专利摘要
本发明公开了一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的制备方法，包括：外消旋异丁基丁二腈(IBSN)在反应介质中，腈水解酶和酰胺酶催化下，20～50℃温度下，反应4～10h，得到(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸。该方法反应条件温和、操作简单、易行，区域和立体选择性好，由外消旋底物IBSN一锅法合成普瑞巴林关键手性中间体(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸的转化率可达49.5％，e.e.为99.5％，接近理论转化率50％，同时光学纯度超过99％，对简化普瑞巴林的生产工艺步骤，降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。
权利要求
1.一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，包括：
外消旋异丁基丁二腈在反应介质中，腈水解酶和酰胺酶催化下，20～50℃温度下，反应4～10h，得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸；
所述的腈水解酶为芜菁腈水解酶BrNIT、BrNIT2、拟南芥腈水解酶AtNIT或高山南芥腈水解酶AaNIT；
所述的酰胺酶为Pa-Ami或Dt-Ami。
2.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述外消旋异丁基丁二腈的浓度为10～150g/L。
3.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供，所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供；所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1～12:1。
4.根据权利要求3所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05～0.15:1。
5.根据权利要求3所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法，包括：
(1)设计含酶切位点XhoI和XbaI的腈水解酶基因序列，克隆至空载体pET28b，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到腈水解酶基因工程菌；或，
设计含有EcoRI和NcoI位点的酰胺酶基因序列，克隆至空载体pET28b，构建表达载体，热击转化到大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到酰胺酶基因工程菌；
(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养6～8h后，得菌体种子液；
将上述菌体种子液以2％的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养至菌体OD
所述卡那霉素的浓度为30～60mg/L；
所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05～0.2mM。
6.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的反应介质由纯水或缓冲体系组成。
7.根据权利要求6所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的缓冲体系为磷酸钠缓冲液体系、Tris-HCl缓冲液体系或Gly-NaOH缓冲液体系，所述缓冲液体系的pH范围为6.0～11.0。
说明书
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体地，本发明涉及一种腈水解酶、酰胺酶两步酶法区域、立体选择性生物催化外消旋3-氰基-5-甲基己腈(IBSN)合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。
背景技术
普瑞巴林(Pregabalin)，化学名(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸(I)，是一种新型的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)受体激动剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质释放，具有良好的抗焦虑和神经病理性疼痛治疗效果(Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47:3500-3504)。
与传统药物相比，普瑞巴林具有服用剂量低、次数少、毒副作用小、持续时间长、耐受性强等优点，被认为是最有希望的抗癫痫治疗药物之一(Expert.Opin.Inv.Drug.,2003,12:663-672)。自上市以来，普瑞巴林的全球销售额快速增长，已跻身全球畅销处方药行列，市场前景十分广阔。
作为手性药物，普瑞巴林合成的关键是构建手性源。生物催化法具有反应条件温和、过程高效、环境友好以及高度化学、区域和立体选择性等优点成为最受瞩目的手性合成技术之一。其中，腈水解酶区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸路线具有原料廉价、原子经济性高等显著优势(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2006,41:75-80)。
然而，腈水解酶生物催化过程中一个挑战性的问题是副产物多，产物纯化过程繁琐，收率和光学纯度难以兼得，如专利CN1942587B利用NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥腈水解酶催化异丁基丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度分别对应为：产率34.2％、光学纯度96.3％e.e.；产率38.6％、光学纯度91.1％e.e.；产率35.5％、光学纯度95.5％e.e.和产率17.5％、光学纯度98.5％e.e.。(e.e.意指“对映异构体过量”)；为同时提高(S)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度，采用NIT-102C2在氮气氛下，50个间隙反应循环累积制备产物的产率最高才提至43.2％，光学纯度提至99.0％e.e.。
专利CN103114054B提供了一种利用节杆菌ZJB-09277立体选择性水解制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法：以外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯为底物，以节杆菌ZJB-09277发酵培养获得的湿菌体或含湿菌体的菌悬液为催化剂，于pH 6.5～8.0的缓冲液构成的转化反应体系中，25～50℃下反应得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸，产物的产率及光学纯度与底物酯的种类息息相关，当底物为3-氰基-5-甲基己酸丙酯时转化率高达49.9％，但光学纯度只有86.7％e.e.；当底物为3-氰基-5-甲基己酸乙酯时光学纯度达91.2％，但转化率只有31.8％。
