质粒。然后将实施例2这些突变体用NotI和SacI双酶切，得到突变基因与同样NotI和SacI双酶切后的PUMRI-PACT1质粒连接转化，构建出含有温敏型GAL4突变体的酿酒酵母表达载体PUMRI-PACT1-GAL4M9(GAL4M61,GAL4M63,GAL4M153或GAL4M414)。pUMRI-PACT1-GALM9质粒图谱如图2所示。

实施例4产番茄红素温敏型的调控系统构建

首先构建一个HIS3敲GAL4的敲除盒，GAL4-HisF1(GCCTTTTTCTGTTTTATGAGCTACTAGTACACTCTATATTTTT)和GAL4-HisXF1(CTATCCGTAATCATGGTCGGCTACATAAGAACACCTTTGG)从PUG23(GenBank:AF298783.1)扩增出表达HIS3的片段1，用GAL4-CyF(AACCCAGAATCCCCTATACTAA)和GAL4-HISR1(AAAATATAGAGTGTACTAGTAGCTCATAAAACAGAAAAAGGC)从酿酒酵母BY4741基因组中扩增出上游同源臂即为片段2，用GAL4-His-XR1(CCAAAGGTGTTCTTATGTAGCCGACCATGATTACGGATAG)和GAL4-XinF1(AATTGGATCTCCCAAGAGTA)从酿酒酵母BY4741基因组中扩增出下游同源臂即为片段3，将3个片段做重叠延伸PCR得到HIS敲GAL4片段SEQ ID NO:12。将片段转入到酿酒酵母BY4741中敲除GAL4。以pESC-LEU(GenBank:AF063849.1)为模板，以marker-F(ATTTACCGGCGCACTCTCGCCCGAACGACCTCAAAATGTCTGTGCGGTATTTCACACCG)和marker-R(TTTATAACGTTCGCTGCACTGGGGGCCAAGCACAGGGCAAGATTGTACTGAGAGTGCAC)为引物进行PCR,将PCR片段转入上述的菌株,将Leu标记补齐,同时将GAL80敲除。然后将pUMRI-10-LYC01(Xie et al.2015)用SfiI线性化后转化到敲除GAL80和GAL4酿酒酵母BY4741中构建含有有番茄红素沉默途径基因的菌株，然后将实施例3构建的包含温敏型GAL4突变体的表达载体用SfiI酶线性化后整合到上述菌株的染色体上，得到了产番茄红素5株温敏型的菌株，，发现将温度从30度转至21度时，诱导产生的番茄红素产量最好。图3就是5株温敏型的产番茄红素菌的产量图。其中Gal4M9控制的菌株效果最好。

实施例5用荧光表征温敏调控系统

用EGFP-F(GCGGAATTCATGTCTAAAGGTGAAGAATTAT)和EGFP-R1(CCTTAGATCTTTATTTGTACAATTCATCCATACC)以PUG23(GenBank:AF298783.1)为模板PCR扩增出EGFP片段，然后用EcoRI和BglII双酶切与同样用这两个酶酶切的pUMRI-11(GenBank:KM216413)质粒连接做转化，克隆得到pUMRI-11-EGFP。将pUMRI-11-EGFP用SfiI酶线性化，然后通过电转的方式将这个线性化的片段转到实施例4中构建的敲除GAL80和GAL4菌株中，然后再将实施例3构建的PUMRI-PACT1-GAL4M9质粒用SfiI线性化，转到上述酵母中，构建了通过温度控制Gal4M9活性，而Gal4M9控制EGFP表达的调控系统，如图4为温度调控的荧光表征图，在30度培养时，荧光微弱，几乎不表达，而转至21度时，荧光明显很亮。

实施例6温度调控系统在代谢产品生产中应用

如图5为温度调控系统控制类胡萝卜素生产的代谢调控示意图。将虾青素合成途径中的基因置于GAL启动子下，其它构建流程如实施例4所述，用温敏型的GalM9即可构建温度调控的虾青素合成系统，该调控系统不止局限于类胡萝卜素的生产，其它产品途径中的基因置于这个这个调控系统中，也可以构建类似的温度响应的调控，因此也在本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> Gal4温敏型突变体、重组表达载体、温度调控系统及其应用