因此，开发能够同步提高普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率和纯度，易于工业化的工艺路线，成为降低普瑞巴林生产成本的关键，对抗癫痫治疗医学发展具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种区域、立体选择性生物催化外消旋异丁基丁二腈(IBSN)合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。该方法反应条件温和、操作简单、易行，区域和立体选择性高，合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的转化率接近理论转化率，同时光学纯度超过99.0％，对合成高光学纯度普瑞巴林、降低普瑞巴林生产成本具有重要意义。
本发明发现某些特定腈水解酶的腈水解活性和腈水合活性与底物IBSN的β位强电负性氰基取代基具有协同作用，能够将IBSN转化成高光学纯度的(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺(II)和(S)-3-氰基-5-甲基己酸(III)，催化过程具有高度的立体和区域选择性。
基于上述发现，本发明提供一种普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的合成新方法：将酰胺酶与腈水解酶进行耦联并严格调控其配比，同步消除化合物II的积累，实现一步法完成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的区域、立体选择性合成，有效提高普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率和光学纯度，同时还减少了后续产物的分离纯化步骤，极大的简化了普瑞巴林的生产工艺步骤，对降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。
一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，包括：
外消旋异丁基丁二腈(IBSN)在反应介质中，腈水解酶和酰胺酶催化下，20～50℃温度下，反应4～10h，得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。
本发明所涉及腈水解酶的来源包括，但不限于十字花科植物芜菁(Brassicarapa)腈水解酶BrNIT(ABM55734.1)、BrNIT2(BAG72074)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶AtNIT(NP 851011)和高山南芥(Arabis alpine)腈水解酶AaNIT(KFK44999)，对所述腈水解酶的其它氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
实验结果显示：腈水解酶对异丁基丁二腈(IBSN)的催化能力：BrNIT>AaNIT>BrNIT2>AtNIT；腈水解酶催化IBSN反应过程中的产物组成进行分析，结果显示腈水解酶产酰胺的能力为：BrNIT2>BrNIT>AtNIT>AaNIT；综合考量可知，AaNIT对底物IBSN的立体选择性最高，且酰胺含量在产物中占比最少，因此，腈水解酶优选为AaNIT。
本发明所涉及酰胺酶的来源包括，但不仅限于Pantoea sp.YR343、Comamonascomposti和Deftia tsuruhatensis ZJB-05174的酰胺酶基因Pa-Ami(WP_008109374)、Cc-Ami(WP_027015397)和Dt-Ami(KP943494)，对所述酰胺酶的其它氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
实验结果显示：酰胺酶活力为Pa-Ami>Dt-Ami>Cc-Ami。
本发明涉及一种双酶体系催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法，具体地，所述反应体系中的酶催化剂可为完整微生物细胞、微生物细胞破碎液、部分纯化的酶、纯化酶或固定在载体上的酶催化剂等形式。作为优选，所述催化体系中生物催化剂以完整微生物细胞的形式存在。
进一步优选，所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供，所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供。
所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法，包括：
(1)设计含酶切位点XhoI和XbaI的腈水解酶基因序列，克隆至空载体pET28b，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到腈水解酶基因工程菌；或，
设计含有EcoRI和NcoI位点的酰胺酶基因序列，克隆至空载体pET28b，构建表达载体，热击转化到大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到酰胺酶基因工程菌；
(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养6～8h后，得菌体种子液；
将上述菌体种子液以2％的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养至菌体OD600为0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，25～30℃、100～150rpm发酵10～12h，收集发酵液于0～5℃，6000～9000rpm的条件下离心10～15min，生理盐水洗涤菌体后，得到含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞；
所述卡那霉素的浓度为30～60mg/L；
所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05～0.2mM。
本发明中酰胺酶的添加不仅可以消除(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的积累，减少后续的分离步骤，还可以提高产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率。在不积累(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的前提下，优化酰胺酶的添加量，可减少体系中菌体添加量，有利于降低工艺的生产成本；作为优选，所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1～12:1。
所述转化体系中，底物IBSN初始浓度为10～150g/L。
所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05～0.15:1。
作为优选，所述催化体系中的反应温度为30～40℃。
所述反应介质由纯水或缓冲体系组成；所述缓冲体系的pH范围约6.0-11.0，所述的缓冲体系由磷酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液及Gly-NaOH缓冲液组成，作为优选，所述催化体系中的反应介质为Tris-HCl缓冲液，所述缓冲体系的pH为7.5-9.0。在弱碱性环境中，生物催化剂均保持在较高的活性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)现有技术中，底物IBSN的浓度越大，转化越困难，产率越低，本发明可将底物IBSN的初始浓度提至150g/L。
(2)由外消旋底物IBSN合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的转化率可达49.5％，e.e.为99.5％；
(3)实现一步法完成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的区域、立体选择性合成，极大缩减了后续产物的分离纯化步骤，对简化普瑞巴林的生产工艺步骤，降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例4中腈水解酶催化IBSN水解反应液的气相色谱图。
图2为本发明实施例4中腈水解酶AaNIT催化IBSN水解的反应进程图。
图3为本发明实施例6中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的合成路线图。
图4为本发明实施例6中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联一锅法催化IBSN的反应进程图。
图5为本发明实施例7中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联一锅法催化IBSN的气相色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》。
实施例1构建重组腈水解酶工程菌
根据NCBI中报道的芜菁(Brassica rapa)腈水解酶BrNIT(ABM55734.1)、BrNIT2(BAG72074)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶AtNIT(NP 851011)和高山南芥(Arabis alpine)腈水解酶AaNIT(KFK44999)全合成该基因序列，两端设计酶切位点XhoI和XbaI，克隆至空载体pET28b，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌BL21(DE3)，培养检测阳性菌，得到重组腈水解酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT、BL21(DE3)/pET28b-BrNIT2、BL21(DE3)/pET28b-AtNIT和BL21(DE3)/pET28b-AaNIT。
实施例2构建重组酰胺酶工程菌
根据已报道的来源于Pantoea sp.YR343、Comamonas composti和D.tsuruhatensis ZJB-05174的酰胺酶基因Pa-Ami(WP_008109374)、Cc-Ami(WP_027015397)和Dt-Ami(KP943494)，对其基因序列进行全合成。设计含有EcoRI和NcoI位点的上下游引物，扩增基因后插入pET28b中，构建表达载体，热击转化到BL21(DE3)感受态细胞中，得到酰胺酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami、BL21(DE3)/pET28b-Cc-Ami和BL21(DE3)/pET28b-Dt-Ami。
实施例3基因工程菌的表达培养
挑取单菌落接入5mL液体LB培养基中，卡那霉素终浓度为50mg/L。培养条件为37℃，200rpm，培养6-8h。将上述种子液以2％的体积比转接至新鲜的含有终浓度为50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至菌体OD600约为0.6-0.8时，向上述LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，终浓度为0.1mM)，28℃、150rpm诱导培养10-12h，收集发酵液于4℃，8000rpm的条件下离心10min，然后加入生理盐水洗涤菌体一次，将离心所得菌体置于-20℃冰箱保存，应用于以下实施例中。
实施例4重组腈水解酶催化IBSN及产物组成分析
(a)重组腈水解酶的活力及立体选择性
对实施例3中培养得到的重组腈水解酶基因工程菌进行活力和立体选择性测定，具体内容如下：
含腈水解酶重组大肠杆菌活力检测反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH8.0)，外消旋异丁基丁二腈30g/L，湿菌体10g/L；反应液于30℃、200rpm条件下反应4h，取样500μL，加入200μL 2M HCl终止反应。
结果显示腈水解酶对异丁基丁二腈(IBSN)的催化能力：BrNIT>AaNIT>BrNIT2>AtNIT，具体数据如表1所示：
表1重组腈水解酶催化IBSN水解结果
注：E意指“对映体选择率，enantiomeric ratio”，是表征酶立体选择性的参数。
(b)重组腈水解酶催化IBSN反应过程中产物组成分析
对重组腈水解酶催化IBSN反应产物进行气相色谱分析，结果显示除底物、产物峰外有另一色谱峰存在，如图1所示。为了确定该物质结构，对该物质进行了分离、纯化。具体步骤如下：收集反应液置于沸水中加热20min，利用减压抽滤去除截留的杂蛋白及部分底物。再加入2倍体积乙酸乙酯进行萃取，去除反应液中的底物(该步骤重复两次以确保底物有效去除)，收集下层水相并利用NaOH调pH至12.0，再次加入2倍体积乙酸乙酯萃取。收集上层有机相，旋蒸后得到浅黄色油状化合物，经结构鉴定为(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺。
NMR表征结果：
质谱表征结果：MS(ESI):m/z 155.1[M+H]
参照上述步骤(a)，对重组腈水解酶催化IBSN反应过程中的产物组成进行分析，结果显示腈水解酶产酰胺的能力为：BrNIT2>BrNIT>AtNIT>AaNIT，具体数据如表2所示。
表2重组腈水解酶催化IBSN反应过程产物组成
(c)重组腈水解酶催化IBSN的反应进程