<130> 2017

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2646

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60

tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120

tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180

ctagaaagac tggaacagct atttccactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240

ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300

aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360

acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420

caaagacagt tgactgtatc gattgactcg gcagctcatc atgataactc cacaattccg 480

ttggatttta tgcccaggga tgctcttcat ggatttgatt ggtctgaaga ggatgacatg 540

tcggatggct tgcccttcct gaaaacggac cccaacaata atgggttctt tggcgacggt 600

tctctcttat gtattcttcg atctattggc tttaaaccgg aaaattacac gaactctaac 660

gttaacaggc tcccgaccat gattacggat agatacacgt tggcttctag atccacaaca 720

tcccgtttac ttcaaagtta tctcaataat tttcacccct actgccctat cgtgcactca 780

ccgacgctaa tgatgttgta taataaccag attgaaatcg cgtcgaagga tcaatggcaa 840

atccttttta actgcatatt agccattgga gcctggtgta tagaggggga atctactgat 900

atagatgttt tttactatca aaatgctaaa tctcatttga cgagcaaggt cttcgagtca 960

ggttccataa ttttggtgac agccctacat cttctgtcgc gatatacaca gtggaggcag 1020

aaaacaaata ctagctataa ttttcacagc ttttccataa gaatgaccat atcattgggc 1080

ttgaataggg acctcccctc gtccttcagt gatagcagca ttctggaaca aagacgccga 1140

atttggtggt ctgtctactc ttgggagatc caattgtccc tgctttatgg tcgatccatc 1200

cagctttctc agaatacaat ctccttccct tcttctgtcg acgatgtgca gcgtaccaca 1260

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aaaatctatg aactagacaa aacagtaact gcagaaaaaa gtcctatatg tgcaaaaaaa 1380

tgcttgatga tttgtaatga gattgaggag gtttcgagac aggcaccaaa gtttttacaa 1440

atggatattt ccaccaccgc tctaaccaat ttgttgaagg aacacccttg gctatccttt 1500

acaagattcg aactgaagtg gaaacagttg tctcttatca tttatgtatt aagagatttt 1560

ttcactaatt ttacccagaa aaagtcacaa ctagaacagg atcaaaatga tcatcaaagt 1620

tatgaagtta aacgatgctc catcatgtta agcgatgcag cacaaagaac tgttatgtct 1680

gtaagtagct atatggacaa tcataatgtc accccatatt ttgcctggaa ttgttcttat 1740

tacttgttca atgcagtcct agtacccata aagactctac tctcaaactc aaaatcgaat 1800

gctgagaata acgagaccgc acaattatta caacaaatta acactgttct gatgctatta 1860

aaaaaactgg ccacttttaa aatccagact tgtgaaaaat acattcaagt actggaagag 1920

gtatgtgcgc cgtttctgtt atcacagtgt gcaatcccat taccgcatat cagttataac 1980

aatagtaatg gtagcgccat taaaaatatt gtcggttctg caactatcgc ccaataccct 2040

actcttccgg aggaaaatgt caacaatatc agtgttaaat atgtttctcc tggctcagta 2100

gggccttcac ctgtgccatt gaaatcagga gcaagtttca gtgatctagt caagctgtta 2160

tctaaccgtc caccctctcg taactctcca gtgacaatac caagaagcac accttcgcat 2220

cgctcagtca cgccttttct agggcaacag caacagctgc aatcattagt gccactgacc 2280

ccgtctgctt tgtttggtgg cgccaatttt aatcaaagtg ggaatattgc tgatagctca 2340

ttgtccttca ctttcactaa cagtagcaac ggtccgaacc tcataacaac tcaaacaaat 2400

tctcaagcgc tttcacaacc aattgcctcc tctaacgttc atgataactt catgaataat 2460

gaaatcacgg ctagtaaaat tgatgatggt aataattcaa aaccactgtc acctggttgg 2520

acggaccaaa ctgcgtataa cgcgtttgga atcactacag ggatgtttaa taccactaca 2580

atggatgatg tatataacta tctattcgat gatgaagata ccccaccaaa cccaaaaaaa 2640

gagtaa 2646

<210> 2