据表1和表2数据结果显示，AaNIT对底物IBSN的立体选择性最高，且酰胺含量在产物中占比最少，因此对其催化IBSN的反应进程进行研究。将0.25g的含有腈水解酶的湿菌体BL21(DE3)/pET28b-AaNIT加入到10mL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8.0)中，并加入底物IBSN 0.5g。于30℃、200rpm条件下反应，每隔0.5h取样，对反应进程进行检测，反应进程如图2所示。8h后，底物IBSN转化为产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸(记为(S)-CMHA)的转化率为49.5％，e.e.为99.5％，(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺(记为(S)-CMHM，相对于目标产物，可视为副产物)含量为0.7g/L。
产物3-氰基-5-甲基己酸含量的测定：利用液相色谱(岛津LC-16)外标法测定转化液中(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的含量。色谱柱为 C-18Column(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为缓冲液(0.58g/L磷酸氢二铵，1.83g/L高氯酸钠，高氯酸调节pH为1.8)：乙腈＝60:40(v/v)，流速为1mL/min，紫外检测波长225nm，柱温30℃。
底物外消旋异丁基丁二腈、产物3-氰基-5-甲基己酸和3-氰基-5-甲基己酰胺的对映体过量值由气相色谱测定。气相色谱型号为7890N(安捷伦)，毛细管柱型号为BGB-174(BGB Analytik Switzerland)。色谱条件为：进样量1.0μL，进样口、检测器温度均为250℃，柱温为170℃保持10min，10℃/min升温至200℃，保持5min。载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min，分流比为50:1。
对映体过量值(e.e.)、转化率(c)的计算参考Rakels等的计算方法(EnzymeMicrob.Technol.,1993,15:1051)。
实施例5重组酰胺酶催化(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺水解
(a)重组酰胺酶活力的测定
对实施例3中培养得到的重组酰胺酶基因工程菌进行活力的检测，具体步骤如下所示。
含酰胺酶重组大肠杆菌活力检测反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH8.0)，(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺30g/L，湿菌体10g/L。反应液于30℃、200rpm条件下反应30min。取样500μL，加入200μL 2M HCl终止反应后，参照实施例4中的液相色谱法对转化液中的(S)-3-氰基-5-甲基己酸含量进行测定。结果如表3所示。
表3重组酰胺酶催化(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺水解
(b)酰胺酶添加量的优化
转化体系组成及操作如下：在20mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)中加入2g的外消旋异丁基丁二腈(IBSN)及1g的湿菌体细胞，菌体细胞为含腈水解酶BrNIT与含酰胺酶Pa-Ami的细胞混合体，且两者之间的质量比分别设为1:1、3:1、5:1、7:1、9:1、12:1及15:1)，于30℃、200rpm条件下反应，反应3h后取样进行检测，检测方法参照实施例4。结果显示，在比值达到12:1、9:1、7:1及更小比值时，副产物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺无积累。比值为15:1和不添加酰胺酶时，副产物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺无法完全被水解，且随着酰胺酶用量的减少，积累量逐渐增加。
实施例6双酶耦联一锅法催化IBSN合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸
重组基因工程菌一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
合成路线图如图3所示，将100mL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8.0)加入到250mL的三口烧瓶中，同时加入底物IBSN 8g、含腈水解酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT和含酰胺酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami共6g(wcw，二者质量比为5:1)。加入完毕后，混匀并于30℃水浴反应4.5h，转化率达到49.0％，e.e.为99.2％，反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的积累(图4)。
实施例7重组基因工程菌一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
分别称取5g实施例3中获得的重组腈水解酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT和0.6g重组酰胺酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-Dt-Ami的湿菌体，投入到含有100g/LIBSN的100mL Tris-HCl缓冲液中(50mM，pH＝8.0)，混匀并于30℃水浴反应8h，转化率达到47.5％，e.e.为99.1％，反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的生成(图5)。
实施例8双酶耦联一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
将10mL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8.0)加入到50mL的具塞反应瓶中，同时加入底物IBSN 1.2g、含腈水解酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT2和含酰胺酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami共0.6g(wcw，二者质量比为9:1)。加入完毕后，混匀并于30℃水浴反应10h，转化率达到49.1％，e.e.为98.7％，反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的生成。
需要指出的是，上述实验实例仅为说明本发明的构思及特点，其目的是让熟悉本发明的人了解本实验并据以实施，并不能限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质做出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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